FSP1在小鼠巨噬細胞中的表達特征及其生物學意義

李必一，楊帆，李洋，王若雨，趙勇

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FSP1在小鼠巨噬細胞中的表達特征及其生物學意義

李必一，楊帆，李洋，王若雨，趙勇

【摘要】

目的探討 FSP1 在小鼠巨噬細胞中的表達特征及其在巨噬細胞功能的意義。

方法以 FSP1-GFP 小鼠作為研究對象，采用流式細胞染色檢測 FSP1 在小鼠巨噬細胞中的表達情況；應用多種細胞因子對 FSP1-巨噬細胞進行刺激，觀察 FSP1 的表達情況；應用過氧化氫（H2O2）對巨噬細胞進行氧化應激誘導，并觀察其 FSP1 的表達情況及上清中 FSP1 的濃度；流式檢測 FSP1-和 FSP1+的巨噬細胞細胞因子分泌情況及吞噬功能。

結果腹腔巨噬細胞和骨髓誘導來源的巨噬細胞均可被分為 FSP1+和 FSP1-兩群。隨著 H2O2刺激腹腔巨噬細胞時間延長，FSP1+巨噬細胞的比例下降，ELISA 檢測上清中的 FSP1 濃度增加；刺激 FSP1+和 FSP1-兩群巨噬細胞對 LPS 誘導的 IL-6、IL-12、TNF-α 等促炎性細胞因子無明顯差異；FSP1-的腹腔巨噬細胞對雞紅細胞及乳膠微球的吞噬能力高于 FSP1+巨噬細胞。

結論依據巨噬細胞對 FSP1 的表達可將巨噬細胞分為FSP1+和 FSP1-兩群。FSP1+巨噬細胞經 H2O2刺激分泌大量 FSP1 蛋白。這兩群巨噬細胞對促炎性細胞因子的分泌無明顯差異，但 FSP1-巨噬細胞的吞噬能力高于 FSP1+巨噬細胞。

【關鍵詞】鈣結合蛋白質類；巨噬細胞；吞噬能力

www.cmbp.net.cn中國醫藥生物技術, 2016, 11(3):236-241

作者單位：116001 大連大學附屬中山醫院腫瘤科（李必一、王若雨）；100101 北京，中國科學院動物研究所膜生物學國家重點實驗室（楊帆、李洋、趙勇）

成纖維細胞特異性蛋白（fibroblast-specific protein 1，FSP1）是屬于 S100 蛋白家族的一種與腫瘤轉移相關的鈣結合蛋白，多項臨床試驗證實FSP1 鈣結合蛋白在多種惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等轉移中發揮重要作用，并與預后不良具有高度相關性［1-6］。近年來，FSP1 在免疫細胞中的表達及其生物學作用越發受到人們的關注，并且多項研究表明 FSP1 與多種自身免疫性疾病，如銀屑病、關節炎等密切相關［7-8］。最近研究結果表明，FSP1+成纖維細胞促進胸腺上皮細胞的增殖以及細胞成熟［9］。然而盡管有報道顯示 FSP1 蛋白在小鼠的發育期間對巨噬細胞的分化和功能有著重要的作用［10］，但是 FSP1 在巨噬細胞中的表達情況以及其影響機制尚不清楚。本文主要研究 FSP1 在巨噬細胞的表達情況以及對巨噬細胞功能的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物6 ～ 8 周齡 FSP1-GFP 小鼠，由中國科學院生物物理研究所秦志海研究組提供，所有 SPF 級小鼠均按照中國科學院動物研究所實驗動物管理委員會規定飼養于本所 SPF 級 IVC 動物房，所有實驗均嚴格遵照國際實驗動物應用和管理條例進行。

1.1.2試劑及抗體牛血清白蛋白（BSA）、PBS（粉末）和 anti-F4/80-PE、anti-CD11b-PE-Cy5、anti-IL-12-PE、anti-IL-6-PE、anti-TNF-α-PE 等抗體購自美國 BD 公司；重組小鼠細胞因子 M-CSF 購自美國 Pepro Tech 公司；LPS 購自美國 Sigma 公司；S100A4 ELISA 試劑盒購自美國 Cloud-Clone公司；熒光染料 PKH26、乳膠微球購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養用 PBS 緩沖液沖洗小鼠腹腔取得腹腔灌洗液，將灌洗液 1700 r/min 離心5 min，用含 10% 胎牛血清及 100 U/ml 青霉素和0.1 mg/ml 鏈霉素的 DMEM 重懸并培養于 37 ℃、5% CO2培養箱中，靜置 2 h 后棄上清，底部貼壁細胞為巨噬細胞。取骨髓細胞培養于含 10% 胎牛血清以及 100 U/ml 青霉素和 0.1 mg/ml 鏈霉素的DMEM 培養液中，加巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）50 ng/ml 置于 37 ℃、5% CO2培養箱中，分別于第 3、5、7 天更換培養液，底部貼壁細胞為巨噬細胞。

1.2.2細胞表面分子染色及流式細胞術分析取來自小鼠腹腔巨噬細胞以及骨髓誘導來源巨噬細胞的單個細胞懸液，使每管細胞總數為 5 × 105個/100 μl，每管加入各種抗體 10 μl，輕輕混勻，4 ℃ 避光，靜置 30 min。PBS 洗 3 次后，用流式細胞儀檢測，應用 FCS Express V3 軟件進行分析。

1.2.3ELISA 實驗ELISA 試驗方法根據制造商的說明進行操作。將 ELISA 板用含 5% BSA 的PBS 在室溫下預包被至少 1 h。再用 PBS 洗 3 遍后將標準品和樣品加入預包被的 ELISA 板中，室溫下孵育 2 ～ 4 h。洗液洗 3 遍之后，在 30 ℃ 的條件下加入特異的細胞因子檢測抗體反應 1 h，隨后加入 Avidin-HRP A，于 30 ℃ 反應 1 h。在板中加入顯色劑，避光顯色 10 ～ 20 min 后用終止液終止反應，在 450 nm 測定 OD 值。

1.2.4巨噬細胞吞噬實驗將灌洗的腹腔細胞用完全 DMEM 培養液重懸，調整細胞濃度至 2.5 × 106個/ml，以每孔 200 μl 加入 48 孔板，貼壁 2 h后用溫 PBS 洗去未貼壁細胞，再加入 100 μl 完全DMEM，再加入 100 μl 不同濃度的 PKH26 標記的雞紅細胞（chicken red blood cell，cRBC）或直徑2 μm 帶有紅色熒光的乳膠微球，培育 2 h 后用溫育的 PBS 洗去未吞噬 cRBC 或乳膠微球，用冷PBS 吹下貼壁細胞，流式細胞儀分析巨噬細胞吞噬率。

1.3統計學處理

2　結果

2.1FSP1 在巨噬細胞的表達情況

應用 FSP1-GFP 報告基因小鼠觀察巨噬細胞中 FSP1 的表達情況。結果顯示，腹腔巨噬細胞約有 50% 細胞表達 FSP1（圖1A）。應用 M-CSF 誘導小鼠骨髓前體細胞向巨噬細胞分化，在誘導的3、5、7、9、11 d 分析巨噬細胞中 FSP1 的表達，其中約有 75% 表達 FSP1-GFP（圖1B）。無論是腹腔來源還是骨髓來源的巨噬細胞都可以依據 FSP1 的表達情況將其分為 FSP1+和 FSP1-兩亞群。

圖1　流式細胞儀檢測 FSP1 在腹腔巨噬細胞（A）和骨髓來源巨噬細胞（B）的表達情況Figure 1　Expression of FSP1 on peritoneal macrophages （A） and bone marrow derived macrophages （B） detected by flow cytometry

2.2FSP1+巨噬細胞在氧化應激刺激后可以釋放FSP1

應用 H2O2（125 μmol/L）分別處理 CD11b+F4/80+巨噬細胞 0 min、20 min、40 min、1 h、3 h 之后流式檢測 FSP1 的表達情況，結果表明 FSP1+巨噬細胞中 FSP1+的表達隨時間的延長而降低（圖2A、B），提示巨噬細胞中表達的 FSP1 可能分泌到胞外。ELISA 檢測發現 FSP1 在上清中的濃度確實隨時間的延長而增大（圖2C）。說明氧化應激誘導劑可以刺激 FSP1+巨噬細胞釋放 FSP1蛋白。

圖2　氧化應激誘導 FSP1+巨噬細胞釋放 FSP1（A：H2O2處理巨噬細胞后流式細胞術檢測 FSP1 的表達；B：H2O2處理不同時間后 FSP1+巨噬細胞的比例；C：ELISA 檢測上清中 FSP1 的濃度）Figure 2　FSP1+macrophage subset can release FSP1 by oxidative stress induction （A： Expression of FSP1 on macrophages after oxidative stress induction by H2O2； B： Percentage of FSP1+macrophages induced by H2O2； C： Concentration of FSP1 in supernatant detected by ELISA）

2.3FSP1-巨噬細胞與 FSP1+巨噬細胞功能差異比較

為了研究 FSP1-和 FSP1+巨噬細胞在功能上的區別，檢測了其細胞因子的分泌水平，結果顯示腹腔巨噬細胞（圖3A，B）在 LPS 刺激下，IL-6、IL-12、TNF-α 表達水平沒有明顯差異，熒光強度也沒有明顯差異。但是檢測巨噬細胞對雞紅細胞和乳膠微球的吞噬結果表明，FSP1-巨噬細胞的吞噬能力明顯高于 FSP1+巨噬細胞（圖4）。因此，FSP1-與 FSP1+巨噬細胞具有相似的炎性因子產生能力，但是 FSP1-巨噬細胞比 FSP1+巨噬細胞具有更強的吞噬功能。

3　討論

FSP1 是 S100 蛋白家族成員之一，作用于多種細胞，其生物功能主要集中在促進腫瘤的轉移方面。S100 蛋白家族只在脊椎動物有表達且具有特異性的表達圖譜，主要由 20 多個功能不同的成員組成。S100 蛋白通過與多種靶向蛋白包括酶、細胞骨架蛋白、受體、轉錄因子和核酸等的相互作用來參與調控細胞的增殖、分化、凋亡、Ca2+平衡、能量代謝、炎癥反應、遷移和入侵［11］。有報道證實FSP1 在膀胱癌中有表達，而且可以作為判斷遠處轉移復發以及遠處轉移存活率的一項標準［12］。在乳腺癌中，FSP1 是由腫瘤細胞或者基質細胞所分泌，通過重塑細胞骨架和增加腫瘤細胞的黏附作用，下調促凋亡相關基因 Bax 的表達和血管生成抑制因子血小板反應蛋白-1 基因的表達并且增加內皮細胞和腫瘤細胞 MMPs 的產生來促進腫瘤的轉移［13］。應用 FSP1 阻斷抗體 6B12 可以有效抑制原發灶和轉移灶內 T 細胞的招募，從而抑制了自發性乳腺癌模型的腫瘤生長和轉移［14］。

圖3　FSP1-巨噬細胞與 FSP1+巨噬細胞具有相似的分泌細胞因子能力（A：流式分析 FSP1+和 FSP1-巨噬細胞 IL-12、IL-6、TNF-α 的表達情況；B：柱狀圖顯示 FSP1+和 FSP1-巨噬細胞 IL-12、IL-6、TNF-α 的表達情況）Figure 3　FSP1-macrophage subset has similar ability to release inflammatory cytokines compared to FSP1+subset （A： Expression of IL-12、IL-6、TNF-α on FSP1+macrophage and FSP1-macrophages detected by flow cytometry； B： Expression of IL-12， IL-6，TNF-α on FSP1+macrophage and FSP1-macrophages）

不僅在腫瘤組織中，在小鼠和大鼠的各個組織器官和細胞中也有 FSP1 的表達，如脾臟、胸腺、骨髓、T 細胞、巨噬細胞以及中性粒細胞，尤其在腹腔巨噬細胞中表達量最高［15-16］。在自身免疫疾病如銀屑病中，FSP1 表達量升高可促進疾病發展［7］。另外，FSP1 促進關節炎患者外周血單核細胞通過TLR4 信號通路的炎性應答反應［8］，而在葡萄球菌感染引起的關節炎模型中，FSP1 敲除導致細菌清除率增加，對于葡萄球菌導致的關節破壞的保護作用也有所增強［17］。有研究表明在肝臟受損后，FSP1可以作為一群具有炎性特征的巨噬細胞的標記，其特點為高表達 COX2、骨調素、多種細胞因子（TNF、IL-1β、IL-6、IL-10）、抑癌蛋白 M 以及多種趨化因子 CCL3、CCL4、CCL7、CXCL1、CXCL2、CXCL10，而下調 MMP3 和 TIMP3 的表達［18］。類似的結果表明，肝臟中 FSP1 是由一群巨噬細胞所分泌并且在肝臟纖維化的進展期通過激活肝星狀細胞來促進肝臟纖維化的發展［19］。另外還有研究顯示，FSP1+成纖維細胞亞群對胸腺髓質上皮細胞的維持和再生也具有至關重要的作用，FSP1 敲除鼠的胸腺明顯減小且胸腺上皮細胞的數量也顯著降低［9］。眾所周知巨噬細胞是一種廣泛分布于全身組織的具有很強可塑性的天然免疫細胞，在天然免疫與適應性免疫以及維持機體的穩態中起到關鍵作用。相關報道顯示，FSP1 敲除后炎癥反應對巨噬細胞的趨化作用受損，FSP1 在對巨噬細胞趨化到炎癥局部組織這一過程中起關鍵的調控作用［20］。而 FSP1 對巨噬細胞的其他方面的影響以及機制尚不清楚。因此，本文主要研究巨噬細胞中 FSP1 的表達情況，探討 FSP1 對天然免疫細胞的生物學作用。為了進一步研究巨噬細胞的 FSP表達情況，應用 FSP1-GFP 小鼠檢測了腹腔以及骨髓來源的巨噬細胞中 FSP1 的表達情況，研究發現可以依據巨噬細胞表達 FSP1 的情況將其分為FSP1+以及 FSP1-兩群。FSP1+巨噬細胞經過氧化應激誘導劑 H2O2刺激以后，隨時間的推移FSP1+巨噬細胞比例降低且可以分泌大量 FSP1蛋白。由于巨噬細胞可以分泌大量促炎性細胞因子參與炎癥反應過程，如 IL-6、IL-12、TNF-α 等［21］，因此我們對比檢測了 LPS 刺激后兩群巨噬細胞對細胞因子的分泌情況的差異，結果顯示兩群巨噬細胞產生 IL-6、IL-12、TNF-α 的比例并沒有顯著的變化。而巨噬細胞的另一重要功能是吞噬凋亡細胞及外來病原微生物，在維持機體穩態及免疫應答中發揮重要作用。為了進一步驗證這兩群巨噬細胞的功能差異對巨噬細胞的吞噬功能進行了檢測，結果顯示FSP1-巨噬細胞無論是吞噬雞紅細胞還是吞噬乳膠微球的能力均較 FSP1+巨噬細胞有所增強。提示 FSP1 可能抑制巨噬細胞的吞噬能力。

綜上所述，FSP1 在腹腔巨噬細胞和骨髓誘導來源的巨噬細胞中都有表達。氧化應激條件下FSP1+巨噬細胞可以分泌大量的 FSP1 蛋白。在功能上，FSP1-巨噬細胞與 FSP1+巨噬細胞有著相似的分泌細胞因子的能力，但是吞噬能力強于 FSP1+巨噬細胞。FSP1 的表達可能會抑制巨噬細胞的吞噬能力。關于 FSP1 在巨噬細胞以及其他天然免疫細胞的表達情況以及其在腫瘤、炎癥性疾病和自身免疫性疾病中的生物學意義有待進一步研究。

圖4　FSP1-巨噬細胞比 FSP1+巨噬細胞具有更強的吞噬能力（A：流式檢測 FSP1-和 FSP1+腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的比例 PEM∶cRBC 為 1∶10；B：折線圖顯示腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力，*P ＜ 0.05；C：流式檢測 FSP1-和 FSP1+腹腔巨噬細胞吞噬乳膠微球的比例 PEM∶Beads 為 1∶30；D：折線圖顯示腹腔巨噬細胞吞噬不同比例乳膠微球的能力，*P ＜0.05）Figure 4　FSP1-macrophage subset had higher phagocytosis ability compared to FSP1+subset（A： Percentage of chicken red blood cells phagocytic by FSP1+macrophage and FSP1-macrophages detected by flow cytometry. PEM∶cRBC 1∶10； B： Line chart shows chicken red blood cells phagocytic by peritoneal macrophages，*P ＜ 0.05； C： Percentage of beads phagocytic by FSP1+macrophage and FSP1-macrophages detected by flow cytometry PEM ： Beads 1∶30； D： Line chart shows beads phagocytic by peritoneal macrophages，*P ＜ 0.05）

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Author Affiliations: Department of Oncology， the Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University， Dalian 116001， China （LI Bi-yi， WANG Ruo-yu）； State Key Laboratory of Membrane Biology， Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China （YANG Fan， LI Yang， ZHAO Yong）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):236-241

Expression and function of FSP1 on macrophages

LI Bi-yi， YANG Fan， LI Yang， WANG Ruo-yu， ZHAO Yong

【Abstract】

ObjectiveTo determine the expression of fibroblast-specific protein 1 （FSP1） on macrophages and its roles on macrophage functions.

MethodsFSP1-GFP reporter mice was used in the present study. Macrophages from FSP1-GFP mice were treated with H2O2and the FSP1 expression was detected by flow cytometry and ELISA in protein level. The expressions of cytokines and the phagocytosis on FSP1-or FSP1+macrophages were assayed by flow cytometry.

ResultsPeritoneal macrophages and bone marrow-derived macrophages can be divided into either FSP1+or FSP1-subpopulations. The percentage of FSP1+macrophages was decreased and FSP1 in the supernatant was increased after oxidative stress induction by H2O2stimulation. There was no significant difference between FSP1-and FSP1+macrophages on the expressions of pro-inflammatory cytokines like IL-6， IL-12 and TNF-α after stimulated with LPS. The phagocytosis on chicken red blood cells and latex beads of FSP1-macrophages was higher than FSP1+macrophages.

ConclusionsMacrophages can be divided into two subpopulations depending on the expression of FSP1. FSP1+macrophages can secret abundant FSP1 protein after H2O2stimulation. There is no significant difference between the two subpopulations of macrophages on the secret of cytokines， but FSP1-macrophages own higher phagocytosis ability than FSP1+macrophages.

【Key words】Calcium-binding proteins；Macrophages；Phagocytosis

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.007

通信作者：王若雨，Email：wry1963@sohu.com

收稿日期：2015-12-25

Corresponding Author:WANG Ruo-yu， Email： wry1963@sohu.com