丹參水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)TGF-β1活化細(xì)胞內(nèi)Smad與p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制作用

李展城　蔡大可　舒友平　千永香

1.廣州綠色醫(yī)藥科技有限公司，廣東　廣州　510515；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東　廣州　510095

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丹參水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)TGF-β1活化細(xì)胞內(nèi)Smad與p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制作用

李展城1蔡大可2舒友平1千永香1

1.廣州綠色醫(yī)藥科技有限公司，廣東廣州510515；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州510095

【摘要】目的：探究丹參水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)TGF-β1活化細(xì)胞內(nèi)Smad與p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制作用。方法：將腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同的藥物，誘導(dǎo)組加入20μg/ml的馬兜鈴酸進(jìn)行誘導(dǎo)；實(shí)驗(yàn)A1、A2、A3組，在誘導(dǎo)組的基礎(chǔ)上分別加入5、10、20μg/ml的丹參水溶性物質(zhì)SA-B；對(duì)照組不加任何藥物。細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72h后檢測(cè)各組的TGF-β1-mRND水平、培養(yǎng)液中TGF-β1的含量、Smad以及p38MAPK的表達(dá)進(jìn)行，記錄檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果：誘導(dǎo)組的TGF-β1-mRND水平、TGF-β1蛋白含量分泌與對(duì)照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)組的同期誘導(dǎo)組相比，水平顯著下降(P<0.05)。誘導(dǎo)組的Smad與p38MAPK合成趨勢(shì)明顯，而實(shí)驗(yàn)組Smad與p38MAPK的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。結(jié)論：丹參的水溶性物質(zhì)-SA-B對(duì)TGF-β1活化細(xì)胞內(nèi)Smad與p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路具有顯著的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】丹參水溶性物質(zhì)SA-B；TGF-β1；Smad；p38MAPK

研究發(fā)現(xiàn)，丹參水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)于TGF-β1活化細(xì)胞內(nèi)Smad與p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路具有顯著的抑制作用，表明丹參水溶性物質(zhì)SA-B在降低腎組織轉(zhuǎn)化因子-β1(TGF-β1)水平的過度表達(dá)方面，具有顯著的抑制作用[1]。研究采用丹參水溶性物質(zhì)SA-B，并借助馬兜鈴酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1，探究丹參水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)TGF-β1活化細(xì)胞內(nèi)Smad與p38MAPK的抑制作用。

1材料與方法

1.1試劑與藥品丹參水溶性物質(zhì)SA-B(批號(hào)：111871-201001，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，實(shí)驗(yàn)時(shí)配置成濃度分別為5、10、20μg/ml的三種試劑進(jìn)行使用。TGF-β1 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)；抗Smad抗體(美國(guó)CST公司)；抗p38MAPK抗體(美國(guó)CST公司)。腎小管上皮組織細(xì)胞。

1.2實(shí)驗(yàn)方法將腎小管上皮細(xì)胞用含2%胎牛血清的K-SFM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，取第6～7代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到80%融合時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)液[2]。12h以后進(jìn)行細(xì)胞分組。誘導(dǎo)組加入20μg/ml的馬兜鈴酸進(jìn)行誘導(dǎo)；實(shí)驗(yàn)組：分成A1、A2、A3三個(gè)小組，在誘導(dǎo)組的基礎(chǔ)上分別加入5、10、20μg/ml的丹參水溶性物質(zhì)SA-B；對(duì)照組不加任何藥物。觀察不同劑量的丹參水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)TGF-β1、Smad以及p38MAPK表達(dá)水平的影響。

1.3測(cè)定方法①采用熒光定量PCR檢測(cè)TGF-β1-mRND水平。②ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液中TGF-β1的含量，吸取培養(yǎng)液后分析取上清，并按照ELISA試劑盒的說明進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀讀取吸光度，并計(jì)算TGF-β1的含量。③用免疫印跡法檢測(cè)Smad以及p38MAPK的表達(dá)，在細(xì)胞分裂后提取蛋白定量，加入Smad抗體(1∶400)與p38MAPK(1∶400)抗體；過夜以后將HRP標(biāo)記的IgG(1∶500)加入[3]。放置1h后將ECL液加入，顯影后在暗室曝光，最后進(jìn)行圖像分析。以上三種測(cè)定方式，分別在每組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72h后進(jìn)行，記錄檢測(cè)結(jié)果。

2結(jié)果

2.1丹參水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)TGF-β1-mRND水平表達(dá)的影響誘導(dǎo)組的TGF-β1-mRND水平在刺激24、48h后持續(xù)上升，72h有所降低，但仍處于高水平，與對(duì)照組相比，P<0.05；實(shí)驗(yàn)組在采用丹參水溶性物質(zhì)SA-B進(jìn)行干預(yù)24、48h后，TGF-β1-mRND水平顯著下降，與誘導(dǎo)組相比，P<0.05;且在48h以后，TGF-β1-mRND的下降水平更加明顯(P<0.05)。見表1。

表1　TGF-β1-mRND蛋白含量表達(dá)情況比較

注：與對(duì)照組相比，△P<0.05；與誘導(dǎo)組相比，▲P<0.05。

2.2丹參水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)TGF-β1蛋白含量的影響誘導(dǎo)組的TGF-β1蛋白含量分泌增加，與對(duì)照組相比，P<0.05；在72h有所降低，但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而實(shí)驗(yàn)組的TGF-β1蛋白含量與同時(shí)期的誘導(dǎo)組相比，顯著下降。且在48h以后，丹參水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)TGF-β1的抑制作用隨著用量的增加而加強(qiáng)。見表2。

表2　TGF-β1蛋白含量表達(dá)情況比較

注：與對(duì)照組相比，△P<0.05；與誘導(dǎo)組相比，▲P<0.05；與A1組相比，○P<0.05；與A2組相比，●P<0.05。

2.3丹參水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)Smad與p38MAPK表達(dá)的影響誘導(dǎo)組的Smad與p38MAPK合成趨勢(shì)明顯，而實(shí)驗(yàn)組在采用丹參水溶性物質(zhì)SA-B干預(yù)后，Smad與p38MAPK的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。且在72h后，Smad與p38MAPK的高表達(dá)持續(xù)下降。見表3 。

表3TGF-β1蛋白含量表達(dá)情況比較

組別 Smad p38MAPK 24h48h72h24h48h72h誘導(dǎo)組76.3±5.293.6±15.5108.3±22.639.3±5.453.6±8.362.4±11.4實(shí)驗(yàn)組 64.1±4.1* 56.3±5.4* 42.4±2.1* 34.4±4.2* 31.2±3.7* 24.5±2.8*

3討論

丹參是臨床較為常見的一種藥材，在消炎、抗菌、抗凝血方面，具有顯著的作用，臨床上主要用于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)神經(jīng)的保護(hù)[4]。丹參酸是丹參中的水溶性活性成分，其中以丹參酸A和丹參酸B的活性最強(qiáng)，在抗脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基、保護(hù)心臟、心腦血管、防治動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等方面有顯著的生物活性，常用于心肌缺血再灌注損傷、心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞等的保護(hù)中。實(shí)驗(yàn)表明，丹參酸B在抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中的鈣離子超載、改善血栓素/前列環(huán)素(TXA2/PGI2)平衡系統(tǒng)、減少內(nèi)皮素(ET)及腫瘤壞死因子a(TNF-a)的釋放、降低缺氧/復(fù)氧損傷后內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)方面具有顯著作用。此外，丹參的水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)于降低腎組織TGF-β1的過度表達(dá)，抑制腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化與纖維化等具有顯著的作用[5]。研究結(jié)果顯示，丹參的水溶性物質(zhì)SA-B對(duì)于降低TGF-β1-mRND表達(dá)、抑制TGF-β1蛋白含量分泌具有顯著的作用，且對(duì)于TGF-β1活性細(xì)胞中的Smad與p38MAPK過量表達(dá)也有顯著的抑制作用。

綜上所述，丹參的水溶性物質(zhì)SA-B能夠抑制TGF-β1活化細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量分泌，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的Smad與p38MAPK也具有顯著的抑制作用。

參考文獻(xiàn)

[1]劉成海,劉平,胡義揚(yáng),等.丹酚酸B鹽對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1刺激肝星狀細(xì)胞活化與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2002,82(18):1267-1272.

[2]楊佳,張毅,秦彩玲,等.丹參、三七的有效部位對(duì)正常大鼠血小板粘聚性及TXA2、PGI2的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2004,10(5):21-24.

[3]武子朝,韓瑞旸,朱建彪,等.丹酚酸B通過抑制線粒體功能增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療敏感性[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,15(9):1636-1639.

[4]吳甜鶯,張雄,鄭永克,等.電針聯(lián)合丹酚酸B治療對(duì)衰老模型大鼠記憶障礙的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2015,37(6):467-469.

[5]陶艷艷,王曉玲,劉成海,等.丹酚酸B對(duì)NIH/3T3成纖維細(xì)胞TGF-β1/ERK胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(2):192-195.

基金項(xiàng)目：2014年建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研立項(xiàng)(20141028)，課題名稱：LXRaSUMO/LDLR通路研究活血藥丹參降血脂作用機(jī)理。

作者簡(jiǎn)介：李展城(1977-)，男 ，副主任藥師，執(zhí)業(yè)中藥師，主要從事藥學(xué)研究、藥事管理工作。

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)09-0018-02

(收稿日期：2016.03.17)