人類(lèi)精子VDAC2 基因啟動(dòng)子在小鼠GC-2spd細(xì)胞的克隆和報(bào)告基因載體構(gòu)建*

徐愛(ài)明 張建中 柳長(zhǎng)坤 陳 偉　趙 凱華藝博 王海南 奚 偉 劉邊疆王增軍南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科實(shí)驗(yàn)室（南京　210029）

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人類(lèi)精子VDAC2 基因啟動(dòng)子在小鼠GC-2spd細(xì)胞的克隆和報(bào)告基因載體構(gòu)建*

徐愛(ài)明 張建中 柳長(zhǎng)坤 陳 偉趙 凱華藝博 王海南 奚 偉 劉邊疆**王增軍**
南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科實(shí)驗(yàn)室（南京210029）

摘要目的線(xiàn)粒體電壓依賴(lài)性陰離子通道蛋白2（Voltage-dependent anion channel 2，VDAC2）是VDAC重要的家族成員，參與機(jī)體眾多的生理活動(dòng)和病理疾病的發(fā)生發(fā)展。本次研究目的主要是確定和驗(yàn)證人VDAC2基因啟動(dòng)子的活性，為進(jìn)一步探究它的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法通過(guò)從正常人射出的精子中提取基因組DNA。利用軟件預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)，我們針對(duì)性設(shè)計(jì)三對(duì)引物并正確的擴(kuò)增出來(lái)。將驗(yàn)證正確的啟動(dòng)子序列結(jié)合到質(zhì)粒PDS_ psiCHECK-2中，轉(zhuǎn)染到小鼠GC-2細(xì)胞中去。轉(zhuǎn)染48h后，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)預(yù)測(cè)片段的啟動(dòng)子活性。結(jié)果VADC2基因上游-2000～+1000bp具有相對(duì)較高的活性。結(jié)論這是首次對(duì)人類(lèi)精子中VDAC2基因啟動(dòng)子的確定和活性驗(yàn)證，為后續(xù)研究VDAC2基因在精子的發(fā)生發(fā)展以及弱精子癥方面提供新的研究思路。

關(guān)鍵詞VDAC2基因；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)；啟動(dòng)區(qū)（遺傳學(xué)）；精子

線(xiàn)粒體電壓依賴(lài)性陰離子通道蛋白（Voltagedependent anion channel，VDAC），首次在草履蟲(chóng)線(xiàn)粒體外膜中以有活性的孔道蛋白發(fā)現(xiàn)［1，2］。自發(fā)現(xiàn)以來(lái)， VDAC 蛋白結(jié)構(gòu)研究一直處于瓶頸期，直到2008年三個(gè)來(lái)自不同國(guó)家的研究小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)VDAC蛋白結(jié)構(gòu)信息打破了這一瓶頸［2-5］。2010年，De Pinto等運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）定量赫拉細(xì)胞中VDAC基因表達(dá)，稱(chēng)表達(dá)量比VDAC1高10倍的為VDAC2，表達(dá)量比VDAC2高100倍的為VDAC3來(lái)區(qū)別VDAC的同源體［6］。如今在高等真核生物中，三種同源體分辨編碼三種不同的蛋白，每種蛋白與其他亞型有70%的相似度［7， 8］。VDAC通道有明顯的電壓依賴(lài)性和離子選擇性［9］。在膜兩側(cè)電壓比較低的時(shí)候，VDAC通道一直處于有活性的狀態(tài)，允許大分子物質(zhì)如ATP，穿過(guò)脂質(zhì)雙分子層；在電壓比較高的時(shí)候，VDAC保持多種活性狀態(tài)從而保證多種離子或蛋白通過(guò)［10-12］。

VDAC2是VDAC家族中重要的一員，參與精子發(fā)生能量代謝的調(diào)控。類(lèi)似于VDAC3，VDAC2存在于睪丸組織和精子中［13， 14］。在2009年，Menzel首次報(bào)道了從牛的精子中分離純化出VDAC2蛋白，并發(fā)現(xiàn)位于膜外側(cè)的VDAC2、VDAC3主要分布于精子鞭毛的外周致密纖維層（ODF， outer dense fibers）。這說(shuō)明VDAC2蛋白具有能夠維持彈性結(jié)構(gòu)和精子鞭毛的彈性回縮功能，保護(hù)精子不被從附睪中射出來(lái)時(shí)產(chǎn)生的剪切力的損傷［14， 15］。

VDAC在男性不育中有重要的作用［16］。在我們前期研究中，我們收集了正常成年男性的精子樣本，首次檢測(cè)到VDAC蛋白在人類(lèi)精子中的表達(dá)，尤其是在精子鞭毛區(qū)［17］。我們進(jìn)一步比較了VDAC各亞型蛋白在正常成年男性和特發(fā)性弱精子癥患者中精子樣本表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)精子活力與VDAC2蛋白有相關(guān)性［16， 18］。然而，正如VDAC3缺乏小鼠患有特發(fā)性弱精子癥一樣，具體機(jī)制仍然不是十分清楚［19］。

眾所周知，單核苷酸多態(tài)性和組蛋白修飾，后者往往是甲基化修飾，調(diào)控基因的表達(dá)。在我們前期的工作中，我們通過(guò)對(duì)中國(guó)漢族人群分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VDAC2基因的多態(tài)性與特發(fā)性弱精子癥無(wú)相關(guān)性。由此，我們進(jìn)一步探討異常的基因甲基化調(diào)節(jié)VDAC2蛋白的表達(dá)從而導(dǎo)致男性特發(fā)性弱精子癥的發(fā)生。

材料和方法

一、材料和試劑

（一）細(xì)胞、菌株、質(zhì)粒

小鼠精原細(xì)胞株GC-2spd由南京醫(yī)科大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)生殖實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。報(bào)告基因載體psi_CHECK-2（內(nèi)接螢光蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因firefly luciferase和接海腎熒光素酶報(bào)告基因）購(gòu)自上海諾百生物化學(xué)有限公司。大腸桿菌DH5α由泌尿外科實(shí)驗(yàn)室保存。

（二）試劑

全基因組提取試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，引物主要由上海英俊公司（Invitrogen合成）合成，Taq DNA聚合酶、dNTP、T4連接酶、DNA Marker購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司。轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine2000TM購(gòu)自上海英俊公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

二、方法

（一）基因組DNA提取和基因組克隆

我們利用全基因組提取試劑盒，按照操作說(shuō)明書(shū)，從人類(lèi)正常人精子標(biāo)本中提取全基因組DNA。

（二）引物設(shè)計(jì)及和PCR反應(yīng)產(chǎn)物的回收

根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，采用Omiga 2.0軟件對(duì)Promoter Scan預(yù)測(cè)的-2000 ～ +1000bp的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。分別引入KpnI/ NheI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，引物由invitrogen公司合成。以人類(lèi)精子全基因組DNA為模板，分三段擴(kuò)增長(zhǎng)度為3000bp的人VDAC2基因啟動(dòng)子片段（40個(gè)循環(huán)，95℃ 15s，60℃ 1min，退火溫度70℃，1min）。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增片段，并用膠回收試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物。

表11　內(nèi)參及VVDDAACC22啟動(dòng)子各段擴(kuò)增引物

（三）人VDAC2基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體構(gòu)建利用獲得的人VDAC2基因啟動(dòng)子片段構(gòu)建了VDAC2啟動(dòng)子報(bào)告基因。為此限制性?xún)?nèi)切酶KpnI/ NheI分別酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和psi_CHECK-2載體質(zhì)粒。挑菌培養(yǎng)，酶切電泳并送測(cè)序鑒定。T4連接酶將酶切產(chǎn)物于16℃過(guò)夜反應(yīng)連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中并擴(kuò)增。得到的產(chǎn)物命名為psi_CHECK-2-VDAC2。設(shè)立陰性對(duì)照質(zhì)粒psi_CHECK-2-NC。

（四）細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

GC-2spd細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于37.5℃，5% CO2細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增至80%～90%融合時(shí)用0.25%胰酶消化，以5×105細(xì)胞/mL密度接種于6孔板中。待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)，提前1h換無(wú)雙抗培養(yǎng)基。對(duì)每種細(xì)胞用lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染miRNA和質(zhì)粒組合，另設(shè)1組為轉(zhuǎn)染對(duì)照。各組均設(shè)3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染過(guò)夜后換液，并繼續(xù)培養(yǎng)至48h。

（五）雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Dual Lueiferase Assay System）的操作說(shuō)明書(shū)，吸除轉(zhuǎn)染48h后的6孔板上清液，PBS洗兩遍，加細(xì)胞裂解液300μL，置冰上裂解10min，收集裂解液，12 092×g，離心5min。每個(gè)樣品取100μL裂解液，加100μL firefly檢測(cè)試劑，記錄RLU（relative light unit）值；再加100μL檢測(cè)工作液，記錄第二個(gè)RLU值分別讀出載體熒光素酶活性劑內(nèi)參質(zhì)粒熒光素酶活性數(shù)值，兩者之比為熒光素酶相對(duì)活性值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)在SPSS20.0軟件內(nèi)完成。數(shù)據(jù)資料采用Student's-t檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

一、人精子VVDDAACC22基因啟動(dòng)子片段擴(kuò)增結(jié)果

以正常成年男性精子基因組D N A為模板擴(kuò)增VDAC2基因啟動(dòng)子目的片段3 0 0 0 b p（-2000～+1000），電泳結(jié)果（見(jiàn)圖1）顯示于3000bp處見(jiàn)明亮清晰條帶影，與預(yù)期位置相符。

圖11　人VVDDAACC22啟動(dòng)子片段KpnI/ NNhheeII雙酶切結(jié)果鑒定

M：3000 bp DNA Marker，2-5為psi_CHECK-2-VDAC2，6-9為重復(fù)。其中，2-4、6-8為啟動(dòng)子分三段的產(chǎn)物，5、9為拼接后的產(chǎn)物。由圖可知，我們成功的擴(kuò)增出預(yù)期長(zhǎng)短的人VDAC2基因的啟動(dòng)子片段

二、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒psi_CHECK-2-VVDDAACC22的構(gòu)建及鑒定

我們運(yùn)用限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ和NHEiⅠ雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物以及psi_CHECK-2-VDAC2載體質(zhì)粒。切下大小約為3000bp，將重組質(zhì)粒送上海英俊生物公司測(cè)序鑒定（見(jiàn)圖2），結(jié)果表明重組質(zhì)粒中插入序列為3000bp，并準(zhǔn)確插入質(zhì)粒psi_CHECK-2載體質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)KpnI/ NheI之間，證實(shí)成功構(gòu)建了啟動(dòng)子報(bào)告基因載體。

三、小鼠GC--22ssppdd細(xì)胞中人VVDDAACC22基因啟動(dòng)子活性測(cè)定結(jié)果

將構(gòu)建好的重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒psi_CHECK-2-VDAC2和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠GC-2spd精原細(xì)胞中，24h后檢測(cè)熒光比值活性。小鼠GC-2spd細(xì)胞中長(zhǎng)度為3000bp啟動(dòng)子活性檢測(cè)結(jié)果表明，報(bào)告質(zhì)粒的活性高于陰性質(zhì)粒psi_CHECK-2-NC，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖3）。

圖22　人VVDDAACC22重組質(zhì)粒的部分測(cè)序圖測(cè)序結(jié)果證實(shí)我們成功構(gòu)建了啟動(dòng)子報(bào)告基因載體

討　論

VDAC基因家族的發(fā)現(xiàn)和其在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮的作用已經(jīng)不是什么新鮮事了［15， 19， 20］。最近，VDAC2蛋白作為哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過(guò)程中不可或缺的調(diào)控因素，已經(jīng)受到越來(lái)越多的重視。精子活力和存活率可能會(huì)直接受到VDAC蛋白的調(diào)控［15， 16， 21］。不考慮對(duì)Ca2+影響，利用DIDS阻斷VDAC蛋白能夠顯著的減少精子的運(yùn)動(dòng)能力；而對(duì)照組中精子的活力不受影響［16］。因此，VDAC家族蛋白，尤其VDAC2，可能對(duì)精子來(lái)說(shuō)是一種很重要的結(jié)構(gòu)功能復(fù)合體蛋白。在我們前期研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)VDAC2基因mRNA在特發(fā)性弱精子癥患者中表達(dá)明顯高于正常男性精子中的表達(dá)量，但是VDAC2影響人類(lèi)精子活力的具體機(jī)制仍然不十分清楚［16-18， 21］。

為了進(jìn)一步了解VDAC2基因和精子活力之間的關(guān)系，我們利用雙熒光素酶報(bào)告基因，首次成功地構(gòu)建并在小鼠精原細(xì)胞GC-2spd中驗(yàn)證人VDAC2基因啟動(dòng)子活性。我們調(diào)取NCBI基因文庫(kù)，設(shè)計(jì)啟動(dòng)區(qū)引物，并提取人類(lèi)精子基因組DNA，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出人類(lèi)VDAC2啟動(dòng)子區(qū)。將含有VDAC2基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠GC-2細(xì)胞中24h后，利用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光強(qiáng)度，通過(guò)熒光強(qiáng)度來(lái)反映啟動(dòng)子是否有活性。我們的結(jié)果表明，VDAC2基因-2000～+500具有啟動(dòng)子活性，而核心啟動(dòng)子區(qū)域有待我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)篩查討論。

最近Hakan等在一次實(shí)驗(yàn)中意外發(fā)現(xiàn)有活性的芳烴受體（AhR， aryl hydrocarbon receptor）能夠上調(diào)VDAC2的表達(dá)，這是首次發(fā)現(xiàn)外界環(huán)境影響因子調(diào)控VDAC2蛋白表達(dá)。除此而外，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了活化的AhR受體引起VDAC2蛋白表達(dá)上調(diào)的必要性，并且說(shuō)明了VDAC2基因的上調(diào)是在轉(zhuǎn)錄水平而非翻譯水平［22， 23］。我們進(jìn)一步猜想所有與VDAC2基因表達(dá)上調(diào)的疾病是否都含有活化的或者說(shuō)有功能的AhR？這將是研究環(huán)境病理因素與VDAC2蛋白表達(dá)增高相關(guān)疾病新的研究方向。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在-2000～+1000啟動(dòng)子區(qū)存在著調(diào)控VDAC2基因表達(dá)的重要元件，這將是我們進(jìn)行后續(xù)表觀研究的關(guān)鍵點(diǎn)［24］。基于我們2010年的研究基礎(chǔ)，我們將繼續(xù)討論異常的DNA甲基化是否會(huì)引起VDAC2蛋白表達(dá)異常引起特發(fā)性弱精子癥。此外，隨著環(huán)境污染不斷嚴(yán)重，尤其是各類(lèi)化學(xué)污染物，例如戴奧辛（2，3，7，8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin），通過(guò)調(diào)控VDAC2蛋白的表達(dá)來(lái)影響正常生理功能，并且這些是否是針對(duì)VDAC2基因啟動(dòng)子的改變？因此，我們?nèi)匀挥性S多工作要做來(lái)解答上述問(wèn)題。

圖33　熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

用不同比例的報(bào)告基因載體psi_CHECK-2-VDAC2和psi_ CHECK-2-NC共轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠GC-2spd細(xì)胞中，24h后收獲細(xì)胞裂解后檢測(cè)上清中熒光素酶活性。與psi_CHECK-2-NC比較，*為P ＜0.05，表明長(zhǎng)度為3000bp的啟動(dòng)子片段具有啟動(dòng)子活性

參 考 文 獻(xiàn)

1 Benz R. Porin from bacterial and mitochondrial outer membranes. CRC Crit Rev Biochem 1985； 19（2）： 145-190

2 Schein SJ， Colombini M， Finkelstein A Reconstitution in planar lipid bilayers of a voltage-dependent anion-selective channel obtained from paramecium mitochondria. J Membr Biol 1976； 30（2）： 99-120

3 Bayrhuber M， Meins T， Habeck M， et al. Structure of the human voltage-dependent anion channel. Proc Natl Acad Sci U S A 2008； 105（40）： 15370-15375

4 Hiller S， Garces RG， Malia TJ， et al. Solution structure of the integral human membrane protein VDAC-1 in detergent micelles. Science 2008； 321（5893）： 1206-1210

5 Ujwal R， Cascio D， Colletier JP， et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proc Natl Acad Sci U S A 2008； 105（46）： 17742-17747

6 De Pinto V， Guarino F， Guarnera A， et al. Characterization of human VDAC isoforms： a peculiar function for VDAC3？ Biochim Biophys Acta 2010； 1797（6-7）： 1268-1275

7 Decker WK， Bowles KR， Schatte EC， et al. Revised fi ne mapping of the human voltage-dependent anion channel loci by radiation hybrid analysis. Mamm Genome 1999；10（10）： 1041-1042

8 Decker WK， Craigen WJ. The tissue-specifi c， alternatively spliced single ATG exon of the type 3 voltage-dependent anion channel gene does not create a truncated proteinisoform in vivo. Mol Genet Metab 2000； 70（1）： 69-74

9 Shoshan-Barmatz V， De Pinto V， Zweckstetter M， et al. VDAC， a multi-functional mitochondrial protein regulating cell life and death. Mol Aspects Med 2010；31（3）： 227-285

10 Rostovtseva T， Colombini M. ATP flux is controlled by a voltage-gated channel from the mitochondrial outer membrane. J Biol Chem 1996； 271（45）： 28006-28008

11 Benz R. Permeation of hydrophilic solutes through mitochondrial outer membranes： review on mitochondrial porins. Biochim Biophys Acta 1994； 1197（2）： 167-196

12 Gincel D， Silberberg SD， Shoshan-Barmatz V. Modulation of the voltage-dependent anion channel （VDAC） by glutamate. J Bioenerg Biomembr 2000； 32（6）： 571-583

13 Ficarro S， Chertihin O， Westbrook VA， et al. Phosphoproteome analysis of capacitated human sperm. Evidence of tyrosine phosphorylation of a kinaseanchoring protein 3 and valosin-containing protein/p97 during capacitation. J Biol Chem 2003； 278（13）： 11579-11589

14 Menzel VA， Cassara MC， Benz R， et al. Molecular and functional characterization of VDAC2 purified from mammal spermatozoa. Biosci Rep 2009； 29（6）： 351-362

15 Hinsch KD， De Pinto V， Aires VA， et al. Voltagedependent anion-selective channels VDAC2 and VDAC3 are abundant proteins in bovine outer dense fibers， a cytoskeletal component of the sperm flagellum. J Biol Chem 2004； 279（15）： 15281-15288

16 Kwon WS， Park YJ， Mohamed el SA， et al. Voltagedependent anion channels are a key factor of male fertility. Fertil Steril 2013； 99（2）： 354-361

17 Liu B， Wang Z， Zhang W， et al. Expression and localization of voltage-dependent anion channels （VDAC）in human spermatozoa. Biochem Biophys Res Commun 2009； 378（3）： 366-370

18 Liu B， Wang P， Wang Z， et al. Analysis and difference of voltage-dependent anion channel mRNA in ejaculated spermatozoa from normozoospermic fertile donors and infertile patients with idiopathic asthenozoospermia. J Assist Reprod Genet 2010； 27（12）： 719-724

19 Sampson MJ， Decker WK， Beaudet AL， et al. Immotile sperm and infertility in mice lacking mitochondrial voltage-dependent anion channel type 3. J Biol Chem 2001； 276（42）： 39206-39212

20 Hinsch KD， Asmarinah， Hinsch E， et al. VDAC2 （porin-2）expression pattern and localization in the bovine testis. Biochim Biophys Acta 2001； 1518（3）： 329-333

21 Liu B， Wang P， Wang Z， et al. The use of anti-VDAC2 antibody for the combined assessment of human sperm acrosome integrity and ionophore A23187-induced acrosome reaction. PLoS One 2011； 6（2）： e16985

22 Sarioglu H， Brandner S， Haberger M， et al. Analysis of 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced proteome changes in 5L rat hepatoma cells reveals novel targets of dioxin action including the mitochondrial apoptosis regulator VDAC2. Mol Cell Proteomics 2008； 7（2）： 394-410

23 Weiss C， Kolluri SK， Kiefer F， et al. Complementation of Ah receptor deficiency in hepatoma cells： negative feedback regulation and cell cycle control by the Ah receptor. Exp Cell Res 1996； 226（1）： 154-163

24 Turecki G， Meaney MJ. Effects of the social environment and stress on glucocorticoid receptor gene methylation： a systematic review. Biol Psychiatry 2016 ；79（2）：87-96

（2015-09-17收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.002

中圖分類(lèi)號(hào)R 321.1

*基金項(xiàng)目資助：國(guó)家自然科學(xué)基金（30872575，81200467）

Clones and the construction of luciferase report vector of human sperm VDAC2 promoter in GC-2spd cell lines

Xu Aiming， Zhang Jianzhong， Liu Changkun， Chen Wei， Zhao Kai，Hua Yibo， Wang Hainan， Xi Wei， Liu Bianjiang**， Wang Zengjun**
Department of Urology， the First Affi liated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029， China Corresponding author： Liu Bianjiang， E-mail： bjliu@njmu.edu.cn； Wang Zengjun， E-mail： zengjunwang@njmu.edu.cn

AbstractObjectiveVoltage-dependent anion channel 2 （VDAC2） is an important member of VDAC family， and involves in many physiological activities and pathological changes in diseases. This study is mainly to identify and analyze the active of promoter of human VDAC2 gene for further investigation on its regulatory mechanism. MetthhooddssGenomic DNA from normal human ejaculated sperm was extracted. The promoter region was correctly amplifi ed using three pairs of primer. PDS_pisCHECK-2 carried the correct promoter sequence was transfected into GC-2spd cell line. 48h after cell transfection， a Dual-Luciferase? Reporter Assay Kit was used to detect the activity of VDAC2 gene promoter constructs. RessuullttssIt showed that the -2000～+1000bp located at upstream of VDAC2 had the highest activity. ConcluussiioonnThis study fi rst identify and analyze the activity of promoter region of VDAC2 in human sperm.

Key wordsVDAC2 gene；dual-luciferase reporter system；promoter regions （genetics）；spermatozoa

**共同通訊作者：劉邊疆，E-mail： bjliu@njmu.edu.cn； 王增軍，E-mail： zengjunwang@njmu.edu.cn