明膠酶A及其抑制劑TIMP-1在宮頸癌中的表達及其臨床意義

張文淵　丁盛娣　黃筱纮　沈俊俊浙江省湖州市中心醫院婦產科，浙江湖州　313000

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明膠酶A及其抑制劑TIMP-1在宮頸癌中的表達及其臨床意義

張文淵丁盛娣黃筱纮沈俊俊
浙江省湖州市中心醫院婦產科，浙江湖州313000

[摘要]目的研究明膠酶A及其抑制劑（TIMP-1）在子宮頸癌中的表達及與預后的關系。方法采用免疫組織化學（S-P）法檢測47例子宮頸癌組織標本，31例CIN組織標本，31例正常宮頸組織標本中明膠酶A及其抑制劑（TIMP-1）的陽性表達。結果明膠酶A、TIMP-1在宮頸癌組織中的陽性表達率分別為80.85%、57.45%，在CIN組織中的陽性表達率分別為32.26%、19.35%，在正常宮頸組織中的陽性表達率分別為9.68%、6.45%；明膠酶A在三組間陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=41.680，P=0.00）。TIMP-1因子在三組間陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=25.516，P=0.00）。明膠酶A及TIMP-1在宮頸癌有無淋巴轉移之間，差異有統計學意義。明膠酶A及TIMP-1在宮頸癌組織中的陽性表達與腫瘤生長類型、臨床分期、病理分級、組織類型、患者年齡之間，差異無統計學意義。結論明膠酶A高表達與宮頸癌的侵襲、轉移及預后有較密切關系，明膠酶A可以作為判斷預后的指標之一。

[關鍵詞]明膠酶A；TIMP-1；基質金屬蛋白酶；子宮頸癌

研究發現：惡性腫瘤的侵襲與轉移首先是穿透其外周細胞外基質層，破壞腫瘤細胞的組織學屏障。明膠酶A（matrix metalloproteinases-A，MMP-2）是一類依賴鈣、鋅離子的內肽酶，與其內源性特效的組織金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）共同介導細胞外基質的降解和組織重塑，以維持細胞外基質的穩定。在正常機體中明膠酶A及其抑制劑（TIMP－1）的活性均較低。明膠酶A的活性可以被生長因子、炎癥因子等特異性刺激后上調，而TIMP-1活性不能同步增加，引起調節失衡，從而引起腫瘤細胞穿透其外周細胞外基質層繼而形成轉移[2]。國內外研究者發現：明膠酶A及其抑制劑（TIMP－1）與乳腺癌、膀胱癌、軟骨肉瘤、神經膠質瘤等多種惡性腫瘤關系密切[1，2，5，6]。至于婦科腫瘤，目前該因子與子宮內膜癌及卵巢癌的關系已有報道[3，4]，但該因子與子宮頸癌的關系少有報道。本研究采用免疫組化S-P法檢測明膠酶A和TIMP1在子宮頸癌中的表達，進一步分析兩因子與子宮頸癌預后的關系，以期為宮頸癌的靶向治療提供一定的理論依據。

表1　明膠酶A和TIMP-1在宮頸癌組織、CIN組織和正常宮頸中的表達情況

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2007年1月～2009年12月浙江省湖州市中心醫院病理及臨床資料完整的子宮頸癌組織標本47例，31例CIN組織標本，其中子宮頸癌組患者年齡22～73歲，平均（58.3±10.5）歲，按照國際婦產科聯盟（2009）臨床分期標準，Ⅰa期22例，Ⅰb～Ⅱa期18例，Ⅲ～Ⅳ期以上7例；鱗癌36例，其中高分化13例，中分化14例，低分化9例；腺癌7例（黏液腺癌3例、惡性腺瘤4例）、其他類型癌4例（未分化癌1例、腺鱗癌2例、間葉腫瘤1例）；所有患者術前均未行放、化療。選擇同期因良性病變行全子宮全切除，經病理證實為正常宮頸組織31例為對照組，年齡21～75歲，平均（59.7±9.2）歲。三組患者年齡比較差異無統計學意義。所有宮頸癌患者均正規隨訪（失訪10例，隨訪37例）。

1.2實驗方法及結果判斷

所有實驗標本均由病理科提供臨床資料完整的石蠟標本，由一位資深病理實驗醫師指導進行，按照免疫組織化學S-P二步法操作染色。實驗組鼠抗人明膠酶A及TIMP-1單克隆抗體，S-P試劑盒均購自福州邁新生物有限公司，對照組以PBS代替一抗。結果判斷由一位資深病理診斷醫師指導，嚴格按試劑盒說明書判定。具體如下：400倍顯微鏡下觀察所有受檢標本，以細胞膜（或細胞胞漿）出現棕黃或黃色顆粒為陽性。隨機取4個不同視野分別計數，根據陽性細胞百分比及染色強度進行綜合評分，淡黃色為弱陽性，黃色為陽性，棕黃色為強陽性。按陽性細胞所占的百分率計分如下：＜5%為0分；5%～20%為1分；21%～45%為2分；46%～75%為3分；＞75%為4分；按染色強度計分如下：無著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分，根據上述陽性細胞百分率及染色強度進行綜合評分，總分0～1分為陰性（－）、2～3分為弱陽性（＋）、4～5分為陽性（＋＋）、6～7分為強陽性（＋＋＋）[3]。

1.3統計學處理

采用SPSS17.0軟件包進行統計學分析，計數資料率的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。相關性分析用Spearman相關分析。生存率Kaplan-Meier非參數法制作計算。

2　結果

2.1明膠酶A及TIMP-1在宮頸癌組織、CIN組織和正常宮頸中的表達情況分析

由表1可見：明膠酶A（MMP2）及其抑制劑TIMP-1表達以細胞膜或部分細胞漿被染成黃色或棕色為陽性細胞，染色淡黃色為弱陽性，不染色為陰性細胞（封三圖3～6）。MMP2、TIMP-1在宮頸癌組織中的陽性表達率分別為80.85%、57.45%，在CIN組織中的陽性表達率分別為32.26%、19.35%，在正常宮頸組織中的陽性率表達分別為9.68%、6.45%；MMP2因子在三組間陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=41.680，P=0.00）。TIMP-1因子在三組間陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=25.516，P=0.00）。隨著宮頸病變的加重，MMP2、TIMP-1的陽性表達漸增加，MMP2/ TIMP-1比值漸增加，強陽性率漸增多。

2.2明膠酶A和TIMP-1在宮頸癌中表達的相關性分析

由表2可見：21例明膠酶A表達陽性的宮頸癌病例中，6例TIMP-1呈陽性表達，二者共表達為28.57%。18例明膠酶A表達陰性病例中，2例TIMP-1呈陰性表達，同時不表達為94.44%。經Spearman相關分析，兩者之間呈負相關性（直線相關），相關系數r=-0.508，P=0.046。

表2　明膠酶A和TIMP-1在宮頸癌中表達的相關性分析（n）

2.3宮頸癌組織中明膠酶A（MMP2）和TIMP-1的陽性表達與各臨床病理因素之間的關系

由表3可見：明膠酶A（MMP2）在宮頸癌組織中的陽性表達與腫瘤生長類型、組織類型、臨床分期、病理分級、患者年齡之間，差異無統計學意義。明膠酶A在宮頸癌有淋巴轉移中陽性率為95.45%，在無淋巴轉移組織中陽性率為68.00%，差異有統計學意義（χ2= 6.013，P=0.016）。TIMP-1在宮頸癌組織中的陽性表達與腫瘤生長類型、組織類型、臨床分期、病理分級、患者年齡之間，差異無統計學意義。TIMP-1在宮頸癌有淋巴轉移中陽性率為77.27%，在無淋巴轉移組織中陽性率為40.00%，差異有統計學意義（χ2=6.650，P=0.011）。

表3　宮頸癌組織中MMP2和TIMP-1的陽性表達與各臨床病理因素的關系（n，%）

3　討論

研究發現，上皮惡性腫瘤主要的生物屏障是腫瘤周圍的細胞外基質，而細胞外基質的主要生化結構是由彈力纖維及膠原組成，Ⅳ型膠原為膠原中的主要成分[2]。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPS）是一組依賴鈣、鋅離子的內肽酶，可以水解血管細胞外基質及其基底膜，其中明膠酶A（又稱MMP2）是分解Ⅳ型膠原主要基質金屬蛋白酶之一，它在腫瘤的浸潤、擴散和血管重建中起重要作用[7]。TIMP-1是人體內自然存在的明膠酶A特異性抑制劑，存在于體液和組織中，由結締組織細胞及巨噬細胞產生。其作用機制如下[8]：①在酶原階段，TIMP-1可與明膠酶A酶原形成穩定的復合體，從而阻礙明膠酶A自我活化。②TIMP-1通過氨基端功能區的半胱氨酸殘基與活化的明膠酶A鋅離子活性中心結合。③TIMP-1通過C端功能區與明膠酶A的除活性中心以外的其他部分以1：1比例結合，形成MMP2-TIMP-1復合物，從而阻斷明膠酶A與其作用底物的結合。研究發現，在正常穩定狀態的組織中，明膠酶A表達量較少，TIMP-1的表達與之相平衡，亦較少。當人體受到生長因子、炎癥因子、腫瘤因子等刺激后，明膠酶A的表達強度可明顯上升，若TIMP-1的表達強度增高較明膠酶A增高幅度小，兩者的平衡失調，則會引起疾病的發生。本實驗中明膠酶A及TIMP-1在正常宮頸組織中的表達相差甚微，分別為9.68%、6.45%；兩者在CIN組中的表達分別為32.26%、19.35%，兩者表達明顯均較正常組增高，TIMP-1表達的升高，可能是由于機體明膠酶A增高時，通過反饋調節增加TIMP-1來抑制明膠酶A的活性；兩者在宮頸癌中的表達分別為80.85%（其中強陽性16例）、57.45%（其中強陽性4例），明膠酶A的表達率及表達強度均明顯高于TIMP-1；這一結論進一步證實了大部分學者的觀點：當腫瘤侵襲或轉移時，明膠酶A陽性率較TIMP-1明顯上升[9]。

生理狀態下，血管壁的細胞外基質通過明膠酶A與其抑制劑TIMP-1維持降解和新生之間的動態平衡。若腫瘤刺激因子等作用使二者平衡失衡，將會導致腫瘤細胞突破第一道物理屏障，造成腫瘤細胞游走，經過一系列的轉化，滲透，直至完成對靶組織的侵襲。國外研究者早在1996年就發現明膠酶A在乳腺癌、胃腸道、垂體等腫瘤浸潤和轉移過程起到了重要的作用[5]。Chen等[10]、Al Rawashdeh等[11]均證實：明膠酶A作用于基質成分后可以分解纖維連接蛋白-5（FN-5）和層黏蛋白（LN），產生可溶性片段，具有催化功能，間接參與腫瘤的免疫過程。Tumer等[12]進一步研究發現明膠酶A表達陽性與腫瘤血管新生血管生成有關，確定了明膠酶A在腫瘤遠處轉移、種植中的至關重要的功能。

本研究結果顯示：明膠酶A在宮頸癌中的表達與患者腫瘤生長類型、組織類型、病理分級、臨床分期、年齡之間差異無統計學意義。明膠酶A在宮頸癌有淋巴轉移組中陽性率為95.45%，在無淋巴轉移組中陽性率為68.00%，差異有統計學意義（P＜0.05）。TIMP-1在宮頸癌中的表達與患者腫瘤生長類型、組織類型、病理分級、臨床分期、年齡之間差異無統計學意義。TIMP-1在宮頸癌有淋巴轉移中陽性率為77.27%，在無淋巴轉移組織中陽性率為40.00%，差異有統計學意義（χ2=6.650，P=0.011）。進一步分析上述實驗數據發現：21例明膠酶A表達陽性的宮頸癌病例中，6例TIMP-1呈陽性表達，二者共表達為28.57%。18例明膠酶A表達陰性病例中，2例TIMP-1呈陰性表達，同時不表達為94.44%。經Spearman相關分析，兩者之間呈負相關性，相關系數r=-0.508，P=0.046。根據以上實驗結果及相關文獻報道，我們有理由認為：明膠酶A與宮頸癌的侵襲性有一定的關系，其作用機制可能因為TIMP-1的表達過低，無法控制明膠酶A對細胞外基質和基底膜的降解，從而使腫瘤的侵襲性增強，明膠酶A的過度表達可能使腫瘤內部血管增生，進一步增強腫瘤的增值能力，與大部分研究相一致[13-15]。

在后期的正規隨訪患者37例中，6例明膠酶A陽性及強陽性患者和2例TIMP-1陰性患者在5年內死亡。宮頸癌明膠酶A表達陽性與表達陰性患者之間的5年生存率比較，χ2=2.981，P=0.046，說明明膠酶A的陽性表達與預后相關，明膠酶A陽性表達強度越強，預后越差。

綜上所述，本文研究結果表明：明膠酶A高表達與宮頸癌的侵襲、轉移及預后有較密切關系，明膠酶A可以作為判斷預后的指標之一。這一結論與蔣亞男等[16]的研究結果相一致。因此，從理論上來看，提高TIMP-1或TIMP-1片段的表達，以降低明膠酶A的活性可望成為惡性腫瘤的治療新的思路。尹剛等[17]運用熒光蛋白轉染的卵巢癌原位移植瘤動物模型進行藥效實驗，結果顯示：黃芪、莪術配伍組能使卵巢癌細胞裸鼠移植瘤組織中MMP2的表達明顯降低，表明通過下調MMP2而達到抑瘤效果。但這一思路可否用于其他惡性腫瘤（包括子宮頸癌）的靶向治療，還有待于今后的大樣本多中心研究。

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Expression and clinical significance of gelatinase A and its inhibitor TIMP-1 in cervical cancer

ZHANG Wenyuan DING Shengdi HUANG Xiaohong SHEN Junjun
Department of Gynaecology and Obstetrics, Huzhou Central Hospital in Zhejiang Province, Huzhou 313000, China

[Abstract]Objective To investigate expression and prognostic significance of gelatinase A and its inhibitor TIMP-1 in cervical cancer. Methods 47 cervical cancer tissue, 31 CIN tissue and 31 healthy cervical tissue specimens were detected by immunohistochemistry (S-P) to explore the positive expression of gelatinase A and its inhibitor TIMP-1, and the clinical materials of these patients were analyzed. Results The positive rate of gelatinase A and TIMP-1 were 80.85% and 57.45% in cervical cancer tissue, 32.26% and 19.35% in CIN tissue, and 9.68% and 6.45% in healthy cervical tissue. The differences in positive rate of gelatinase A among three groups were statistically significant (χ2=41.680, P= 0.00), and the differences in positive rate of TIMP-1 among three groups were also statistically significant (χ2=25.516, P=0.00). The differences in positive rates of gelatinase A and TIMP-1 between lymphatic metastasis and non-lymphatic metastasis were statistically significant. In cervical cancer tissue, the positive rates of gelatinase A and TIMP-1 showed no difference among various tumor types, clinical stages, pathological grades, tissue types, and ages of patients. Conclusion High expression of gelatinase A has close relation to invasion, metastasis and prognosis of cervical cancer, which can be used as an indicator for prognosis judgement.

[Key words]Gelatinase A; TIMP-1; Matrix metalloproteinase; Cervical cancer

[中圖分類號]R737.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-9701（2016）03-0005-04

[基金項目]浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2015KYB378）

收稿日期：（2015-10-14）