響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

徐莉莎，石彥國，秦可欣，何國慶（.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱　50076；.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州　30058）

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響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

徐莉莎1，*石彥國1，秦可欣1，何國慶2
（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

摘要：通過對靈芝菌絲體進(jìn)行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，用響應(yīng)面法對其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。在篩選碳源、氮源種類及濃度、單因素對靈芝產(chǎn)葡萄糖苷酶影響的基礎(chǔ)上，利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計獲得靈芝菌株發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最佳培養(yǎng)基為麥芽汁7.10%，豆粕煮汁1.62%，酵母浸粉1.93%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH值5.5，酶活3.18 U/mL，生物量可達(dá)3.01 g/100 mL。優(yōu)化后的培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，β-葡萄糖苷酶酶活和生物量分別提高了187%和160%，為利用靈芝菌絲體的微生物轉(zhuǎn)化研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：靈芝菌絲體；β-葡萄糖苷酶；響應(yīng)面法

靈芝（Ganoderma Lucidum），隸屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌目、靈芝菌科、靈芝屬，是一種非常珍貴的食、藥兼用真菌。靈芝的生理活性成分較多，主要有靈芝多糖、靈芝酸［1-2］，具有顯著的抗腫瘤［3］、降血糖［4］、保肝［5］、抗病毒以及改善免疫系統(tǒng)功能等作用。靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體的技術(shù)比子實(shí)體的生產(chǎn)周期短［6］、生產(chǎn)量大，容易控制。

β-葡萄糖苷酶（β- 1，4- glucosidase），是纖維素酵系的一個組成部分，能夠?qū)⒗w維二糖或其他可溶性的纖維寡糖水解成葡萄糖分子［7］，消除纖維二糖及纖維寡糖對葡聚糖內(nèi)切酶和葡聚糖外切酶的反饋抑制作用，顯著提高纖維素酶的降解作用［8］。在國外已經(jīng)出現(xiàn)用灰樹花等食用菌的發(fā)酵液轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷，與多糖進(jìn)行復(fù)配用于治療抗腫瘤［9］的研究。

本文采用響應(yīng)面法提高1株現(xiàn)有靈芝菌株發(fā)酵液產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力，確立一種有效的提高靈芝產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活的培養(yǎng)基成分。利用單因素法和響應(yīng)面法對其產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，以得到利于產(chǎn)酶、成本較低且利用價值較大的培養(yǎng)基配方。

1　材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

赤芝（Ganoderma Lucidum），河南省科學(xué)院食用菌工程技術(shù)中心保藏；對硝基苯酚（pNP）、對硝基苯基-β- D-葡萄糖苷（pNPG）、酵母浸粉，阿拉丁試劑有限公司提供；PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、瓊脂、VB1等，均為分析純，均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基（%）：PDB 3.5，蛋白胨0.5，酵母浸粉0.3，KH2PO40.3，MgSO40.15，VB10.005，pH值5.5；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（%）：葡萄糖2，蛋白胨1，KH2PO40.3，MgSO40.15，VB10.005，pH值5.5。

1.2 方法

1.2.1菌種培養(yǎng)方法

（1）斜面培養(yǎng)。將保存在- 4℃的靈芝菌株28℃活化30 min，接種至斜面培養(yǎng)基上，放置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～9 d至斜面長滿菌絲為止。

（2）種子培養(yǎng)。經(jīng)活化的斜面菌種接種到250 mL搖瓶中，裝液量為100 mL，置28℃搖床中，以轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)8 d。

（3）深層發(fā)酵培養(yǎng)。250 mL三角瓶中裝100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10%，置于28℃搖床中，以轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)6 d。

1.2.2生物量測定

每次取1瓶發(fā)酵液抽濾，沉淀的菌絲體用蒸餾水清洗后離心，反復(fù)2次，菌體在60℃下烘干至恒質(zhì)量，稱得生物量。

1.2.3酶活測定

將經(jīng)發(fā)酵6 d的發(fā)酵液抽濾，分離菌絲體和發(fā)酵液。發(fā)酵液稀釋后用比色法測定胞外β-葡萄糖苷酶酶活，菌絲體經(jīng)無菌水多次洗滌，測定胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶酶活，最后將胞內(nèi)與胞外的酶活相加，即為靈芝深層發(fā)酵液總酶活。

采用比色法，以對硝基苯基-β- D-葡萄糖苷（pNPG）為底物進(jìn)行酶解，底物水解后釋放出來的對硝基苯酚于400～420 nm可見光范圍內(nèi)有特征吸收峰，可直接于400～420 nm比色測定［10］。

1.3試驗(yàn)設(shè)計

1.3.1單因素試驗(yàn)

（1）碳源及碳源濃度。將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖分別替換為麥芽汁、蔗糖、土豆、玉米粉和可溶性淀粉，在28℃，以轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)條件下，發(fā)酵培養(yǎng)6 d后測定靈芝菌絲體中β-葡萄糖苷酶酶活，從而確定適合靈芝菌絲體產(chǎn)酶的最佳碳源。在確定最佳碳源后，其他條件不變，做不同濃度的碳源試驗(yàn)。

（2）氮源及氮源濃度。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源蛋白胨分別用等量的酵母浸粉、麩皮、豆粕煮汁、牛肉膏和硫酸銨代替，保持溫度28℃，以轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)條件，發(fā)酵培養(yǎng)6 d后測定粗酶液中β-葡萄糖苷酶酶活，以確定適合靈芝菌絲體產(chǎn)酶的最佳氮源。在確定最佳氮源后，其他條件不變，做不同濃度的碳源試驗(yàn)。

1.3.2響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design- Expert軟件進(jìn)行CCD中心組和試驗(yàn)設(shè)計，并對其結(jié)果進(jìn)行方差分析。

CCD試驗(yàn)因素與水平設(shè)計見表1。

表1　CCD試驗(yàn)因素與水平設(shè)計　/%

2　結(jié)果與討論

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1不同碳源對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響

不同碳源對靈芝菌株發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響見圖1。

圖1　不同碳源對靈芝菌株發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響

碳源是靈芝菌株生長過程中主要的營養(yǎng)成分，由圖1可看出，不同碳源對靈芝菌株發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶有不同的影響。當(dāng)碳源為麥芽汁時，靈芝液體發(fā)酵所得生物量最高，可達(dá)到1.863 5±0.04 g/100 mL，酶活U為1.039 8±0.01 mL。

麥芽是啤酒生產(chǎn)中主要的原料，其主要成分有碳水化合物70%～85%，蛋白質(zhì)10.5%～12.5%，無機(jī)物2%～4%，脂肪1.5%～2%；碳水化合物包括淀粉、單糖、纖維素、半纖維素等。本試驗(yàn)所用麥芽汁是根據(jù)EBC法，把麥芽糖化成麥芽汁，水解得到多種碳水化合物，包括麥芽糖、糊精、葡萄糖、可溶性的含氮物質(zhì)、樹膠及部分無機(jī)物，具有成本低廉、來源廣泛的特點(diǎn)，更益于微生物培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)。將麥芽糖化汁作為靈芝深層液體發(fā)酵碳源，以獲得產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的報道至今未見。

2.1.2氮源對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

氮源對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響見圖2。

由圖2可以看出，當(dāng)?shù)词嵌蛊芍笾瓡r，酶活最高，可達(dá)到1.644 7±0.02 mL，豆粕作為價格低廉的工業(yè)廢料，蛋白質(zhì)含量高。而當(dāng)酵母浸粉為氮源時，生物量顯著增多，為1.900 4±0.04 g/100 mL。因此，為保證酶活較高水平的同時，提高生物量，選擇豆粕煮汁和酵母浸粉最為復(fù)合氮源。

圖2　氮源對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響

2.1.3麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響見圖3。

圖3　麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響

由圖3可以看出，麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)有5個梯度，分別為2%，4%，6%，8%，10%，隨著麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，菌絲酶活及生物量均有所提高。當(dāng)麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時，菌絲酶活和生物量達(dá)到最高，分別為2.986 3±0.04 U/mL，2.252 8±0.12 g/100 mL；但當(dāng)麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時，菌絲酶活和生物量分別降至1.864 7±0.05 U/mL，1.265 3±0.08 g/100 mL，主要是由于過高麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)會引起過高的細(xì)胞滲透壓，不利于菌絲生長。因此，選取4%～8%麥芽汁作為進(jìn)一步試驗(yàn)的范圍。

2.1.4豆粕煮汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

豆粕煮汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響見圖4。

由圖4可以看出，豆粕煮汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)有5個梯度，分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，菌體酶活和生物量都隨著豆粕煮汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而上升，生物量從1.5%開始無明顯變化。因此，選取1.5%～2.0%的豆粕煮汁作為進(jìn)一步試驗(yàn)的范圍。

2.1.5酵母浸粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

酵母浸粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響見圖5。

圖4　豆粕煮汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響

圖5　酵母浸粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶及生物量的影響

由圖5可以看出，酵母浸粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)有5個梯度，分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，菌體酶活隨酵母浸粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而顯著升高，生物量從質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%開始維持到較高水平后無明顯變化。因此，選取1.5%～2.5%的酵母浸粉作為進(jìn)一步試驗(yàn)的范圍。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

采用Central Composite Design響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基［11］。

CCD試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。

菌絲酶活Y1與生物量Y2的多項(xiàng)式回歸方程如下：

Y1=3.13+0.17A+0.088B- 0.027C- 0.19AB+ 6.25AC+0.004 1BC- 0.25A2- 0.27B2- 0.26C2.

Y2=2.89+0.17A- 0.11B- 0.069C+0.016AB+ 6.25AC- 3.75BC- 0.11A2- 0.15B2- 0.16C2.

二者模型p<0.000 1，說明二次回歸模型是顯著的，擬合程度較好，預(yù)測值與實(shí)測值之間有高度的相關(guān)性，可以應(yīng)用于β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)的理論預(yù)測。

用Design- Experts軟件繪制出響應(yīng)面分析圖，固定其中1個變量，研究其他2個變量的交互作用對各響應(yīng)值的影響。

各因素交互影響靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活的響應(yīng)面見圖6，各因素交互影響靈芝生物量的響應(yīng)面見圖7。

由圖6和圖7可以看出，響應(yīng)面均為開口向下，說明響應(yīng)值在試驗(yàn)變化范圍內(nèi)存在極高值。根據(jù)圖6的曲面圖，培養(yǎng)基中麥芽汁對酶活的影響最為顯著，曲線較陡。根據(jù)等高線圖，麥芽汁與豆粕煮汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)對靈芝菌株酶活的交互影響作用最為顯著，等高線最密集。隨著麥芽汁、豆粕煮汁和酵母浸粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，菌絲酶活和生物量均會隨之增加，但是過高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)會抑制菌絲生長，其酶活也會隨之減少。

表2　CCD試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

試驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測：當(dāng)麥芽汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.10%，豆粕煮汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.62%，酵母浸粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.93%時，菌絲酶活及生物量分別可達(dá)到3.142 5 U/mL，2.973 5 g/100 mL。將預(yù)測結(jié)果進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，所得菌絲酶活及生物量分別為3.18±0.06 U/mL，3.013 6±0.79 g/100 mL，與預(yù)測值接近，表明該模型對于優(yōu)化靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基具有可行性。因此，將麥芽汁7.10%，豆粕煮汁1.62%，酵母浸粉1.93%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH值5.5作為高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶靈芝菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)基條件。

3　結(jié)論

圖6　各因素交互影響靈芝產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活的響應(yīng)面

圖7　各因素交互影響靈芝生物量的響應(yīng)面

本研究采用響應(yīng)面分析法，對靈芝菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的深層發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，效果顯著。確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麥芽汁7.10%，豆粕煮汁1.62%，酵母浸粉1.93%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH值5.5，使得β-葡萄糖苷酶酶活和生物量分別提高了187%和160%，并首次采用麥芽汁作為培養(yǎng)靈芝發(fā)酵液的碳源，以提高β-葡萄糖苷酶酶活。同時，說明用響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝菌絲體產(chǎn)酶的培養(yǎng)基是有效可行的。

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Optimization of the Medium Composition for Production of β- glucosidase by Ganoderma Lucidum Using Response Surface Methodology

XU Lisha1，*SHI Yanguo1，QIN Kexin1，HE Guoqing2
（1. Food Science and Engineering College，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China；2. College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 310058，China）

Abstract：Optimization of the medium composition for production of β- glucosidase by Ganoderma Lucidum is studied in this article. Effect of the type and concentration of carbon and nitrogen source is investigated. Based on the result，the response surface methodology is used to optimize the medium and the result listed as follows：malt extract 7.10%，bean pulp 1.62%，yeast extract 1.93%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH 5.5. Under these conditions mycelial biomass and β- glucosidase activities in the fermentation mycelia achieved at 3.38 U/mL，3.01 g/100 mL，and increased by 187%，160% respectively compared with the basic medium，which laid the foundation for the further study of Ganoderma Lucidum bioconversion.

Key words：Ganoderma Lucidum；β- glucosidase；response surface methodology

中圖分類號：Q815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.04.031

文章編號：1671- 9646（2016）04b- 0006- 04

收稿日期：2016- 03- 17

作者簡介：徐莉莎（1988—），女，在讀碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通訊作者：石彥國（1960—），男，碩士，教授，研究方向?yàn)榇蠖辜庸ぜ夹g(shù)。