人前列腺癌PC-3細胞系再表達雄激素受體對生長因子相關(guān)基因族表達的影響*

曹靖晨張 沖王海燕張永輝陳苗苗呂秀芳鄂 群， 2劉 欣江 明**. 南通大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究室核受體與腫瘤研究實驗室（南通　22600）；2. 南通大學醫(yī)學院病理學系；. 江蘇省靖江市人民醫(yī)院泌尿外科

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·論著·

人前列腺癌PC-3細胞系再表達雄激素受體對生長因子相關(guān)基因族表達的影響*

曹靖晨1張 沖1王海燕1張永輝1陳苗苗1呂秀芳1鄂 群1， 2劉 欣3江 明1**
1. 南通大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究室核受體與腫瘤研究實驗室（南通226001）；2. 南通大學醫(yī)學院病理學系；3. 江蘇省靖江市人民醫(yī)院泌尿外科

摘要目的研究雄激素受體（AR）陰性人前列腺癌PC-3細胞系再表達人全長 AR cDNA，即PC-3-AR+細胞系生長因子相關(guān)基因族的表達情況，探討雄激素依賴型和非依賴型前列腺癌細胞AR與生長因子信號途徑的相關(guān)性。方法采用PCR芯片技術(shù)（PCR-array）進行研究，利用德國Qiagen公司的RT2 Profiler? PCR Array Human Growth Factors板對PC-3、PC-3-AR+兩株細胞系的生長因子相關(guān)基因族的表達量進行相對定量分析，之后通過數(shù)據(jù)分析，比較基因表達的差異。結(jié)果兩株人前列腺癌細胞系PC-3和PC-3-AR+中生長因子相關(guān)基因族的表達有明顯差異性， 其中FGF13、IGF2、CSF2、CXCL1等基因表達差異倍數(shù)超過5倍以上，具有顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)論人前列腺癌細胞系PC-3再表達雄激素受體AR影響其生長因子相關(guān)基因族的表達，人前列腺癌AR與生長因子表達信號通路具有相關(guān)性。

關(guān)鍵詞前列腺腫瘤；受體， 雄激素；生長因子

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是歐美國家最常見的男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其致死率在美國僅次于肺癌［1， 2］。中國前列腺癌的發(fā)病率遠低于歐美國家，但近幾年來，由于環(huán)境污染、飲食結(jié)構(gòu)西方化及人口老齡化等因素，前列腺癌的發(fā)病率有明顯的上升趨勢［3］。

常見的前列腺癌治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療和性激素內(nèi)分泌療法等，這些治療方法雖有一定的效果，但并沒有給進展期前列腺癌患者帶來很好的生存利益［3］。盡管如此，以雄激素受體（androgen receptor，AR）信號軸為治療靶點的雄激素剝奪療法（androgen deprivation therapy， ADT）依然是前列腺癌的一線治療方法［4， 5］。在經(jīng)過2～3年的ADT后，大部分患者將逐漸進展為去勢抵抗性前列腺癌（castration resistance prostate cancer， CRPC），CRPC患者中位生存期往往小于20個月，對于這部分患者的治療方法十分有限，且預后差［6］。目前對于CRPC的發(fā)生發(fā)展機制尚不十分明確，但可以確定的是雄激素及其受體AR功能的改變在其中發(fā)揮著重要作用。我們已完成的研究表明，AR在人前列腺癌細胞中再表達可以使得癌細胞生長能力減弱，增殖和遷移能力受抑制；可以降低體內(nèi)移植瘤的成瘤率、成瘤體積和浸潤能力等［7］。

生長因子是具有刺激細胞生長活性的細胞因子。前列腺是具有內(nèi)、外雙重分泌功能的性分泌腺。正常前列腺組織可以通過自分泌或旁分泌調(diào)控生長因子的表達和分泌，從而間接調(diào)控細胞的生長發(fā)育。近年來，相當一部分前列腺癌研究都集中在生長因子相關(guān)信號通路上［8-10］。

本研究旨在應用PCR芯片技術(shù)（PCR-array），對比性研究人全長雄激素受體AR cDNA再表達人前列腺癌細胞系PC-3-AR+與AR陰性的人前列腺癌細胞系PC-3中生長因子相關(guān)基因族的表達差異，探討前列腺癌AR的表達與生長因子信號通路的相關(guān)性，為進一步研究生長因子相關(guān)基因表達譜的變化及其與腫瘤生物學特性的關(guān)系，為臨床預防和治療前列腺癌，特別是去勢抵抗性前列腺癌提供前期實驗資料。

材料與方法

一、實驗材料

（一）細胞系

人前列腺癌細胞系PC-3，購自美國ATCC（美國模式培養(yǎng)物集存庫），該細胞系不具有可檢測的雄激素敏感性，為雄激素非依賴型細胞。人雄激素受體（AR）全長cDNA質(zhì)粒（pSAR-IRES-EGFP）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建立的AR再表達人前列腺癌細胞系PC-3-AR+，由美國John Hopkins大學醫(yī)學院John T. Isaacs教授贈送［11］。

（二）主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶消化液、雙抗，美國Hyclone公司；胎牛血清，美國Gibco公司；蛋白裂解液、上樣緩沖液、脫脂奶粉，碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，美國Thermo Scientifi c Pierce公司；AR抗體（sc-816），美國Santa Cruz公司；β-actin抗體（A5316），美國Sigma-Aldrich公司；ECL化學發(fā)光顯影劑，美國Thermo Pierce公司；Trizol，美國Thermo Fisher Scientific公司； RNeasy Mini Kit（74104）、RT2 First Strand試劑盒（330401）、RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix（330522）、RT2 Profi ler PCR Array Human Growth Factors（PAHS-041Z），德國Qiagen公司。

二、儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher），酶標儀（瑞士TECAN，M200），倒置相差顯微鏡（德國Leica），電泳儀（美國Bio-Rad，PowerPac Basic），化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad，ChemiDoc XRS+），Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific），NanoDrop2000分光光度計（美國Thermo Fisher）。

三、實驗方法

（一）細胞培養(yǎng)

人前列腺癌細胞系PC-3和PC-3-AR+用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)液置于37℃、5% CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。

（二）PCR芯片（PCR-array）技術(shù)

1. RNA的制備：PC-3細胞和PC-3-AR+細胞培養(yǎng)于T25培養(yǎng)瓶，各3瓶，細胞生長至80%時，Trizol提取細胞總RNA，按Qiagen Rneasy Mini Kit說明步驟對總RNA進行純化。加入TE Buffer溶解后，用NanoDrop2000紫外分光光度計進行吸光度的測量。

2. RNA瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)控：用0.5×TAE電泳緩沖液制作1%瓊脂糖凝膠，加0.5×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠。用移液器吸取總RNA樣品4μL，0.5×TAE電泳緩沖液5μL，0.5μg/mL溴化乙錠（EB）10×載樣緩沖液，混勻后上樣。調(diào)節(jié)電壓至100V進行電泳，約30min后停止電泳，化學發(fā)光儀觀察RNA電泳結(jié)果。

3. 逆轉(zhuǎn)錄反應-cDNA的合成：首先按RT2First Strand試劑盒說明步驟進行基因組DNA去除反應，取總質(zhì)量1μg的總RNA，反應液GE 2μL，無RNA酶純凈水，構(gòu)建基因組DNA去除反應體系10μL，42℃保溫5min，接著放在冰上至少1min。然后按RT2First Strand試劑盒說明步驟進行逆轉(zhuǎn)錄反應， 5×反應液BC3 4μL，P2 1μL，RE3逆轉(zhuǎn)錄酶混合液2μL，無RNA酶純凈水3μL，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄反應混合物體系10μL，在每管10μL基因組DNA去除反應物中加入10μL逆轉(zhuǎn)錄反應混合物，混勻，42℃15min，馬上放入95℃保持15min中斷反應，每個反應中加入91μL RNA-free水，混勻，把反應放在冰上繼續(xù)之后的實時PCR實驗過程。

4. 實時PCR（聚合酶鏈式反應）：按RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix說明步驟準備PCR反應混合物，在5mL試劑管中加入2×RT2 SYBR Green Mastermix 1350μL，cDNA合成反應物102μL，無RNA酶純凈水1248μL。從密封的包裝袋中取出RT2Profi ler PCR Array Human Growth Factors，向其每一孔加入25μL PCR反應混合物，并用透光粘性密封膜密封，室溫離心1min，1 000×g，離心去除氣泡。將RT2Profi ler PCR Array放入PCR儀進行PCR實驗，95℃預變性10min，激活HotStart DNA Taq Polymerase，95℃變性15s，40個循環(huán)，收集熒光數(shù)據(jù)。

5. 用PCR儀的程序計算循環(huán)數(shù)閾值（CT），把所有孔的CT值輸入至Excel頁面，利用www. SABioscience.com/pcrarraydataanalysis.php的PCR-array數(shù)據(jù)分析軟件，使用?? CT方法進行數(shù)據(jù)分析，將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為相對基因表達結(jié)果。

6.熱圖分析（heatmap）：在網(wǎng)頁http：// pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php中， 按網(wǎng)頁操作說明制作聚類熱圖。

結(jié)　果

一、人前列腺癌細胞系PPCC--33和PC-33--AARR++體外培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)人AR全長cDNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建立AR再表達人前列腺癌細胞系PC-3-AR+和AR陰性PC-3細胞系［7］，見圖1。

圖1　PC-33和PC-33--AARR++細胞形態(tài)圖A為PC-3；B為PC-3-AR+

二、人前列腺癌細胞系PC-3和PC-3-AR+總RNA樣品的定量和質(zhì)控結(jié)果

RNA樣品的濃度和純度比可以用分光光度計的吸光度來測定，在260nm波長并且檢測路徑為1cm時，吸光度1.0相當于RNA濃度為40μg/mL，對于RNA樣品，A260：A280須在1.8到2.1之間，A260測出的濃度須大于40μg/mL（表1）。之后我們做了RNA電泳，對RNA樣品進行質(zhì)量控制，電泳圖（圖2）顯示可見，28S、18S條帶比例較好，5S條帶較弱。

三、人前列腺癌細胞系PPCC--33和PC-33--AARR++生長因子相關(guān)基因族的表達差異

為比較兩株細胞系PC-3-AR+和PC-3中生長因子相關(guān)基因的表達差異，我們采用了PCR-array技術(shù)，利用德國Qiagen公司的RT2 Profi ler? PCR Array Human Growth Factors板對兩株細胞系的生長因子相關(guān)基因表達量進行相對定量分析。RT2 Profiler?PCR Array Human Growth Factors盤包括84個生長因子相關(guān)基因和5個看家基因的PCR檢測引物、1個基因組DNA污染質(zhì)控、3個逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)控及3個PCR反應質(zhì)控。在進行實時熒光PCR后，我們得到兩株細胞，每株3次平行的擴增曲線；利用PCR-array數(shù)據(jù)分析軟件，使用?? CT方法進行數(shù)據(jù)分析，將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為相對基因表達結(jié)果，之后我們根據(jù)96孔板的基因分布做了相應的3D柱狀圖（圖3），直觀地反映各個基因在兩株細胞系中的差異表達。實驗結(jié)果顯示，兩株細胞中絕大部分基因的表達量均具有差異性，其中FGF13、IGF2、CSF2、CXCL1等基因差異倍數(shù)超過5倍以上（表2），且差異具有明顯顯著性（P＜0.01）。

表11　RRNNAA樣品定量結(jié)果

圖22　 RRNNAA電泳圖

表22　PC-3-AR+ vs PCC--33基因表達顯著差異列表

四、人前列腺癌細胞系PPCC--33和PC-33--AARR++生長因子相關(guān)基因族表達差異的熱圖分析

我們進一步應用聚類熱圖分析，比較兩株人前列腺癌細胞系PC-3和PC-3-AR+中生長因子相關(guān)基因族的表達差異，結(jié)果如圖4所示。聚類熱圖可以直觀地呈現(xiàn)兩株細胞系PC-3和PC-3-AR+多個基因的全局表達量變化，還可以呈現(xiàn)多基因表達量的聚類關(guān)系。從圖4中可以看出每個基因在兩株細胞中的表達量有明顯差異。通過對基因聚類，可以看出基因間聚類的遠近關(guān)系。

圖33　PCR-aarrrraayy結(jié)果圖

圖44　PCR-arrrraayy 聚類熱圖

討　論

目前，前列腺癌的發(fā)病原因與發(fā)病機制尚不清楚，前列腺癌的高發(fā)人群集中在老年人，年齡越大發(fā)病率越高，中年人發(fā)病少見，青年人幾乎不發(fā)病。有研究發(fā)現(xiàn)，睪丸不發(fā)育或沒有睪丸的人不發(fā)生前列腺肥大，也不發(fā)生前列腺癌，說明前列腺癌的發(fā)生與雄激素（androgens）有著密切的關(guān)系。

人前列腺癌具有雄激素依賴型和非依賴型兩種，雄激素依賴型前列腺癌進展為雄激素非依賴型，即CRPC后，尚無有效的治療方案，預后極差，生存期縮短。CRPC的發(fā)生機制極為復雜，AR基因的擴增、丟失和（或）突變，會直接影響CRPC的發(fā)生和發(fā)展［12-15］。

正常前列腺組織中，雄激素與AR作用，通過自分泌或旁分泌途徑，可調(diào)控生長因子的表達和分泌，間接調(diào)控前列腺細胞的生長和發(fā)育。而PCa發(fā)生后，尤其是進展為CRPC后，AR表達異常，導致內(nèi)分泌功能紊亂，造成下游各種生長因子及其受體表達異常，細胞增殖和凋亡功能失衡，從而促進PCa的發(fā)展及內(nèi)分泌治療的失敗。前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展受雄激素、AR和各種生長因子及其受體的共同作用。

PC-3細胞為雄激素非依賴型人進展期前列腺癌細胞系，AR表達陰性。PC-3-AR+細胞系為John T. Isaacs教授［11］領(lǐng)導的實驗室應用人全長AR cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3細胞而建立，AR表達為強陽性。我們已完成的研究表明，AR對人前列腺癌細胞的腫瘤生物學特性有重要影響作用，人前列腺癌細胞中再表達AR，可以使癌細胞生長能力減弱，增殖和遷移能力受抑制，并可降低體內(nèi)移植瘤的成瘤率、成瘤體積和浸潤能力等［7］。本研究中，我們進一步應用PCR芯片技術(shù)（PCR-array），對比性研究AR cDNA再表達人前列腺癌細胞系PC-3-AR+與AR陰性的人前列腺癌細胞系PC-3中生長因子相關(guān)基因族的表達差異，探討人前列腺癌細胞AR與生長因子信號通路的相關(guān)性。

人生長因子信號通路PCR-array檢測結(jié)果顯示，兩株細胞中絕大部分基因的表達量均具有差異性，其中FGF13、IGF2、CSF2、CXCL1等基因的表達差異倍數(shù)超過5倍以上，具有顯著性差異（P ＜0.01）。生長因子在胚胎發(fā)育、傷痕愈合、炎癥等多種生理過程中起著重要的作用。The Human Growth Factors RT2 Profiler? PCR Array涉及生長因子相關(guān)基因84個，包括血管生成生長因子、凋亡調(diào)節(jié)因子、調(diào)節(jié)細胞分化因子等基因。有研究表明，成纖維生長因子（fi broblast growth factors， FGF）可以調(diào)節(jié)細胞分化和遷移，在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［16］；集落刺激因子（colony stimulating factor， CSF）對不同發(fā)育階段的造血干細胞起促增殖、分化的作用，是血細胞發(fā)生必不可少的刺激因子，集落刺激因子還可以促進癌細胞在血液中的運行，作用于腫瘤微環(huán)境，積極參與前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［17］。從表2可以看出，集落刺激因子CSF2在PC-3-AR+中的表達顯著降低；趨化因子CXCL1也顯著降低。Chemokine（C-X-C motif）ligand 1（CXCL1）是趨化因子（chemokine）CXC亞家族的成員，CXCL1可以通過加強腫瘤組織上皮和間質(zhì)間相互作用從而加快腫瘤生長和侵襲［18］。趨化因子CXCL1在多種腫瘤的生長、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲以及血管新生中起重要調(diào)節(jié)作用。AR再表達能夠改變?nèi)饲傲邢侔┘毎礟C-3中生長因子相關(guān)基因族的表達，人前列腺癌中AR與生長因子信號途徑的表達具有顯著相關(guān)性。

根據(jù)生長因子PCR-array的實驗結(jié)果，我們會進一步研究AR同CSF、CXCL1等基因之間的關(guān)系，闡明AR對這些重要生長因子基因族表達的影響及其與前列腺癌干細胞分化和腫瘤生物學特性的關(guān)系，為臨床預防和治療前列腺癌特別是CRPC提供新的靶點和思路。

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（2016-02-18收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.001

中圖分類號R 737.25*基金項目資助：本研究課題受國家自然科學基金（NSFC）面上項目（項目批準號：81372772）、江蘇特聘教授科研基金（蘇教師［2012］34號）、南通大學研究生科技創(chuàng)新計劃項目（項目編號：YKC14054）和江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）資助

Re-expression of androgen receptor（AR） in human prostate cancer cell line PC-3 affects expression patterns of the cluster of growth factor-related genes*

Cao Jingchen1， Zhang Chong1， Wang Haiyan1， Zhang Yonghui1，Chen Miaomiao1，Lv Xiufang1， E Qun1， 2， Liu Xin3， Jiang Ming1**
1.Laboratory of Nuclear Receptors and Cancer Research， Center for Basic Medical Research， Nantong University School of Medicine， Nantong 226001， Jiangsu， China. 2.Department of Pathology， Nantong University School of Medicine. 3.Department of Urology， Jingjiang People’s Hospital Corresponding author： Jiang Ming， E-mail： ming.jiang@ntu.edu.cn

AbstractObjectiveTo investigate the different expressions of growth factor-related genes between human prostate cancer cells PC-3 and PC-3-AR+ with androgen receptor （AR） re-expressed and discuss the relationship between AR and the signal pathways of growth factors. MetthhooddssThe different expressions of growth factor-related genes between in human prostate cancer cell lines PC-3 and in PC-3-AR+ were measured by RT2 Profiler? PCR Array Human Growth Factors（Qiagen， Germany）. RessuullttssDifferent expressions of some growth factor-related genes were identified between in human prostate cancer cell lines PC-3 and in PC-3-AR+， such as FGF13， ERAP1， IGF2， CSF2 and CXCL1 genes （P＜0.01）. ConcluussiioonnThe re-expression of full-length AR cDNA in human prostate cancer cell line PC-3 may influence the expression levels of growth factor-related genes， indicating that AR may be related to the signal pathways of growth factors in prostate cancer cells.

Key wordsprostatic neoplasms；receptors， androgen；growth factors

**通訊作者，E-mail： ming.jiang@ntu.edu.cn