漿膜腔積液細胞塊全切片掃描圖像作為初始診斷的可行性研究

李媛媛，鐘 琴，胡佐鴻

(成都市第一人民醫院病理科，四川 成都 610041)

漿膜腔積液細胞塊全切片掃描圖像作為初始診斷的可行性研究

李媛媛，鐘 琴，胡佐鴻

(成都市第一人民醫院病理科，四川 成都 610041)

目的 探討全切片掃描圖像技術在漿膜腔積液細胞塊初始診斷中的可行性。方法 回顧成都市第一人民醫院病理科2015年1～12月318例漿膜腔積液細胞塊病理資料，采用優納第四代全自動數字切片掃描系統掃描玻片，存入電腦。所有玻片均由同一位病理主治醫生獨立重新閱片分析。觀察者先進行原始玻片傳統光學顯微鏡判讀，5周后再于電腦上判讀數字切片。閱片結束后，計算分析光學顯微鏡上判讀與電腦數字切片判讀的的可重復性。結果 全切片掃描圖像診斷與傳統光學顯微鏡診斷的，Kappa值0.91。所有的診斷差異性出現在可疑腫瘤病例，在良性與惡性病例之間沒有診斷差異性。結論 數字切片掃描圖像技術可用于細胞塊初始診斷。

全切片掃描圖像；傳統光學顯微鏡；數字切片；漿膜腔積液；細胞塊

數字切片掃描與應用系統通過全自動顯微鏡掃描平臺，掃描與控制軟件系統，集光學、自動化、計算機與圖像處理、網絡等技術，將傳統的玻璃切片進行掃描和無縫拼接，生成包括傳統玻璃切片內所有信息，即一整張全視野高分辨率的數字化切片(whole slide imaging，WSI)，也稱虛擬病理切片(virtual slide of pathology)。數字切片技術經過二十余年的發展完善，已有多項不同的病理實踐，目前國內的應用主要包括：病理質量控制[1]、遠程病理會診[2，3]、病理科研教學[4，5]、病理切片存檔、病理讀片等[6]，均取得了很大的進展。但是，全切片掃描圖像技術作為病理科常規一線病理診斷應用還不多。隨著WSI技術的日益成熟，高分辨率數字圖像的獲得，把WSI作為常規應用的時機已經成熟。但在臨床病理一線診斷實踐之前，WSI的這一應用的有效性需要得到證實，這便需要比較同一病理圖像在WSI與傳統光學顯微鏡(conventional microscopy，CM)之間觀察者內的可重復性。按照美國病理家學會(College of American Pathologist，CAP)關于WSI用于病理診斷目的驗證指南[7]，這一比較應在所有臨床面對的病理診斷實踐中實施，包括石蠟切片、冰凍切片、免疫組化、細胞學等。本文比較了在漿膜腔積液細胞塊切片中，同一觀察者在WSI與CM之間的診斷重復性。本文將成都市第一人民醫院病理科2015年的細胞塊HE掃描圖像的判讀與光學顯微鏡下的判讀結果比較，以探討全切片掃描圖像技術在漿膜腔積液細胞塊診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集成都市第一人民醫院病理科2015年1～12月的漿膜腔積液細胞塊病理資料共318例，年齡7～93歲，平均年齡65歲。男209例，女109例。其中，胸水細胞塊242 例，腹水細胞塊62例，心包積液細胞塊14例。318例細胞塊切片中，原始診斷惡性腫瘤共90例，其中腺癌共82例，小細胞癌3例，鱗癌3例，間皮瘤1例，淋巴瘤1例；可疑惡性70例；未見惡性病變共158例。

1.2 方法 細胞塊制作標本離心后甲醛固定，酒精脫水，再離心取沉渣，石蠟包埋切片，HE染色。玻片掃描采用北京優納科技有限公司PRECICE600×8全自動數字切片掃描系統掃描不同切片，快速線性掃描玻片，40倍掃描，可一次性掃描240張(用時約23個小時)，共掃描318張。所有玻片均由同一位病理主治醫生獨立重新閱片分析。WSI瀏覽閱片軟件采用北京優納科技有限公司PRECISE iViewer(軟件版本5.2.10.0)，電腦顯示器DELL U2312，分辨率1920×1080。

在第一階段，觀察者進行原始玻片光學顯微鏡判讀，閱片結束5周后再于電腦上進行隨機編號數字切片判讀，為觀察者提供每例細胞塊切片的原始基本臨床信息，隱藏細胞塊切片原始診斷結果。判讀結果參照Nathan細胞塊四分類診斷[8]，簡化分為惡性腫瘤(主要包括腺癌、小細胞癌、鱗癌、淋巴瘤、間皮瘤等)，可疑惡性腫瘤，未見惡性腫瘤三個大類。閱片結束后，計算分析第一次光學顯微鏡上判讀與第二階段電腦數字切片判讀的可重復性。可重復分為三類：一致(兩次診斷完全相同)、基本一致(惡性診斷為可疑惡性，或反之)、不一致(惡性或可疑惡性診斷為良性，或反之)。最后，計算重復性完全一致的百分比及95%的可信區間。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學處理。計算兩次判讀完全一致的百分比(95%的可信區間)。對觀察者兩次的判讀結果一致性采用Kappa系數(κ值)判定。判定標準為：κ≤0.00時，無意義；κ=1時，表明2次觀察結果完全一致；0.00<κ≤0.40時，表明2次觀察一致性差；0.40<κ≤0.60時，表明兩者一致性中度；0.60<κ≤0.80時，表明兩者有較高的一致性；κ>0.80時，表明兩者有極好的一致性。

2 結果

318例細胞塊切片，有18例掃描不成功(15由于機器故障造成，3例由于切片質量原因)，實際納入分析的細胞塊切片共300例。第一次光鏡閱片與第二次數字閱片結果可重復性比較見表1。

表1 光鏡閱片CM與數字閱片WSI結果重復性比較 (n=300)

兩次閱片完全一致的共284例，診斷Kappa值0.91。基本一致的7例，不一致的9例。所有的診斷不一致出現在可疑惡性病例，在良性與惡性病例之間沒有診斷不一致。

3 討論

3.1 細胞塊及WSI的特點 在腫瘤的防治及診斷中，細胞病理學占有重要的地位。但是，相較與組織病理學，由于細胞學不具備組織結構特征，因此又存在顯著的局限性。近年來逐漸開展的細胞塊技術明顯縮小了細胞學與組織學之間的差距，主要表現在：一方面，細胞塊切片顯示出了細胞團塊的微小結構特征，接近微小組織活檢；另一方面也是最重要的一面，細胞塊切片可以進一步行免疫細胞化學染色[9]，在良惡性的鑒別及病理分型中發揮了舉足輕重的作用。雖然細胞塊的免疫細胞化學如此重要，但與組織學標本比較，受標本本身的特點及取材限制，細胞塊一般較小，經細胞塊切片及免疫細胞化學檢測后，一般所剩不多。因此，細胞塊切片的保存就相當重要。但是，隨時間的流逝，染色會褪色或模糊，尤其是免疫細胞化學切片毀損或褪色后無法再生。因此，尋找細胞學玻片的良好保存方法勢在必行。

WSI是近年出現的新技術[10，11]，由于能夠對切片信息全數字化儲存，永久保存，可能是一種很好的替代保存方式，不存在玻片損壞、丟失及褪色風險。數字切片閱讀能夠模擬光鏡觀察如在平面X軸-Y軸移動及放大觀測倍數，數字切片閱讀還能夠提供另外的特點，如任何方向方便的圖片移動導向，系統觀察整張切片，避免漏掉局部區域，多張圖片同時觀察，同一切片的不同染色并列比較，連續變焦放大縮小，多人同時閱片討論，這都更有利于圖片觀察(圖1a)。在病理學醫、教、研實踐中，數字切片具有傳統切片的所有功能，借助網絡具有閱片不受空間與時間限制的優點。

3.2 細胞塊應用于WSI的優勢 WSI用于能否用于細胞塊初始診斷，還需要病理實踐印證，其前提是全切片掃描圖像的判讀要與CM下的判讀具有可重復性。關于這類可重復性研究在組織病理學診斷中近來有較多報道，包括常規外科病理[12]及胃腸[13]、泌尿[14]、乳腺[15]、前列腺[16]專科組織系統。與組織學研究相比，細胞學的WSI研究不多，而且，細胞學涂片的獨自特點如涂片厚薄不均，重疊，背景模糊是對數字化切片的挑戰，而這類問題在日常光鏡下通過上下調焦觀察不同平面是容易得到解決的。雖然3D多平面掃描技術也即WSI的Z軸堆疊掃描(Z-stacking)也可以解決上述細胞學涂片的問題，但成本高，掃描耗時長，操作麻煩，并不利于細胞學WSI的開展。然而，與組織學切片一樣，細胞塊切片能夠避免上述細胞涂片問題，這也是細胞塊技術優于傳統涂片的特點之一。因此，依靠細胞塊技術，細胞學可以有效地與WSI聯姻。

圖1 漿膜腔積液細胞塊不同病理改變WSI瀏覽顯示器界面截圖(右上方為縮略圖) a.細胞塊切片外觀，包括切片編號及細胞塊形態;b.良性病變,可見間皮細胞、淋巴細胞及中性粒細胞(×40);c.腺癌,核仁明顯，核膜增厚，可見腺體結構(×40);d.鱗癌,細胞成巢，核仁明顯(經免疫細胞化學證實,×40);e.小細胞癌,細胞胞質稀少，鑲嵌狀排列明顯(經免疫細胞化學證實,×40);f.可疑腺癌,細胞形態溫和，可見腺樣結構(最后經免疫細胞化學證實為間皮瘤,×20)

細胞塊的WSI研究有少量報道[17，18]，Tawfik報道了婦科液基剩余標本細胞塊的WSI研究，證實液基細胞塊WSI是可行的一種選擇，能夠有效發現宮頸微生物及良性反應性改變；并與原始液基細胞學結果比較，證實婦科液基細胞塊WSI發現異常細胞的敏感性與液基涂片一致，并顯示出檢出LSIL與HSIL更高的特異性。關于非婦科的體液細胞塊的WSI研究尚未見報道。在本研究中，我們發現細胞塊切片的WSI能夠完全再現在光鏡下的細胞學特征，明確顯示胸水、腹水、心包積液中的良性細胞如間皮心包、淋巴細胞及中性粒細胞等(圖1b)；能夠發現惡性腫瘤細胞如腺癌(圖1c)、鱗癌(圖1d)、小細胞癌(圖1e)；可以觀察到腺癌的核仁、腺腔，鱗癌的角化，小細胞癌的粉塵染色質、鑲嵌排列等細微特征。

3.3 細胞塊WSI與CM閱片的可重復性 在本研究中，兩次閱片完全一致的共284例，診斷κ=0.91。所有的診斷基本一致及不一致都與可疑惡性病例相關，在良性與惡性病例之間沒有診斷不一致。本研究95%可重復性與其他學者報道的可重復性基本一致，Houghton在普外科病理報道的重復性為95%[12]，Janabi在胃腸[13]、泌尿[14]、乳腺[15]等專科領域報道的可重復性分別為95%、87%、93%。

基本一致的7例中，4例WSI診斷為可疑惡性，而CM診斷為惡性；3例WSI診斷為惡性，而CM診斷為可疑惡性。重新回顧這7例，發現其共同特征是異型性細胞惡性特征明確，但是數量少，診斷者在作出惡性或可疑惡性的尺度把握上重復性不好造成的，并非WSI本身的缺陷造成。這類輕度的不一致也不具有明顯的臨床及預后意義，對待可疑惡性，我們一般通過再次送檢標本或在細胞塊切片上做免疫細胞化學檢測都能夠最終明確診斷(圖1f)。

不一致的9例中，3例WSI診斷為未見惡性，而CM診斷為可疑惡性；6例WSI診斷為可疑惡性，而CM診斷為未見惡性。重新回顧這9例，發現其共同特征是異型性細胞惡性特征模棱兩可，即我們常說的核異質細胞，診斷者在做出良性或可疑惡性的尺度把握上重復性不好造成的，也并非WSI本身的缺陷造成。這類不一致其實在診斷者兩次光鏡下不同時段診斷也可能出現，即診斷者內的可重復性變異，Reyes等[19]在WSI與CM的可重復性研究中，比較了診斷者內兩次不同時段CM閱片的可重復性變異性，發現三位不同病理學者的可重復性變異分別為4%、7%、0%，平均3.7%。

綜上所述，我們的研究顯示WSI可較好地用于細胞塊初始診斷。

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Whole slide images of serous effusion cell blocks for the primary diagnosis：A feasibility study

LI Yuan-yuan，ZHONG Qin，HU Zuo-hong

(Department of Pathology，Chengdu First People’s Hospital，Chengdu 610041，China)

HUZuo-hong

Objective To investigate the feasibility of whole slide imaging (WSI) of serous effusion cell blocks for the primary diagnosis.Methods Serous effusion cell blocks from 318 cases between January 2015 and December 2015 at our department were retrospectively reviewed.Each slide was digitally scanned by UNIC fourth generation digital section scanning system and the images were stored in a shared file.All slices were independently reviewed by the same pathologists.The observers first reviewed the glass slides under conventional microscopy (CM) and then reviewed the digital images in an interval of 5 weeks.After finishing all cases，reproducibility of WSI versus CM were analyzed.Results The diagnostic reproducibility for WSI versus CM was 95% CI (0.93～0.97).κ= 0.91.All diagnostic disagreements were found in suspicious malignancy.There was no intra observer disagreement in the diagnosis of benign versus malignant diseases.Conclusion WSI could be used for the initial diagnosis of serous effusion cell blocks.

Whole slide imaging； Conventional microscopy； Digital slide；Serous effusion；Cell block

胡佐鴻

R361

A

1672-6170(2016)04-0089-04

2016-02-13；

2016-05-04)