玉米轉錄因子WRKY76克隆及抗紋枯病表達模式分析

高文成， 李　玥， 張銀超， 張志明， 潘光堂， 林海建*

( 1. 四川農業大學 玉米所/農業部西南玉米生物學與遺傳育種重點實驗室， 成都 611130； 2. 綿陽農業科學研究院， 四川 綿陽 621000 )

玉米轉錄因子WRKY76克隆及抗紋枯病表達模式分析

高文成1， 李玥2， 張銀超1， 張志明1， 潘光堂1， 林海建1*

( 1. 四川農業大學 玉米所/農業部西南玉米生物學與遺傳育種重點實驗室， 成都 611130； 2. 綿陽農業科學研究院， 四川 綿陽 621000 )

摘要：玉米紋枯病是影響玉米產量和品質的重要病害之一。轉錄因子WRKY家族部分成員能夠調控水楊酸和茉莉酸甲酯信號傳遞方式來激發防衛反應基因的表達。在NCBI上檢索玉米中WRKY家族成員及擬南芥中抗病相關的WRKY家族成員，利用CLUSTAL X和MEGA5.05構建系統進化樹，發現轉錄因子WRKY76可能參與玉米抗紋枯病的調控途徑。該研究以玉米抗紋枯病材料R15和感病材料Ye478為對象，在玉米拔節期接種立枯絲核菌AG1-IA，首先分別于接菌前(對照)和接菌后1、2、4、6、12、24 h取葉鞘；然后分別進行水楊酸和茉莉酸甲酯脅迫處理，分別于處理前(對照)和處理后1、2、4、6、12 h取葉鞘，提取RNA，實時熒光定量PCR分析WRKY76轉錄因子基因在玉米葉鞘組織中不同脅迫條件下的差異表達。結果表明：在立枯絲核菌AG1-IA脅迫下，WRKY76轉錄因子基因在脅迫后1 h表達量達最大值，抗病材料R15的相對表達量高于感病材料Ye478且差異顯著(P≤0.05)；經水楊酸(Salicylic Acid, SA)處理，WRKY76在抗感材料中表達趨勢相似，在感病材料掖478中,WRKY76被誘導而顯著地上調表達,在抗病材料中,相對表達量峰值出現在脅迫后4 h,且相對表達量低于感病材料掖478。經茉莉酸甲酯(Methyl jasmine, MeJA)處理，WRKY76基因在感病材料中呈現下調表達趨勢。WRKY76基因在1 h表達量為對照的0.6倍,其他調查時間點基本都在0.1～0.3之間。在抗病材料R15中,WRKY76基因表達呈現上升趨勢,變化趨勢不明顯。這表明WRKY76轉錄因子基因能夠被病原物、SA、MeJA誘導表達，可能參與植物抗紋枯病調控途徑。

關鍵詞：紋枯病， 轉錄調控因子， WRKY基因， 實時熒光定量PCR

玉米是重要的糧食作物和工業原料，其產量的穩定對國民經濟的發展和確保我國糧食安全具有重要意義，但生物和非生物逆境脅迫一直是限制玉米高產穩產重要因素。玉米紋枯病是典型的生物逆境，尤其以西南地區最為嚴重，對該地區玉米的生長、發育、產量和品質均構成嚴重不利影響(唐海濤等, 2004; 楊俊品等, 2005)。植物經過長期的進化和自然選擇，形成了由多條抗性途徑在不同時空水平上交叉、重疊而成的復雜的抗性機制和多種表現的抗性形式。在病原菌侵染植物時，激發了病程相關蛋白(pathogenesis-related，PR)基因、組蛋白甲基化基因及染色質重塑基因的表達，這些基因的表達能被植物激素水楊酸(salicylic acid, SA)及茉莉酸(jasmonic acid, JA)調控，激活防衛反應基因的表達從而使植物表現出抗性(Spoel & Dong, 2012)。轉錄因子WRKY家族部分成員能調控SA及JA信號傳遞(Li et al, 2004; Mao et al, 2007)。在真核生物中，WRKY轉錄因子是分布最為廣泛、最為保守的一類蛋白，廣泛參與植物的激素反應、生長發育、逆境脅迫以及防御反應等生理生化過程(Eulgem et al, 2000; Eulgem & Somssich, 2007)，在擬南芥(Qin et al, 2013)、水稻(Baldoni et al, 2013)、煙草(Li et al, 2012)、棉花(Sun et al, 2012)等植物中均有WRKY轉錄因子基因功能的報道，這類基因能顯著提高植物的抗逆性。擬南芥的WRKYIIa亞家族成員包括WRKY28、WRKY62、WRKY71、WRKY76等，對該亞家族所有成員進行過表達可提高水稻對白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的抗病性(Peng et al, 2010)。AtWRKY70是植物SA防衛信號傳導途徑的一個重要決定因子，AtWRKY70過表達能提高SA介導的對白粉病菌(Erysiphecichoracearum)抗性(Li et al, 2004)；相反，敲除或抑制WRKY70的表達則會降低植物對SA介導的對白粉病菌抗性(Ren et al, 2008)。這些研究表明，在植物抗病防衛反應過程中，WRKY基因主要以防衛基因轉錄調節子的角色介導了植物的抗病性。

目前，已有大量WRKY轉錄因子基因被報道在介導植物生物與非生物脅迫中發揮作用，但在玉米抗紋枯病的研究中還未見報道。本研究以構建系統進化樹結果為依據，以WRKY76為候選基因，通過RT-PCR技術克隆WRKY76基因的全長cDNA序列，并運用實時熒光定量PCR分析玉米葉鞘組織在不同脅迫條件下的表達特征，揭示WRKY76基因在病害、激素等多種脅迫下的時空表達特征，為今后闡明玉米抗紋枯病的分子調控機制和利用基因工程手段培育抗病品種奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1 系統進化樹構建

利用CLUSTAL X軟件對檢索得到的與擬南芥中抗病相關WRKY家族基因蛋白進行多序列聯配分析。根據多序列聯配結果，采用MEGA5.05軟件鄰接法(Neighbor-Joining method)的Poisson模型，進行Bootstraping檢驗，重復100次，選用Uniform rates構建進化樹(Tamura et al, 2011)。

圖 1　玉米WRKY76基因與擬南芥抗病相關WRKY基因的系統發生樹Fig. 1　Polygentic tree of maize WRKY76 and Arabidopsis pathogen resistance WRKY genes

本研究構建了該基因編碼蛋白與擬南芥抗病相關WRKY轉錄因子的同源進化樹，同時進行自展分析，由圖1可知，各組及亞組分枝及深部節點都有較高的自展值支持，由此表明該進化樹的構建較為準確，各組及亞組的分枝關系得到顯著支持。根據系統發育樹的拓撲結構，結合遺傳距離和自展支持值分析，玉米WRKY76基因與擬南芥抗病相關WRKY基因之間具有較高的同源性，成員多且分支有限，形成相對獨立的亞組分枝，沒有出現交叉現象，其中ZmWRKY76與抗病相關的AtWRKY18及AtWRKY40(Xu et al, 2006)聚類為一個分支，由此表明WRKY76基因很可能參與植物的抗病反應過程。

1.2 材料及取樣

供試材料為課題組前期鑒定篩選的感紋枯病自交系掖478和抗紋枯病自交系R15，均由四川農業大學玉米研究所提供。在玉米拔節期進行脅迫處理：生物脅迫為人工接種高致病性立枯絲核菌AG1-IA，分別于接菌前(對照)和接菌后1、2、4、6、12、24 h取葉鞘；非生物脅迫為水楊酸和茉莉酸甲酯，水楊酸處理濃度為5 mmol·L-1，茉莉酸處理濃度為0.1 mmol·L-1，分別于處理前(對照)和處理后1、2、4、6、12 h取葉鞘，經液氮速凍后保存于-80 ℃備用。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

玉米葉鞘總RNA提取按照TRIzol試劑操作流程進行。RNA完整性通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測；用核酸蛋白儀檢測RNA濃度和純度。根據RNA的濃度確定反轉錄體系中RNA的體積，將總RNA反轉錄成cDNA按照寶生物公司(TaKaRa)試劑盒說明進行操作，cDNA樣品保存于-20 ℃冰箱中，備用。

本研究用于基因克隆的cDNA來自R15接菌后1 h的葉鞘組織RNA的反轉錄；用于熒光定量分析的材料是R15和掖478生長到拔節期的植株，選擇生長一致的植株，進行立枯絲核菌AG1-IA、SA、MeJA三種處理，提取葉鞘組織RNA。提取后的RNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S條帶清晰，無拖尾現象(圖2)，表明所提RNA完整性較好；通過核酸蛋白儀測定OD260/OD280的比值在1.8～2.1之間，表明RNA的純度較好。因此，所提RNA可用于后續基因克隆和實時熒光定量分析。

圖 2　玉米葉鞘總RNA電泳圖Fig. 2　Agarose gel electrophoresis of maize sheath total RNA

1.4 WRKY76基因克隆

根據NCBI數據庫公布的玉米WRKY76 mRNA序列，用Primer Premier 5.0設計目標基因的特異引物擴增包含整個CDS的序列(表1)。以反轉錄的cDNA為模板，進行RT-PCR反應，反應條件如下：模板cDNA 2 μL、上下游引物各0.6 μL、2×KOD Buffer 10 μL、2 mmol·L-1dNTPs 4 μL、KOD FX 0.4 μL，加無菌ddH2O至20 μL。PCR反應程序如下：94 ℃預變性5 min； 以94 ℃變性30 s， 56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環35次；72 ℃再延伸8 min。PCR結束之后，取10 μL進行電泳檢測分析結果，回收PCR產物并連接到pMD?19-T載體上，轉化E.coliDH5α，菌落PCR驗證陽性克隆，送上海英俊生物有限公司測序。

1.5 WRKY76基因表達特征分析

以玉米看家基因GAPDH為內參基因，根據克隆測序的玉米WRKY76序列，用Premier 5.0設計目的基因的qRT-PCR引物(表1)。利用Bio-Rad CFX實時熒光定量PCR儀對玉米葉鞘組織不同脅迫處理時間點的樣品進行表達特征分析，反應體系為EvaGreen?Supermix 5 μL、模板1 μL、上下游引物各0.5 μL，加ddH2O至總體積10 μL。反應條件為98 ℃預變性2 min；98 ℃變性2 s，59 ℃(GAPDH)、55.9 ℃(WRKY76)退火和延伸10 s；循環39次；65～95 ℃，作融解曲線。試驗共設3個重復，結果分析采用Bio-Rad CFX Manager自帶的gene study程序進行。

表 1　引物名稱及序列

2結果與分析

2.1 WRKY76基因的克隆

根據NCBI數據庫公布的玉米WRKY76 mRNA序列，設計目標基因的特異引物擴增包含整個CDS的一段序列，進行PCR擴增，獲得一條長度為1 083 bp片段(圖3)；將其克隆到pMD19-T載體上，菌落PCR篩選陽性克隆，送上海英俊生物有限公司進行基因測序。將測序結果與已知的序列進行BLAST比對，結果與原氨基酸序列同源性達到了100%，這說明克隆得到的序列為目的基因。

圖 3　目的基因(WRKY76)擴增電泳圖　左側為目的基因，右側為Marker。Fig. 3　Agarose gel electrophoresis of target gene(WRKY76)　 The target gene is on the left, Marker is on the right.

2.2 WRKY76基因表達特征分析

2.2.1WRKY76在立枯絲核菌AG1-IA脅迫下的差異表達實時定量PCR分析結果表明，立枯絲核菌AG1-IA侵染玉米R15和掖478 1 h后，WRKY76能夠強烈迅速上調表達，此時表達量達到最高，其中在感病材料掖478及抗病材料R15中，表達量分別為對照的20倍和32倍；隨后2 h的相對表達量較1 h相對表達量降低，感病材料掖478相對表達量為3倍左右，抗病材料R15回到原水平；在之后的4～24 h，在感病材料中，又出現兩次峰值，分別出現在4 h和12 h，在脅迫24 h時，相對表達量回到原水平；但在抗病材料R15中，表達呈上升趨勢，到達6 h時，變化平緩，相對表達量維持在較高水平(圖4)。統計分析結果表明，該基因在抗病材料R15中的相對表達量與感病材料掖478中的差異達到了顯著水平(P≤0.05)，由此表明WRKY76轉錄因子基因很可能是玉米紋枯病抗感差異原因之一。

圖 4　WRKY76在立枯絲核菌脅迫下的表達模式分析橫坐標為處理時間； 縱坐標為WRKY76相對表達量。Fig. 4　Expression profile of WRKY76 under treatment of AG1-IA　X axis represents the time of treatment，y axis represents relative expression of WRKY76.

2.2.2WRKY76在SA處理下的差異表達在植物的抗病信號轉導途徑中，水楊酸(salicylic acid,SA)作為一種內源信號分子通過調控作用激活過敏性壞死反應(hypersensitive response,HR)和系統獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)反應。外施SA可以增加植物的抗病性，為了明確WRKY76基因是否受SA的激發，用SA處理R15和掖478后，進行實時熒光定量PCR分析。結果表明在感病材料掖478中，WRKY76被誘導而顯著的上調表達，在處理后的1 h的相對表達量為對照的33倍；2 h時相對表達量達到最高的46倍，隨后開始下降，12 h時相對表達量與維持在對照的2.5倍水平；在抗病材料中，該基因被誘導表達的趨勢與感病材料相似，相對表達量峰值出現在脅迫后4 h，且相對表達量低于感病材料掖478(圖5)。在感病材料中SA能快速誘導WRKY76基因的表達。

圖 5　WRKY76在水楊酸處理下的表達模式分析Fig. 5　Expression profile of WRKY76 under treatment of SA

圖 6　WRKY76在茉莉酸甲酯處理下的表達模式分析Fig. 6　Expression profile of WRKY76 under treatment of MeJA

2.2.3 MeJA處理下WRKY76基因的差異表達茉莉酸(jasmonic acid,JA)及其功能衍生物如茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)是高等植物中一種重要的信號分子，在植物應對脅迫應答的信號轉導中起到重要的調控作用。一般認為茉莉酸(JA)在調控防御應答相關基因的表達時，主要與真菌類激發子、蟲害、干旱、傷害以及滲透等逆境脅迫的應激反應相關。在本研究中，感病材料掖478經茉莉酸甲酯(MeJA)處理后，WRKY76基因的表達都受到了抑制，WRKY76基因在1 h表達量為對照的0.6倍，其他調查時間點基本都在0.1～0.3之間，在處理時間段內，表達呈現下降趨勢。而在抗病材料R15中，WRKY76基因表達呈現上升趨勢，變化趨勢不明顯，具體表現為處理4～12 h時間段內相對表達量維持在1.8倍左右(圖5)。綜合分析表明，WRKY76基因在茉莉酸參與的信號轉導途徑中是下調表達的。在JA途徑中，JA促進MYC表達，MYC增強抗病基因VSP2(vegetative storage protein 2)表達卻負調控WRKY76表達，因此WRKY76基因受到抑制的效果更明顯。

3討論與結論

WRKY是一種受誘導表達的轉錄因子，在高等植物應對生物與非生物脅迫反應的轉錄調控中有重要功能，且具有快速、瞬時表達的特點(Dong et al, 2003; Pandey & Somssich, 2009)。在病原物脅迫及防衛反應信號分子如水楊酸及茉莉酸處理下均能誘導WRKY的表達(Park et al, 2006)。

WRKY76在兩個抗感自交系接種立枯絲核菌后均具有受誘導性及快速瞬時表達的特點，在1 h的相對表達量達到頂峰，抗性材料R15表達量升高的倍數高于感病材料掖478， 這與誘導防衛應答過程中WRKY基因發揮的轉錄調控功能相似(Dong et al,2003)。在接菌6、12、24 h這三個關鍵時期的高表達且相對表達量存在顯著差異，即抗病材料高于感病材料，這與VpWKRY1和VpWRKY2受白粉菌誘導表達相似(李慧娥, 2010)。

圖 7　WRKY76在SA及JA途徑中的調控作用　箭頭代表正調控作用； T代表抑制作用。Fig. 7　Regulatory effects of WRKY76 in the SA and JA pathways　Arrows represent a positive regulation role； T represent inhibitory effect.

水楊酸(SA)信號分子與植物病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)激發的免疫反應(PAMP-triggered immunity,PTI)和效應子激發的免疫反應(effector-triggered immunity,ETI)(Katagiri & Tsuda, 2010)存在著緊密聯系(Ryals et al, 1996; Bostock, 2005)。當受到病原菌侵入時，植物會產生移動免疫信號分子(MeJA、壬二酸、磷酸甘油脫氫酶)和脂質轉移蛋白(defective in inducedresistance 1,DIR1;azelaic acidinduced 1,AZI1)，通過維管組織運輸到整個植物體中，使得植物未被侵染部位產生抗病性，阻止病害進一步蔓延(Spoel & Dong, 2012)。本研究中，玉米經信號分子SA處理后，WRKY76基因都迅速而強烈的上調表達，證實其在轉錄水平上參與調控植物抗紋枯病防衛應答(Dong et al, 2003)，同時這與擬南芥中大多數WRKY基因都受SA的誘導而上調表達結果相符(Eulgem et al, 2000)。表明該基因可能作為SA信號傳導的重要成員，同時該基因的表達與SA信號分子的積累有直接聯系，它可能通過調控下游的NPR1(non-expressor of pathogenesis-related gene 1)，使其從胞內向核內移動，NPR1激活細胞核內WRKY的表達而啟動植物的免疫反應(ülker & Somssich, 2004; Eulgem & Somssich, 2007; Rushton et al, 2010; Spoel & Dong, 2012)，參與玉米與AG1-IA的互作，指導植物做出抗病反應。

JA信號轉導也是植物抗性反應的重要途徑，主要參與傷害引起的信號轉導(Katagiri et al, 2010)。用MeJA處理玉米后WRKY76基因的表達明顯受到抑制。JA信號轉導能負調控依賴SA信號分子的防衛基因的表達(Petersen et al, 2000; Kachroo et al, 2001)，AtWRKY70則在激活SA誘導基因表達的同時，抑制JA誘導基因的表達(Li et al, 2004)。WRKY76所具有的SA誘導上調和JA誘導下調特性，推測可能在SA和JA信號轉導中具有與AtWRKY70相似的功能，即WRKY76具有負調控茉莉酸JA響應基因VSP2及PDF1.2(plantdefensin1.2)的表達(Hu et al, 2012)。

隨著近年來深入和廣泛的研究，越來越多的WRKY家族成員被證明參與了植物的病原相關反應。在我們的研究中，MeJA、SA、病原菌均能誘導WRKY76轉錄因子表達。玉米R15和掖478在接種立枯絲核菌后，目的基因先上調表達并且反應非常迅速，證實WRKY轉錄因子參與抗紋枯病調控途徑。接種1 h后，WRKY76的相對表達量達到最高，而此時AG1-IA的孢子剛剛侵染玉米葉鞘的表皮層，暗示WRKY76可能參與了玉米病原菌侵染早期的防衛反應。

植物在受到外界環境影響后，體內伴隨著一系列防御反應信號途徑的激活，其中最主要的是水楊酸信號轉導途徑和茉莉酸信號轉導途徑。利用實時熒光定量PCR發現WRKY76具有受SA誘導上調表達和JA誘導下調表達特性。在SA途徑中，SA信號增強WRKY76表達從而促進SA響應基因的表達使得植物的抗病性增強。在JA途徑中，JA信號增強MYC2的表達，而MYC2轉錄因子卻抑制WRKY76的表達。這些與擬南芥WRKY70調控功能相似。

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Cloning of maizeWRKY76 and its expression patterns involved in resistance to maize banded sheath blight

GAO Wen-Cheng1， LI Yue2， ZHANG Yin-Chao1， ZHANG Zhi-Ming1，PAN Guang-Tang1， LIN Hai-Jian1*

( 1．MaizeResearchInstitute,SichuangAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofMaizeinSouthwestRegion,MinistryofAgriculyure, Chengdu 611130, China;2.MianyangAcademyofAgriculturalScience, Mianyang 621000, China )

Abstract:Maize banded leaf and sheath blight (BLSB) which is a very destructive disease, can result in a significant yield loss and also heavily affect the quality of corn in maize production area. The expression of defense response genes could be stimulated by SA (salicylic acid) and MeJA (methyl jasmine) in the signal transduction pathway, and regulated by members of the WRKY transcription factors family. Transcription factors WRKY family members in Maize and WRKY family members which are related to resistance in Arabidopsis were collected from NCBI, and then polygenetic tree was successfully constructed. According to the result of polygenetic which was conducted by using the software CLUSTAL X and the software MEGA5.05, we concluded that the transcription factor WRKY76 was most likely involved in maize sheath blight resistance network. Whether the transcription factor WRKY76 plays a truly important role in sigjnal transduction path is still unknown. The materials used in this study were R15 (Resistant line) and Ye478 (Susceptible line). R15 and Ye478 under different kinds of stress conditions were used to characterize the expression pattern of WRKY76 gene by qRT-PCR, leaf sheath samples were collected at 0, 1, 2, 4, 6, 12 and 24 h post Rhizoctonia solani AG1-IA inoculation, and 0, 1, 2, 4, 6, 12 h after SA (salicylic acid) and MeJA (methyl jasmine) stress treatment. When leaf sheath samples were inoculated with R. solani AG1-IA at jointing stage, the WRKY76 gene expression was able to reach to the highest at 1 h post inoculation, and its expression was 20 and 32 times higher than control in Ye478 (Susceptible line) and R15 (Resistant line), with significant difference (P<0.05). The relative expression decreased at 2 h post inoculation. 3 times for Ye478 (Susceptible line) while it returned to the original level for R15 (Resistant line). The expression pattern in R15 (Resistant line) tended to increase along with treatment time increasing, while it was always higher than the susceptible line Ye478 with significant difference (P<0.05). When the maize leaf sheath was treated with SA (salicylic acid), the expression pattern of WRKY76 between Ye478 (Susceptible line) and R15 (Resistant line) were almost the same level, and its expression in R15 (Resistant line) was higher than that of Ye478 (Susceptible line). For R15 (Resistant line), the relative expression level of WRKY76 was 33 times at 1 h post inoculation compared to the control, 46 times at 2 h post inoculation, and then decreasd to 2.5 time at 12 h post inoculation. However, When the maize leaf sheath was treated with MeJA, Ye478 (Susceptible line) presents the downward trend, R15 (Resistant line) shows a upward pattern according to the results of relative expression level at each treatment time. There was no significant difference between Ye478 (Susceptible line) and R15 (Resistant line). Finally research results of this study indicated that the WRKY76 gene expression could be induced by R. solani AG1-IA, SA (salicylic acid) and MeJA (methyl jasmine), and the WRKY76 might be involved in plant resistance signal transduction regulation pathway to maize banded leaf and sheath blight.

Key words:maize banded leaf and sheath blight, transcription factor, WRKY76, qRT-PCR

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201401022

收稿日期:2014-06-29修回日期： 2014-11-19

基金項目：國家自然科學基金(31201221)；國家“863”項目(SS2012AA100107)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31201221); National High-tech R & D Program of China(SS2012AA100107)]。

作者簡介：高文成(1987-)，男，內蒙開魯縣人，碩士研究生，研究方向為玉米逆境分子生物學，(E-mail)gaowencheng2009@163.com。 *通訊作者： 林海建，博士，副研究員，研究方向為玉米分子生物學與遺傳育種，(E-mail)linhj521@gmail.com。

中圖分類號：Q943.2， Q751

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)03-0273-07

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