卵巢上皮性癌組織中IGF-1、E-cad蛋白的表達以及IGF-1對卵巢癌SKOV3細胞E-cad表達和侵襲力的影響

薛景戈，任琛琛，楊　立，劉泇希，白　楊，李　倩，李飛燕

鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052

卵巢上皮性癌組織中IGF-1、E-cad蛋白的表達以及IGF-1對卵巢癌SKOV3細胞E-cad表達和侵襲力的影響

薛景戈，任琛琛#，楊立，劉泇希，白楊，李倩，李飛燕

鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052

關鍵詞卵巢腫瘤；胰島素樣生長因子-1；上皮性鈣黏連蛋白；侵襲；SKOV3細胞

摘要目的：檢測卵巢上皮性癌組織中胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和上皮性鈣黏連蛋白(E-cad)的表達以及IGF-1作用于卵巢癌SKOV3細胞后E-cad蛋白的表達和細胞侵襲力的改變，探討IGF-1在上皮間質轉化中的作用。方法：采用免疫組化SP法檢測30例卵巢上皮性癌、10例卵巢上皮性交界性腫瘤、10例卵巢良性腫瘤及10例正常卵巢組織中IGF-1及E-cad蛋白的表達。以不同質量濃度(0、25、50、100、200 μg/L)的IGF-1刺激SKOV3細胞，應用實時熒光定量PCR法及Western blot法檢測E-cad mRNA和蛋白的表達，Transwell法檢測細胞侵襲力的變化。結果：卵巢上皮性癌、卵巢上皮性交界性腫瘤、卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織中IGF-1的陽性表達率分別為73.3%、30.0%、20.0%和10.0%，E-cad的陽性表達率分別為36.7%、60.0%、70.0%和90.0%；與其他3種組織比較,卵巢上皮性癌組織中IGF-1蛋白的陽性表達率升高，E-cad蛋白的陽性表達率降低(P均<0.05)；卵巢上皮性癌組織中IGF-1和E-cad的表達均與臨床分期、組織學分級、兩級分級系統有關(P均<0.05)，而與年齡、組織學類型無關(P均>0.05)，且在卵巢上皮性癌組織中IGF-1與E-cad蛋白的表達呈負相關(rP=-0.396，P=0.018)。不同質量濃度的IGF-1作用于SKOV3細胞后，E-cad的表達逐漸降低，SKOV3細胞侵襲力增強,且呈劑量依賴性(P<0.05)。結論：IGF-1、E-cad可能與上皮性卵巢癌的上皮間質轉化、侵襲轉移有關。

上皮性卵巢癌是最常見、病死率最高的婦科腫瘤[1-2]，侵襲轉移是卵巢癌患者死亡的主要原因，而上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是卵巢癌侵襲轉移的重要機制之一。E-cadherin(簡稱E-cad)是EMT的一個重要標志，當其表達異常時，細胞間黏附能力下降，促進腫瘤的侵襲和轉移[3]。胰島素生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)調控細胞的增殖、生存及新陳代謝等多種過程[4-5]。有研究[6-8]表明IGF-1在卵巢癌組織中高表達增加卵巢癌的風險，促進卵巢癌的進展和影響卵巢癌的預后；另外IGF-1通過不同信號通路誘導乳腺癌、前列腺癌、胃癌細胞發生EMT[9-11]。該研究應用免疫組化方法檢測不同卵巢組織中IGF-1和E-cad蛋白的表達和定位，繼而以卵巢癌SKOV3細胞作為研究對象，觀察不同質量濃度的IGF-1對SKOV3細胞E-cad蛋白的表達及侵襲力的影響，探討二者在卵巢癌侵襲轉移過程中可能扮演的角色。

1材料與方法

1.1材料選取2008年10月至2011年11月在鄭州大學第三附屬醫院婦產科經手術治療、術后病理明確診斷的石蠟包埋標本50例，其中卵巢上皮性癌30例，卵巢上皮性交界性腫瘤10例，卵巢良性腫瘤10例；另取正常卵巢組織10例(來自同院同期因子宮肌瘤行全子宮+卵巢切除術的患者)。組織學類型：漿液性卵巢癌17例，黏液性卵巢癌8例，子宮內膜樣卵巢癌5例；兩級分級系統：低級別漿液性癌(low-grade serous carcinoma，LGSC)6例，高級別漿液性癌(high-grade serous carcinoma，HGSC)11例；FIGO分期：Ⅰ、Ⅱ期11例，Ⅲ、Ⅳ期19例；組織分化程度：高、中分化16例，低分化14例；所有患者術前均無化療、放療或其他治療史。所有取材均獲得患者的知情同意并通過鄭州大學第三附屬醫院倫理委員會的批準。SKOV3細胞為第四軍醫大學病原生物學教研室趙亞教授饋贈，山羊抗人IGF-1多克隆抗體、IGF-1購自R&D公司，兔抗人E-cad單克隆抗體、β-actin鼠抗人一抗、HRP、RIPA、BCA試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)，加強型DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)，RNA提取試劑、反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)，Transwell小室、Matrigel基質膠(BD公司)，其余生物試劑均為分析純。

1.3細胞培養及分組SKOV3細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，將培養瓶置于37 ℃、體積分數5% CO2的恒溫密閉培養箱中培養。每隔1～2 d換1次新鮮培養液，每隔2～3 d應用2.5 g/L胰蛋白酶消化進行傳代。取處于對數生長期的細胞，以約1×105mL-1接種于6孔板，將6孔板放置于37 ℃、體積分數5%CO2的培養箱中培養12 h，換無血清培養基同步化處理12 h后分別加入含終質量濃度分別為0(空白對照組)、25、50、100、200 μg/L IGF-1的完全培養基，培養24 h進行后續實驗。

1.4細胞中E-cad mRNA表達的檢測采用實時熒光定量PCR法。收集1.3中分組處理的細胞，按照Trizol試劑法提取總RNA，紫外分光光度儀檢測其濃度及純度后，按照反轉錄試劑盒說明反轉錄為cDNA。E-cad上游引物序列5’-TCACGCTGTGT CATCCAACGG-3’，下游引物序列5’-TAGGTGTTCA CATCATCGTCCGC-3’；β-actin上游引物序列5’-GTT GCGTTACACCCTTTCTTGAC-3’，下游引物序列5’-CTCGGCCACATTGTGAACTTTG-3’。PCR反應體系為25 μL(2×SYBR 12.5 μL，50×ROX 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，DEPC水5 μL，cDNA 5 μL)。反應條件:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，重復40個循環;解鏈繪制溶解曲線，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。實驗重復3 次。應用美國安捷倫Mx3000P系統記錄Ct值并計算各組2-ΔΔCt值，結果取平均值。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0處理數據。不同卵巢組織中IGF-1、E-cad蛋白陽性表達率的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，不同臨床病理特征的卵巢癌組織中IGF-1和E-cad陽性表達率的比較應用Fisher確切概率法，采用列聯系數分析卵巢癌組織中IGF-1和E-cad蛋白表達的關系，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1IGF-1、E-cad蛋白在不同卵巢組織中的表達及與卵巢上皮性癌患者臨床病理參數的關系見圖1及表1。卵巢上皮性癌、卵巢上皮性交界性腫瘤、卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織中IGF-1的陽性表達率分別為73.3%、30.0%、20.0%和10.0%，E-cad的陽性表達率分別為36.7%、60.0%、70.0%和90.0%,4組間相比，差異有統計學意義(H=17.647、9.866，P均<0.05);與其他3種組織比較,卵巢上皮性癌組織中IGF-1蛋白的陽性表達率升高、E-cad蛋白的陽性表達率降低(P<0.05)。

1：IGF-1；2：E-cad；A：漿液性卵巢上皮性癌；B:卵巢上皮性交界性腫瘤；C:卵巢良性腫瘤；D：正常卵巢組織。圖1　不同卵巢組織中IGF-1和E-cad蛋白的表達(SP,×400)

表1　卵巢上皮性癌組織中IGF-1和

2.2卵巢上皮性癌組織中IGF-1、E-cad蛋白表達的關系見表2。

表2　卵巢上皮性癌組織

rP=-0.396，P=0.018。

2.3不同質量濃度IGF-1對SKOV3細胞E-cad mRNA和蛋白表達的影響不同質量濃度的IGF-1作用SKOV3細胞24 h后，E-cad 的mRNA相對表達量及蛋白表達量均降低，呈劑量依賴性，見圖2、表3。

1～5：分別為空白對照組和25、50、100、200 μg/L IGF-1處理組。圖2　不同質量濃度的IGF-1對SKOV3細胞E-cad蛋白表達的影響

組別nE-cadmRNA△E-cad蛋白△空白對照組311.397±0.14025μg/LIGF-1處理組30.892±0.0290.985±0.02050μg/LIGF-1處理組30.746±0.0500.799±0.044100μg/LIGF-1處理組30.638±0.0530.546±0.064200μg/LIGF-1處理組30.491±0.0790.395±0.068F(P)49.025(<0.001)128.414(<0.001)

△:兩兩比較，P均<0.05。

2.4不同質量濃度的IGF-1對SKOV3細胞侵襲力的影響見圖3。與空白對照組相比，25、50、100、200 μg/L IGF-1處理后SKOV3細胞穿過小室的細胞數分別為(34.7±8.7)、(58.4±8.0)、(70.4±6.2)、(88.6±8.3)，高于空白對照組的(19.8±9.9)(F=52.877，P<0.001)。

A：空白對照組；B、C、D、E：分別為25、50、100、200 μg/L IGF-1處理組。圖3　不同質量濃度的IGF-1對SKOV3細胞侵襲力的影響(結晶紫染色，×400)

3討論

上皮性卵巢癌是最常見的婦科腫瘤，一旦診斷5 a生存率僅有30%[14]，目前治療卵巢癌的方法仍然以手術為主，輔以鉑類為主的化療。即使早期給予患者手術治療及化療，侵襲轉移和復發仍是患者死亡的主要原因[1-2]。EMT是上皮細胞失去極性，細胞間黏附降低，細胞侵襲遷移能力增加，并且細胞抗凋亡能力增強，從而促使上皮細胞成為間質細胞的生物過程，是卵巢癌發生侵襲轉移的重要機制之一。上皮細胞發生EMT，不僅獲得間質細胞的表型特征，而且腫瘤細胞的分子標志物也會發生相應的改變，最主要的是上皮性標記物E-cad的表達下調[3,15]。E-cad是一個主要的細胞間黏附分子，其功能是維持上皮細胞相互黏附并抑制細胞遷移，而E-cad表達下調可導致細胞間黏附力減弱，細胞運動性增強[16]。研究[17]表明E-cad在多種腫瘤中低表達并與腫瘤轉移相關。該研究結果表明，E-cad主要定位于細胞膜和細胞質，在卵巢上皮性癌的表達低于交界性、良性卵巢腫瘤及正常卵巢，但在交界性、良性卵巢腫瘤及正常卵巢的表達差異無統計學意義；此外，E-cad的表達與卵巢上皮性癌的分期、分化及兩級分級系統有關，與發病年齡和病理類型無關。

IGF-1由第12號染色體基因編碼，含有70個氨基酸，相對分子質量約7 500。IGF-1廣泛分布于卵巢、輸卵管、子宮內膜和胎盤等組織中,具有促有絲分裂、抗凋亡及類胰島素樣作用。研究[9-11]表明，IGF-1在炎癥和腫瘤發生發展過程中異常分泌，并且在乳腺癌、前列腺癌、胃癌等腫瘤中發現IGF-1可以通過不同的信號通路誘導細胞發生EMT及促進細胞的侵襲轉移。Lukanova等[6]發現血清中高濃度的IGF-1增加卵巢癌的風險。該研究結果表明，IGF-1主要定位于細胞質，IGF-1在卵巢上皮性癌組織中的表達高于交界性、良性卵巢腫瘤及正常卵巢，而在交界性、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中的表達差異無統計學意義；此外，IGF-1的表達與卵巢上皮性腫瘤的分期、分化及兩級分級系統呈正相關，與發病年齡和病理類型無關。該實驗結果還顯示IGF-1和E-cad在卵巢上皮性癌組織中的表達量呈負相關。此外，在細胞水平上應用不同質量濃度的IGF-1刺激卵巢癌SKOV3細胞，隨著IGF-1質量濃度的增加，E-cad蛋白的表達量逐漸降低，細胞的侵襲力逐漸增強。因此，IGF-1和E-cad可能在卵巢癌EMT和侵襲轉移中密切相關，共同參與卵巢癌的發生發展。

綜上所述， 上皮性卵巢癌組織中IGF-1蛋白的表達水平升高，E-cad蛋白的表達水平降低，二者呈負相關；IGF-1可降低SKOV3細胞中E-cad蛋白的表達，提高細胞的侵襲力，二者可能共同參與上皮性卵巢癌的EMT和侵襲轉移。

參考文獻

[1]JAYSON GC,KOHN EC,KITCHENER HC,et al.Ovarian cancer[J].Lancet,2014,384(9951):1376

[2]SIEGEL RL,MILLER KD,JEMAL A.Cancer statistics, 2015[J].CA Cancer J Clin,2015,65(1):5

[3]LAMOUILLE S,XU J,DERYNCK R.Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(3):178

[4]YU H,ROHAN T.Role of the insulin-like growth factor family in cancer development and progression[J].J Natl Cancer Inst,2000,92(18):1472

[5]WEROHA SJ,HALUSKA P.The insulin-like growth factor system in cancer[J].Endocrinol Metab Clin North Am,2012,41(2):335

[6]LUKANOVA A,LUNDIN E,TONIOLO P,et al.Circulating levels of insulin-like growth factor-I and risk of ovarian cancer[J].Int J Cancer,2002,101(6):549

[7]BROKAW J,KATSAROS D,WILEY A,et al.IGF-I in epithelial ovarian cancer and its role in disease progression[J].Growth Factors,2007,25(5):346

[8]SPENTZOS D,CANNISTRA SA,GRALL FA,et al.IGF axis gene expression patterns are prognostic of survival in epithelial ovarian cancer[J].Endocr Relat Cancer,2007,14(3):781

[9]LIAO GY,WANG MY,OU Y,et al.IGF-1-induced epithelial-mesenchymal transition in MCF-7 cells is mediated by MUC1[J].Cell Signal,2014,26(10):2131

[10]GRAHAM TR,ZHAU HE,ODERO-MARAH VA,et al.Insulin-like growth factor-I-dependent up-regulation of ZEB1 drives epithelial-to-mesenchymal transition in human prostate cancer cells[J].Cancer Res,2008,68(7):2479

[11]LI H,XU L,ZHAO L,et al.Insulin-like growth factor-I induces epithelial to mesenchymal transition via GSK-3β and ZEB2 in the BGC-823 gastric cancer cell line[J].Oncol Lett,2015,9(1):143

[12]郭歡歡,李紅雨,趙書君,等.卵巢上皮性癌組織中PITX2和β-catenin蛋白的表達[J].鄭州大學學報(醫學版),2015，50(2):260

[13]姚俊閣,李紅雨,趙書君,等.卵巢上皮性癌組織中 SOX2和 CyclinD1的表達[J].鄭州大學學報(醫學版),2014,49(2):247

[14]YEUNG TL,LEUNG CS,YIP KP,et al.Cellular and molecular processes in ovarian cancer metastasis.A review in the theme:cell and molecular processes in cancer metastasis[J].Am J Physiol Cell Physiol,2015,309(7):C444

[15]ZHOU XM,ZHANG H,HAN X.Role of epithelial to mesenchymal transition proteins in gynecological cancers: pathological and therapeutic perspectives[J].Tumour Biol,2014,35(10):9523

[16]LECUIT T,YAP AS.E-cadherin junctions as active mechanical integrators in tissue dynamics[J].Nat Cell Biol,2015,17(5):533

[17]THIERY JP,ACLOQUE H,HUANG RY,et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell,2009,139(5):871

(2015-10-13收稿責任編輯徐春燕)

Expressions of IGF-1 and E-cad in epithelial ovarian cancer tissue and effect of IGF-1 on E-cad expression and invasion in SKOV3 cell

XUEJingge,RENChenchen,YANGLi,LIUJiaxi,BAIYang,LIQian,LIFeiyan

DepartmentofGynecologyandObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsovarian neoplasm；insulin-like growth factor-1；E-cad；invasion;SKOV3 cell

AbstractAim: To detect the expressions of IGF-1 and E-cad in epithelial ovarian cancer tissue and the changes of the expression of E-cad and the cell invasion after SKOV3 cells were dealt with IGF-1,so as to study the role of IGF-1 during epithelial-mesenchymal transition(EMT).Methods: Immunohistochemical SP staining was conducted to detect the expressions of IGF-1 and E-cad in tissue from 30 patients with epithelial ovarian cancer,10 patients with borderline ovarian tumor,10 patients with benign epithelial tumor and 10 controls with normal ovary. SKOV3 cells were treated with different concentrations(0,25,50,100,200 μg/L) of IGF-1，and the expression of E-cad was observed by real-time reverse transcription-PCR and Western blot， and the invasion was detected by Transwell assay.Results: The positive expression rate of IGF-1 in the epithelial ovarian cancer, borderline ovarian tumor, benign epithelial tumor and normal ovarian tissue was 73.3%, 30.0%, 20.0% and 10.0%, while that of E-cad in the above tissue was 36.7%，60.0%，70.0% and 90.0%;compared with the other 3 groups, the positive expression rate of IGF-1 was increased and that of E-cad was decreased in epithelial ovarian cancer tissue(P<0.05). The expressions of IGF-1 and E-cad were related with the clinical stage，organization classification and two-tier grading system in epithelial ovarian cancer tissue(P<0.05),but not with age or pathological type(P>0.05). In the epithelial ovarian cancer tissue, IGF-1 and E-cad had negative correlation(rP=-0.396,P=0.018). The expression of E-cad reduced after SKOV3 cells were dealt with IGF-1(P<0.05). IGF-1 promoted invasion of SKOV3 cells in a concentration-dependent manner(P<0.05).Conclusion: IGF-1 and E-cad may be concerned with EMT and invasion of epithelial ovarian cancer.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.029

#通信作者，女，1968年11月生，博士，主任醫師，研究方向:婦科腫瘤，E-mail:renchenchen1106@126.com

中圖分類號R737.31