螺內酯對心肌肥厚大鼠心肌組織中可溶性ST2表達的影響

邢瑞星，趙玉蘭，黃亞萍，董　靜

鄭州大學第二附屬醫院心內科 鄭州 450014

螺內酯對心肌肥厚大鼠心肌組織中可溶性ST2表達的影響

邢瑞星，趙玉蘭#，黃亞萍，董靜

鄭州大學第二附屬醫院心內科 鄭州 450014

關鍵詞螺內酯；心肌肥厚；可溶性ST2；大鼠

摘要目的：研究螺內酯對心肌肥厚大鼠IL-33/ST2通路中可溶性ST2(sST2)的影響。方法：選取健康雄性SD大鼠30只，隨機分為對照組(n=10)、模型組(n=10)、藥物干預組(n=10)。對照組皮下注射生理鹽水，模型組皮下注射異丙腎上腺素(ISO)，藥物干預組皮下注射ISO+螺內酯20 mg/(kg·d)灌胃，余各組用等量生理鹽水灌胃。14 d后處死大鼠，測量心臟質量指數、左心室質量指數及心肌細胞直徑；免疫組化法及RT-PCR法檢測心肌組織中sST2的表達。結果：模型組與藥物干預組心臟質量指數、左心室質量指數及心肌細胞直徑均高于對照組(P<0.05)；模型組sST2的表達高于對照組和藥物干預組(P<0.05)。結論：螺內酯可能通過調節IL-33/ST2通路中sST2的表達，抑制ISO誘導的心肌肥厚。

心肌肥厚是原發性高血壓最常見的并發癥,其病理變化包括心肌細胞自身的肥大以及間質的纖維化。心肌肥厚可降低冠狀動脈內血流儲備，造成心內膜下心肌缺血，誘發心律失常，同時與心力衰竭、猝死及腦卒中等密切相關。IL-33是IL-1家族新成員，為炎癥性細胞因子。ST2是IL-1受體家族成員，ST2包括跨膜型ST2(transmembrane ST2,ST2L)及可溶性ST2(soluble ST2,sST2)，二者均可作為配體與IL-33結合。IL-33/ST2信號通路主要是一個受生物力學刺激的系統[1]。研究[2]表明醛固酮受體拮抗劑螺內酯可降低心力衰竭及心肌梗死中sST2水平，抑制心肌重構。該研究旨在探討螺內酯是否通過降低sST2水平抑制心肌肥厚，為心功能不全早期干預提供治療方法。

1材料與方法

1.1動物與試劑于河南省實驗動物中心購買30只體重(body mass，BM)240～300 g的健康雄性SD大鼠，動物質量合格證號:SCXK(豫)2010-0002。上海禾豐制藥有限公司生產的鹽酸異丙腎上腺素(ISO)注射液2 mL/mg，批號131102。螺內酯片20 mg/片，浙江亞太藥業股份有限公司提供。瓊脂糖粉(上海生化試劑公司)，RNA抽提試劑盒Reagent(Transgene公司)，一抗為兔抗大鼠GATA4多克隆抗體，PCR引物、RT-PCR 試劑盒、DNA Marker由北京全式金生物技術有限公司提供。

1.2大鼠心肌肥厚模型制備及藥物干預30只SD大鼠喂養1周后，按隨機數字表法分為模型組、藥物干預組、對照組(每組10只)。模型組與藥物干預組皮下注射ISO 2.5 mg/(kg·d)；對照組皮下注射生理鹽水，連續給藥14 d。從造模當天起，將螺內酯片20 mg/(kg·d)溶于2 mL生理鹽水中并對藥物干預組大鼠灌胃，模型組及對照組用等體積生理鹽水灌胃，共8周。

1.3大鼠心臟質量參數測定8周后稱量3組大鼠BM。腹腔注射水合氯醛4 ml/kg麻醉，然后開胸取出心臟，剪去周圍結締組織及血管，預冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱全心質量(heart mass，HM)，再沿冠狀溝剪去左心房，并沿室間溝剪掉右室游離壁，稱左心室質量(left ventricular mass，LVM)，計算心臟質量指數(HM/BM)及左心室質量指數(LVM/BM)。最后將左心室均分為2份，1份放入40 g/L多聚甲醛中固定24 h后石蠟包埋切片，1份放入液氮中冷凍。

1.4大鼠心肌組織病理學觀察取固定好的心肌組織，石蠟包埋，連續切片， HE染色，鏡下觀察。400倍鏡下每張切片選10個視野，每個視野選10個細胞，用Image-plus圖像分析軟件測量心肌細胞直徑，結果取均值。

1.5免疫組化法檢測心肌組織中sST2的表達石蠟切片脫蠟至水，修復抗原，加sST2抗體，根據SP試劑盒說明書進行操作，DAB顯色后用Lecia病理圖像分析系統分析，并在400倍鏡下選擇5個視野測量光密度值，結果取均值。

1.6RT-PCR法檢測心肌組織中sST2 mRNA的表達提取心肌組織總RNA。以GAPDH為內參，上游引物5’-GATCCCGCTAACATCAAAT-3’，下游引物5’-CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3’，擴增產物長度604 bp；sST2上游引物5’-ACGGAGAACGGAACCAAT-3’，下游引物5’-GCAAGCTGAGCAGGCAAT-3’，擴增產物長度156 bp。 PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃總延伸6 min。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后于紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄系統進行分析， sST2 mRNA的相對表達量以sST2條帶和GAPDH條帶光密度比值表示。

1.7統計學處理采用SPSS 20.0進行統計學處理。3組間心肌肥厚參數、sST2蛋白及mRNA相對表達量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.13組大鼠HM/BM和LVM/BM比較見表1。

表1　3組大鼠心肌肥厚參數及心肌細胞直徑比較

#:與對照組比較，P<0.05；*：與模型組比較，P<0.05。

2.23組大鼠心肌組織病理學變化及心肌細胞直徑結果見圖1、表1。

A：對照組;B：模型組;C：藥物干預組。圖1　3組大鼠心肌組織HE染色結果(×400)

2.33組大鼠心肌組織中sST2的表達結果見圖2、3和表2。

A：對照組;B：模型組;C：藥物干預組。圖2　3組大鼠心肌組織中sST2蛋白的表達(SP,×400)

1：對照組；2：模型組；3：藥物干預組。圖3　3組大鼠心肌組織中sST2 mRNA的表達

組別nsST2蛋白sST2mRNA對照組100.03±0.020.15±0.01模型組100.28±0.01#0.50±0.04#藥物干預組100.15±0.01*0.18±0.01*F2106.387655.005P<0.001<0.001

#:與對照組比較，P<0.05；*：與模型組比較，P<0.05。

3討論

心肌肥厚一直被認為是長期過負荷作用下的一種適應性改變，但失代償后可導致擴張性心肌病、心力衰竭和猝死[3-4]。文獻[5]報道，高血壓合并心肌肥厚使急性心肌梗死、充血性心力衰竭、猝死等心血管事件的發生率增加6～8倍。因此高血壓的治療不僅僅是降壓，更重要的是積極逆轉心肌肥厚。 最近的研究[6]表明IL-33/ST2通路在心血管系統中發揮重要調節作用,心肌缺血與機械應力作用下ST2的表達均可上調，而ST2L與IL-33結合后可減輕心肌肥厚及心肌纖維化[7]。而且，現已證明心肌梗死及心力衰竭中sST2的表達均顯著升高[8-11]。螺內酯作為醛固酮受體拮抗劑的代表性藥物，已被證明可以改善心力衰竭患者臨床癥狀及急性心肌梗死患者的生存率[2]。作者通過對IL-33/ST2通路中sST2的研究以了解螺內酯在抑制心肌肥厚方面的作用及可能機制。

腎素-血管緊張素系統中的血管緊張素Ⅱ及交感神經系統中的去甲腎上腺素引起的心肌肥厚主要是通過激活NF-κB,直接引起心肌細胞肥大[12]，醛固酮受體拮抗劑可能是通過細胞外基質代謝產物及炎癥介質，調節IL-33/ST2通路中心肌細胞表達產物，參與下游的心臟保護作用[2]，但是螺內酯降低sST2的機制尚不完全清楚，仍需進一步探究。

該研究結果顯示藥物干預組心臟質量指數、左心室質量指數、心肌細胞直徑、sST2蛋白及mRNA表達量均低于模型組，高于對照組。說明醛固酮受體拮抗劑螺內酯可通過降低sST2表達，增強IL-33/ST2L通路的抗心肌肥厚作用，為逆轉高血壓左室肥厚的藥物干預提供了依據。

參考文獻

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Effects of spironolactone on soluble ST2 in myocardial tissue of hypertrophy rats

XINGRuixing,ZHAOYulan,HUANGYaping,DONGJing

DepartmentofCardiology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

Key wordsspironolactone；myocardial hypertrophy；soluble ST2；rat

AbstractAim: To study the effects of spironolactone on sST2 of IL-33/ST2 pathway in myocardial hypertrophy rats.Methods: A total of 30 healthy male SD rats were randomly allocated into control group(n=10), model group(n=10) and drug intervention group(n=10).LVM/BM,HM/BM and the size of cardiomyocyte were detected.sST2 mRNA and protein in left ventricular tissue were analyzed by RT-PCR and immunohistochemistry.Results: LVM/BM and HM/BM in the drug intervention group and model group were higher than those in control group(P<0.05).The expression of sST2 in the model group was higher than that in the control group and drug intervention group(P<0.05).Conclusion: Spironolactone could modulate the expression of sST2 in IL-33/ST2 pathway, and alleviate myocardial hypertrophy caused by isoproterenol.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.028

#通信作者，女，1956年2月生，本科，主任醫師，研究方向：冠心病、心力衰竭，E-mail:zyl6616@126.com

中圖分類號R54