青春期大鼠髁突軟骨內潤滑素的表達研究

陳正　涂少勤　盧紅飛　麥志輝　陳琳　陳奇

510630 廣州，中山大學附屬第三醫院口腔醫學部(陳正，盧紅飛，麥志輝，陳琳，陳奇)；518000佛山，廣東省佛山市口腔醫院正畸科(涂少勤)

?

青春期大鼠髁突軟骨內潤滑素的表達研究

陳正涂少勤盧紅飛麥志輝陳琳陳奇

510630 廣州，中山大學附屬第三醫院口腔醫學部(陳正，盧紅飛，麥志輝，陳琳，陳奇)；518000佛山，廣東省佛山市口腔醫院正畸科(涂少勤)

【摘要】目的研究無干預措施下青春期大鼠髁突軟骨內潤滑素的表達情況。方法選取5組5周齡的雌性SD大鼠(每組5只)，軟食喂養下分別于3、7、14、21和30 d處死，下頜骨髁突制作切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色及Envision二步法進行免疫組織化學染色檢查，應用倒置相差光學顯微鏡、光學顯微照相系統觀察和拍攝圖片，測量潤滑素陽性區域的累積光密度值，比較不同實驗時點潤滑素的表達情況。結果大鼠髁突軟骨細胞具有獨特的層域化分帶；髁突全層均有潤滑素的表達，其中靜止層僅見少量潤滑素表達；纖維層中，潤滑素聚集在最表層細胞的細胞漿中；增殖層中，潤滑素分布于整個軟骨細胞中；肥大層中，潤滑素分布于肥大的軟骨陷窩內細胞質中，淺肥大層表達較強，靠近深肥大層逐漸減弱。在相同時點，髁突后部軟骨增殖層潤滑素陽性區域的累積光密度值均高于肥大層潤滑素的累積光密度值(P均<0.05)；在不同時點，髁突后部增殖層和肥大層潤滑素陽性區域的平均累積光密度均無明顯變化(P均>0.05)。結論在青春期SD大鼠髁突軟骨中，潤滑素表達水平呈現一定的連續性和穩定性，這為髁突生理性改建、下頜骨正常發育提供了良好的內環境。

【關鍵詞】青春期大鼠；髁突軟骨；潤滑素

下頜骨發育不足是骨性Ⅱ類錯牙合畸形常見表現形式，作為人體骨骼系統的一部分，下頜骨的生長速度在青春期達到高峰，此時若給予合適的導下頜向前的功能矯治，刺激髁突生長，實現下頜骨體量的增大是實現治療目標的一種常見方式。髁突作為顳下頜關節的重要組成部分，受到關節內環境的影響[1]。近期研究表明，潤滑素在關節組織的正常生理功能中起到關鍵性的作用，其作為一種邊界潤滑劑，不僅可改變關節滑液的流變學性能，釋放關節軟骨所受的機械負荷，還可直接影響關節軟骨的代謝、保護軟骨表面完整性，是實現關節生理性改建的重要環節[2-3]。本研究通過檢測青春期SD大鼠髁突軟骨后部的潤滑素表達情況，初步探討正常發育時髁突軟骨內潤滑素表達水平，旨在為后續闡明功能矯治下頜后縮機制提供參考依據。

材料與方法

一、實驗動物

選取25只5周齡遠交系Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，體質量(100±5)g，由中山大學動物實驗中心提供。實驗動物飼養于中山大學北校區實驗動物中心SPF級實驗室，動物的處置符合實驗動物福利倫理原則。

二、主要儀器與試劑

包括：日本OLYMPUS 1X71倒置相差光學顯微鏡及OLYMPUS光學顯微照相系統，格蘭仕微波爐，石蠟切片機，展片機，生物組織包埋機，電熱鼓風干燥箱；兔抗潤滑素多克隆抗體(Abcam公司，英國)，GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒[基因科技(上海)有限公司]。

三、方法

1. 實驗分組

將25只5周齡SD雌性大鼠隨機分為5組(3、7、14、21和30 d)，每組5只。各組間小鼠體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。各組動物分籠飼養，軟食喂養，可自由飲水。

2. 組織準備

實驗動物分別用軟食飼養3、7、14、21和30 d，用10%水合氯醛(按0.3 ml/100 g體質量)腹腔麻醉后，經心內插管灌注生理鹽水后再灌注10%中性甲醛固定液(約300 ml)。切下動物頭部，在同樣的固定液中浸泡過夜。沿頭部正中矢狀面切開頭部成兩半后，分別在10%依地酸二鈉(EDTA，pH 7.4)室溫下脫鈣6～8周，每周換1次脫鈣液。脫鈣后去除顳下頜關節區周圍的組織，暴露大鼠下頜升支及髁突。常規脫水，包埋于石蠟中，平行于矢狀面切顳下頜關節成3 μm厚。選取石蠟切片平鋪于硅化玻片上，在60℃下恒溫2 h以確保組織能夠黏附到載玻片上，備用。

3. 蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學染色

常規將標本脫蠟、水化、蘇木素-伊紅染色、封片。

采用Envision二步法進行免疫組織化學染色檢測，標本脫蠟、水化、將切片置于3%過氧化氫中，微波爐低火檔加熱3 min，以去除內源性過氧化物酶，用1∶50稀釋的EDTA修復液(pH 9.0)進行抗原熱修復，磷酸鹽緩沖液沖洗后，滴加50 μl HRP二抗(Dako Envision復合物)，37℃濕盒孵育30 min，加二氨苯聯胺(DAB)溶液顯色液(按1∶50稀釋)，顯微鏡下觀察顯色，自來水中止顯色，用蘇木素溶液復染。人肝組織切片(來源于中山大學附屬第三醫院病理科)按上述步驟進行染色作為陽性對照；顳下頜關節石蠟切片以磷酸鹽緩沖液代替一抗按上述步驟進行染色作為陰性對照。

4. 觀察內容及評價標準

據文獻報道，髁突軟骨后上部是髁突生長以及引導下頜向前治療后發生改變最明顯的部位[4]。故本實驗主要檢測髁突后上部潤滑素表達變化。

免疫組化染色的評價標準：顯微鏡下觀察，潤滑素陽性區域定位于髁突軟骨細胞質，陽性反應呈棕黃色；人肝組織切片的細胞質呈棕黃色染色；陰性對照切片無棕黃色染色。應用OLYMPUS 1X71倒置相差光學顯微鏡、光學顯微照相系統觀察和放大40～400倍拍攝圖片，圖像使用Photoshop CS4圖像處理軟件，在平行于髁突軟骨細胞分層界線分別在髁突后上部的增殖層和肥大層隨機選擇3個350像素×100像素固定大小的區域，導入Image Pro-Plus軟件中測量潤滑素陽性區域的累積光密度值(IOD)。以陽性區域IOD與圖片面積的比值作為指標。

四、統計學處理

結果

一、髁突軟骨的組織形態特點

髁突軟骨表面包繞一層纖維組織即關節盤，對應于關節盤后帶略靠后部位的軟骨組織最厚，髁突軟骨由后向前逐漸變薄。髁突軟骨細胞具有獨特的層域化分帶，根據軟骨細胞形態，髁突由淺至深可分5層，分別為纖維層、靜止層、增殖層、肥大層和移行層，各層之間相互移行，見圖1、2。

圖1　青春期大鼠髁突軟骨組織的

A、M、P分別對應髁突軟骨的前、中、后部

圖2　青春期大鼠髁突后部軟骨組織的

A、R、P、H、Z分別對應髁突軟骨的纖維軟骨層、靜止層、增殖層、肥大層和移形層

二、髁突全層潤滑素的表達情況

1. 鏡下觀察

青春期大鼠中，髁突的全層均有潤滑素的表達，髁突后部表達明顯，在其靜止層僅見少量潤滑素表達；在纖維層中，潤滑素聚集在最表層細胞的細胞漿中，鏡下呈扁平狀，與髁突軟骨關節面平行；在髁突軟骨增殖層中，潤滑素分布于整個軟骨細胞中；在髁突軟骨肥大層中，潤滑素分布于肥大的軟骨陷窩內細胞質中，淺肥大層表達較強，靠近深肥大層逐漸減弱，見圖3、圖4。

圖3　青春期大鼠髁突軟骨組織的

A、M、P分別對應髁突軟骨的前、中、后部

2. 定量分析

髁突后部各時點的軟骨增殖層潤滑素陽性區域的IOD分別高于相應時點的肥大層潤滑素IOD(P均<0.05)；髁突后部增殖層和肥大層潤滑素陽性區域的IOD在不同時點組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖5。

圖4　青春期大鼠髁突后部軟骨組織的病理切片(IHC染色，A×200,B、C×400)

A、R、P、H、Z分別為髁突軟骨的纖維軟骨層、靜止層、增殖層、肥大層和移形層，黑色箭頭所示為潤滑陽性表達；B、C分別為P、H層中黑色選框放大圖像

表1　增殖層和肥大層組內、組間潤滑素表達水平的比較±s,n=5)

圖5　青春期大鼠髁突后部軟骨潤滑素表達水平的比較

增殖層和肥大層潤滑素表達水平比較，*P<0.05

討論

骨性Ⅱ類錯牙合畸形常表現為上頜前突、下頜后縮的突面面型，其中下頜發育不足尤為明顯。對于此類成年患者，臨床上通常采取正頜手術延長下頜骨長度，而對處于青春期或青春前期的患者，則采用引導下頜向前的功能矯治以刺激下頜骨的生長發育，達到上、下頜骨骨量協調的目的。作為下頜骨的主要生長區域以及顳下頜關節的重要組成部分，髁突的生長改建與關節的負荷環境息息相關，而顳下頜關節是一種滑液關節，在正常咀嚼、言語等口腔正常功能運動時受到各種機械負荷。覆蓋于顳下頜關節表面的關節盤和關節軟骨以及關節腔內的滑液可有效吸收和分散下頜功能運動中對顳下頜關節區造成的負荷。其中，良好的關節潤滑機制是維持顳下頜關節正常功能運動和長期健康的重要因素。作為關節潤滑機制的重要組成部分，邊界潤滑是指在關節負荷持續存在，關節軟骨的部分表面接觸時，由液膜潤滑過渡到干摩擦(軟骨表面直接接觸)過程之前的臨界狀態，是關節潤滑的最后階段[5]。軟骨表面的潤滑素作為一種邊界潤滑劑，具有潤滑關節的作用，是關節邊界潤滑的關鍵[6]。體內和體外的研究均表明，潤滑素可減小摩擦力，為關節滑液提供分散由于運動產生的應變能的能力，具有保護關節作用[7]。Leonardi等[8]通過對無退行性變的人顳下頜關節組織切片研究發現，潤滑素在顳下頜關節盤中間帶表層區域的表達量明顯高于中心區域，而且在關節盤中間帶中心區域的細胞周圍的細胞外基質中發現潤滑素的表達。

本研究中，選取的SD大鼠屬于嚙齒類動物，其與人類的顳下頜關節在組織結構具有高度相似性，生長周期較短，且較易獲得樣本量，是研究人顳下頜關節的理想動物模型[9]。本研究時間為大鼠5～9周齡，這個時間段包含髁突快速生長的階段，也覆蓋了SD大鼠的整個青春期，可代表臨床應用功能矯治器的大部分患者年齡段。研究結果顯示，青春期SD大鼠髁突后部軟骨細胞質中含有潤滑素的表達，并且在整個青春期沒有明顯變化。本研究還發現，在髁突軟骨增殖層和肥大層軟骨細胞質有潤滑素表達，與Ohno等[10]關于潤滑素在髁突軟骨的表達的研究結果相同。這提示，SD大鼠髁突軟骨中潤滑素表達水平在青春期呈現一定的連續性和穩定性，為顳下頜關節提供持續、有效的邊界潤滑能力，可有效地減少顳下頜關節運動過程的負荷，從而提供了顳下頜關節生長、發育所需要的穩定內環境。但是，潤滑素在髁突軟骨增殖層和肥大層中表達的具體作用及機制仍需要進一步的研究闡明。

參考文獻

[1]Embree M, Ono M, Kilts T, Walker D, Langguth J, Mao J, Bi Y, Barth JL, Young M.Role of subchondral bone during early-stage experimental TMJ osteoarthritis.J Dent Res,2011,90(11):1331-1338.

[2]Ruan MZ, Erez A, Guse K, Dawson B, Bertin T, Chen Y, Jiang MM, Yustein J, Gannon F, Lee BH.Proteoglycan 4 expression protects against the development of osteoarthritis.Sci Transl Med,2013,5(176):176ra34.

[3]Alquraini A, Garguilo S, D’Souza G, Zhang LX, Schmidt TA, Jay GD, Elsaid KA.The interaction of lubricin/proteoglycan 4 (PRG4) with toll-like receptors 2 and 4: an anti-inflammatory role of PRG4 in synovial fluid.Arthritis Res Ther,2015,17:353.

[4]Oksayan R, Sokucu O, Ucuncu N.Effects of bite-jumping appliances on mandibular advancement in growing rats: a radiographic study.Eur J Dent,2014,8(3):291-295.

[5]Tanaka E, Detamore MS, Tanimoto K, Kawai N.Lubrication of the temporomandibular joint.Ann Biomed Eng,2008,36(1):14-29.

[6]Hayashi M, Zhao C, Thoreson AR, Chikenji T, Jay GD, An KN, Amadio PC.The effect of lubricin on the gliding resistance of mouse intrasynovial tendon.PLoS One,2013,8(12):e83836.

[7]Bonnevie ED, Galesso D, Secchieri C, Cohen I, Bonassar LJ.Elastoviscous Transitions of articular cartilage reveal a mechanism of synergy between lubricin and hyaluronic acid. PLoS One,2015,10(11):e0143415.

[8]Leonardi R, Musumeci G, Sicurezza E, Loreto C.Lubricin in human temporomandibular joint disc: an immunohistochemical study.Arch Oral Biol,2012,57(6):614-619.

[9]Porto GG, Vasconcelos BC, Andrade ES, Silva-Junior VA. Comparison between human and rat TMJ: anatomic and histopathologic features.Acta Cir Bras,2010,25(3):290-293.

[10]Ohno S, Schmid T, Tanne Y, Kamiya T, Honda K, Ohno-Nakahara M, Swentko N, Desai TA, Tanne K, Knudson CB, Knudson W.Expression of superficial zone protein in mandibular condyle cartilage.Osteoarthritis Cartilage,2006,14(8):807-813.

(本文編輯：林燕薇)

Study of the expression of lubricin in condylar cartilage of puberty rats

ChenZheng,TuShaoqin,LuHongfei,MaiZhihui,ChenLin,ChenQi.

DepartmentofStomatology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,ChinaCorrespondingauthor,ChenZheng,E-mail: 278467653@qq.com

【Abstract】ObjectiveTo detect the expression of lubricin in the condylar cartilage of the puberty rats without interventions. MethodsTwenty five 5-week-old female Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into five groups (n=5). The animals were fed with ground pellets and sacrificed on 3-, 7-, 14-,21-and 30-d. The mandibular condyle tissues were prepared for H.E and immunohistochemical staining. Under inverted optical microscope, integrated optical density (IOD) of the area of positive lubricin was quantitatively analyzed. The expression levels of lubricin were measured and compared at different time points. ResultsCondylar cartilages presented with varying characteristics among different layers. Lubricin was expressed throughout the whole condyle. Lubricin was slightly expressed in the static zone. In the articular fibrous zone, lubricin was abundant in the chondrocyte cytoplasm of the superficial layer. In the proliferative zone, lubricin was distributed throughout the condylar cartilages. In the hypertrophic zone, lubricin was observed in the cytoplasm of hypertropic cartilage lacuna, with higher expression in the superficial layer than the deep layer. At the same time point, IOD values of the positive lubricin area in the proliferative zone were significantly higher compared with those in the hypertrophic zone of the posterior mandibular condyle (all P<0.05). In both the proliferative and hypertrophic zones, no significant changes were documented in the IOD values at varying time points (all P>0.05). ConclusionIn the condylar cartilage of the puberty SD rats, lubricin was stably and continuously expressed, creating a sound inner environment for physiological reconstruction of mandibular condyle and normal growth of the mandible.

【Key words】Puberty rats; Condylar cartilage; Lubricin

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.010

基金項目：廣東省醫學科學技術研究基金(201333)

(收稿日期：2016-01-18)

·基礎研究論著·

通訊作者，陳正，E-mail：278467653@qq.com