基于引物“隨機組合”構(gòu)建觀賞桃SSR指紋圖譜

王清明, 程　怡, 馬建偉, 張云婷, 張　勇*

( 1. 四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院， 成都 625014； 2. 廣元市農(nóng)業(yè)科學研究院， 四川 廣元 628017 )

基于引物“隨機組合”構(gòu)建觀賞桃SSR指紋圖譜

王清明1,2, 程怡1, 馬建偉1, 張云婷1, 張勇1*

( 1. 四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院， 成都 625014； 2. 廣元市農(nóng)業(yè)科學研究院， 四川 廣元 628017 )

摘要：近年來，我國觀賞桃新品種日漸繁多、名稱混亂、市場難以監(jiān)管，同時用以區(qū)分品種的SSR指紋圖譜的構(gòu)建方法在研究界無統(tǒng)一的科學標準，尤其是構(gòu)成最終引物組合的核心引物的確定，具體操作流程層出不窮、五花八門。為探索篩選SSR指紋圖譜核心引物的科學方法，同時構(gòu)建觀賞桃SSR指紋圖譜，該研究選用35對已報道的SSR引物對22份觀賞桃種質(zhì)進行試驗。結(jié)果表明：通過PCR擴增與分析，多態(tài)性較高的8對引物——候選引物總共擴增出31個多態(tài)性條帶，變幅為3～5個，PIC值變幅為0.458～0.668，MI值變幅為1.374～3.340。采用“隨機組合”法對8對引物進行…依次分析，得到區(qū)分能力最強的3種不同的最少引物組合方式——候選組合，并能區(qū)分出18份種質(zhì)，從中發(fā)現(xiàn)區(qū)分能力最強的3種引物組合方式并不都是由引物PIC值、alleles數(shù)量或MI值等多態(tài)性指標最高的引物組成，而是由互補性最強的引物組成。選用組合內(nèi)各引物多態(tài)性條帶總數(shù)最多的組合方式“4-3”(BPPCT001+BPPCT015a+BPPCT017+BPPCT025)為22份觀賞桃種質(zhì)構(gòu)建了指紋圖譜。基于此，通過常規(guī)多態(tài)性指標篩選候選引物可以確定出單對引物鑒別能力最強的少量引物；通過“隨機組合”篩選候選組合可以進一步確定出引物之間互補性最強的幾種組合方式；根據(jù)組合內(nèi)各引物的多態(tài)性條帶總數(shù)確定最終核心引物可以確定出可擴容性最大的引物組合。該研究最終建立了候選引物——候選組合——核心引物組合“三步法”確定SSR指紋圖譜核心引物組合的科學方法，不僅為22份供試觀賞桃種質(zhì)構(gòu)建了SSR指紋圖譜，也為其它作物SSR指紋圖譜的構(gòu)建提供了新的思路。

關鍵詞：觀賞桃， 種質(zhì)， SSR標記， 分子身份證， 引物組合法

觀賞桃(Ornamental peach)又稱桃花，屬于薔薇科李屬植物，包括桃(Prunuspersica)以及桃與其近緣種的雜交種(胡東燕和張佐雙，2010)，如‘白花山碧桃’。據(jù)文物考證，桃在我國可追溯到6 000～7 000年前的新時代時期(汪祖華和莊恩及，2001)，而以花見長的觀賞桃在唐朝就有專門栽培(王仁裕和丁如明，1985)，桃花品種到清代已是琳瑯滿目(陳淏子和伊欽恒，1985)。觀賞桃在國外同樣受到青睞，其發(fā)展遍及五洲各地，它明艷的氣質(zhì)深刻影響著世界園林歷史的變遷(Everett，1967)。觀賞桃的雙重授粉方式(自花授粉和異花授粉)極大豐富著其種質(zhì)資源，據(jù)2004年的一次統(tǒng)計約有267個桃花名稱(胡東燕，2004)。近10年來，以中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所、江蘇省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所和北京市農(nóng)林科學院林業(yè)果樹研究所等單位為主要陣地的觀賞桃新品種選育研究極大地推動了觀賞桃種質(zhì)資源的發(fā)展(俞明亮等，2010)。品種的豐富致使“一物多名，一名多物”的現(xiàn)象在觀賞桃上時有發(fā)生，這個觀賞桃種質(zhì)創(chuàng)新工作和商品流通都造成了很大障礙。因此，給不同的觀賞桃種質(zhì)冠以獨一無二的特異標識成為亟待之求。

隨著SSR (Simple Sequence Repeat) 標記在不同物種中深度開發(fā)，SSR指紋圖譜(Fingerprint)在近年來蓬勃發(fā)展。SSR指紋圖譜是利用SSR擴增條帶為種質(zhì)建立特異身份標識的一種DNA分子圖譜，或稱分子身份證(Molecular ID)。2005年，SSR標記操作簡單、單位點擴增以及實驗室間的高重復性等優(yōu)勢促成了國際植物品種權(quán)保護組織(UPOU)明確將其確定為構(gòu)建品種指紋數(shù)據(jù)庫的標準方法(J?rdens，2005)。按照組成SSR指紋圖譜所需的引物數(shù)量可以分為特征譜帶法和引物組合法。特征譜帶法可以追溯到1984年，英國遺傳學家Jefferys et al(1985)首次獲得人源小衛(wèi)星DNA與人體核DNA酶切片段的雜交帶圖紋，并以此命名為指紋圖譜(Fingerprint)，它是將單對(條)引物或探針在種質(zhì)上擴增出的特異條帶作為該種質(zhì)的指紋圖譜。但特征譜帶法的開放性和可容性差，難以在大規(guī)模的種質(zhì)鑒定中發(fā)揮作用。2000年，郭景倫等(2000)率先利用引物組合法在國內(nèi)構(gòu)建了玉米的RAPD指紋圖譜。經(jīng)過10余年的發(fā)展，引物組合法中的核心引物法在SSR指紋圖譜的運用中越來越受到青睞。但遺憾的是，篩選核心引物作為構(gòu)建SSR引物的關鍵步驟之一，在以往的實踐中未見統(tǒng)一的標準。大多研究是以等位基因多態(tài)性條帶數(shù)量(Polymorphic bands)、多態(tài)信息含量(Polymorphism information content，PIC)和標記索引指數(shù)(Mark index，MI)等多態(tài)性指標為標準進行選擇。例如：麻麗穎等(2012)單純依靠各引物的alleles數(shù)目來選擇核心引物， 陳昌文等(2011)以PIC值為主要標準逐一剔除對引物組合鑒定能力影響最小的引物來最終確定核心引物。引物組合法的精髓在于利用了不同引物在種質(zhì)上的擴增效果具有差異的特點，它將多對引物的擴增條帶進行有序組合，進而形成不同種質(zhì)獨一無二的指紋圖譜。因此，充分利用不同引物擴增效果的互補性和降低核心引物組合擴增效果的冗余性，方可實現(xiàn)引物組合的最大效力。傳統(tǒng)的篩選方法單純依靠多態(tài)性指標，雖可以找到鑒別效力極高的引物，但是忽略了不同引物之間的效力重疊與互補的問題，即引物的多態(tài)性高低和由該引物組成的引物組合的多態(tài)性高低不能直接畫等號。

表 1　供試觀賞桃材料

SSR指紋圖譜不僅在玉米(蓋樹鵬等，2011)、水稻(陸徐忠等，2014)等大宗作物中取得了成功，且在桃等多種園藝植物中頻有報道。陳昌文等(2011)為176份桃品種構(gòu)建了SSR指紋圖譜，為今后有關桃的SSR指紋圖譜研究提供了寶貴經(jīng)驗。但這項研究的材料主要集中在食用桃品種，而對于近5年來新報道的觀賞桃品種和觀食兩用桃品種卻較少涉及，如‘賀春’(劉佳棽等，2010)、‘報春’(朱更瑞等，2011)、‘錦春’(劉佳棽等，2011)、‘紅菊花’(王力榮等，2011)等。該研究基于引物組合“合力”考慮，將“隨機組合”引入核心引物篩選的環(huán)節(jié)中，以期找到篩選核心引物的科學方法，并以此方法為22份觀賞桃種質(zhì)構(gòu)建SSR指紋圖譜。

1材料與方法

1.1 供試材料和DNA提取

22份觀賞桃種質(zhì)來自四川農(nóng)業(yè)大學教學科研園區(qū)，主要引自北京市農(nóng)林科學研究院和中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所。每份種質(zhì)分別調(diào)查統(tǒng)計20個個體，按胡東燕等(2010)對觀賞桃不同樹型、葉色、花型和花色等主要形態(tài)學性狀的界定標準，對22份種質(zhì)進行描述(表1)。同時，從每份種質(zhì)中選取20個個體進行混合取樣，摘取春季幼嫩新葉，采用劉燕(2011)優(yōu)化的CTAB法提取總DNA。

1.2 SSR-PCR反應

SSR引物來源于Dirlewanger et al(2002)報道在桃上的35對單位點擴增引物。

PCR擴增在Bio-rad DNA Engine Single bay PCR儀 (eppendorf，德國)上進行。反應體系為25 μL：DNA模板40 ng，引物各10×10-9mol，Mg2+50×10-6mol，dNTPs 7.5×10-6mol，10×Buffer (free Mg2+) 2.5 μL，Taq酶2 U，所有試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。擴增程序是94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。退火溫度根據(jù)生工生物工程(上海)股份有限公司提供的引物使用說明進行調(diào)整。

用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，用快速銀染法(高東等，2009)進行染色。為保證試驗的重復性，具有多態(tài)性的引物在最適條件下重復擴增2次，若電泳結(jié)果不一致，則增加第3次試驗，以能夠重復的結(jié)果為準。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在相同電泳遷移率位置上，有擴增條帶記為1，無則記為0，從而建立起0，1格式矩陣，統(tǒng)計各引物產(chǎn)生的等位基因數(shù)量(alleles數(shù)目)、多態(tài)性信息量(polymorphism information content，PIC)和標記索引系數(shù)(maker index，MI)。PIC值由公式“PICi=1-∑Pij2”計算(Senior et al，1998)；MI值由公式“MI=alleles數(shù)目×PIC”計算(Smith et al，1997)。以“引物使用最少”為原則，確定核心引物組合。用“+、-”式構(gòu)建SSR指紋圖譜(陳琛等，2011)。

2結(jié)果與分析

2.1 擴增結(jié)果

選取多態(tài)性較高、穩(wěn)定性較好的8對引物對22份種質(zhì)進行分析(表2，表3)。8對引物在22份材料中共擴增出31個條帶，且都是多態(tài)性條帶，多態(tài)位點百分率為100%，單對引物擴增條帶數(shù)變幅為3～5，平均每對引物擴增出約3.9個多態(tài)性條帶，擴增條帶最多的5對引物分別是BPPCT001、BPPCT017、BPPCT037、BPPCT015a、BPPCT025；8對引物的PIC值變幅為0.458～0.668，平均為0.527，大小排前五的引物依次是BPPCT001、BPPCT025、BPPCT017、BPPCT007和BPPCT023；8對引物的MI值變幅為1.374～3.340，平均為2.055，大小排前五的引物依次是BPPCT001、BPPCT017、BPPCT037、BPPCT025和BPPCT015a。三個指標在各引物中大小排序不完全一致。

2.2 引物組合

2.2.1 特征譜帶法35對引物中，BPPCT014、BPPCT015a和BPPCT017分別產(chǎn)生1、2和2個特征條帶。其中，PIC值僅為0.082的引物BPPCT014能夠區(qū)分‘白重瓣垂枝’，且其他所有品種的譜帶相同(圖1)；而PIC值較大的BPPCT015a、 BPPCT017各自產(chǎn)生的2個特征圖譜能夠分別區(qū)分出‘賀春’和‘單瓣垂枝’(圖2)、‘壽紅’和‘白重瓣垂枝’(圖3)。

表 2　8對SSR引物序列信息表

表 3　8對SSR引物的多態(tài)性信息

圖 1　引物BPPCT014在22份觀賞桃種質(zhì)上擴增結(jié)果Fig. 1　Amplification of BPPCT014 on 22 ornamental peach germplasms

圖 2　引物BPPCT015a在22份觀賞桃種質(zhì)上擴增結(jié)果Fig. 2　Amplification of BPPCT015a on 22 ornamental peach germplasms

圖 3　引物BPPCT017在22份觀賞桃種質(zhì)上擴增結(jié)果Fig. 3　Amplification of BPPCT017 on 22 ornamental peach germplasms

表 4　8對引物的隨機組合

表 5　四引物組合各指標總和

綜合表3和表4的數(shù)據(jù)可以看出，3種“候選組合”所覆蓋的5對引物(BPPCT001、BPPCT007、BPPCT015a、BPPCT017、BPPCT025)其多態(tài)性條帶數(shù)目、PIC值、MI值均比較高。但這個現(xiàn)象并不絕對，例如，BPPCT007的多態(tài)性條帶數(shù)目和MI值均低于BPPCT037，卻被2種“候選組合”選中，而BPPCT037相應地被摒棄；BPPCT015a作為3種“候選組合”的必須引物，其PIC值大小在8對引物中僅排名第7。

2.3 指紋圖譜

3種“候選組合”中，“4-3”(BPPCT001+ BPPCxT015a+ BPPCT017+ BPPCT025)的總多態(tài)性條帶數(shù)目、總PIC值和總MI值均最大(表5)。將總多態(tài)性條帶數(shù)目最大的組合“4-3”確定為最佳隨機組合，即核心引物組合， 并為22份觀賞桃種質(zhì)構(gòu)建SSR

表 6　22個觀賞桃品種的SSR指紋圖譜

指紋圖譜(表6)。

3討論與結(jié)論

3.1 引物多態(tài)性

擴增結(jié)果揭示了本研究中的8對引物的多態(tài)性比較豐富。在引用相同引物來源的桃的研究中，陳霽等(2010)在42份觀賞桃種質(zhì)中平均每對引物擴增出7.75個多態(tài)性條帶，陳昌文等(2011)在176份中國桃種質(zhì)中平均每對引物擴增出12.7個多態(tài)性條帶，都高于本研究中的3.9個多態(tài)性條帶。但這并不反映本研究中的引物多態(tài)性低，相反，它只從實踐上驗證了供試種質(zhì)數(shù)量越大，遺傳背景越豐富，種質(zhì)之間的變異空間越大，越容易擴增出更豐富的多態(tài)性條帶。本研究8對引物的多態(tài)性條帶比例均為100%，高于陳霽等(2010)的研究，PIC值變幅為0.458～0.668，MI值變幅為1.374～3.340，足見其多態(tài)性均比較豐富。

3.2 核心引物確定

最早的指紋圖譜可以歸結(jié)為特征譜帶法，是利用單對引物對具有特殊譜帶的種質(zhì)進行標記；但當供試的種質(zhì)材料數(shù)目擴大時，特征譜帶法的特殊譜帶有可能失去其特殊性。為解決特征譜帶法的局限性，郭景倫等(2000)提出了引物組合法，它利用不同引物間的特異性“互補”來為種質(zhì)構(gòu)建組合指紋(后稱“復指紋”)，然后以“復指紋”的形式來實現(xiàn)對規(guī)模較大的種質(zhì)進行區(qū)分。由這種“復指紋”所構(gòu)建的指紋圖譜在理論上具有更好的“擴容性”，即當新的種質(zhì)加入并獲得其特有“復指紋”時，群體內(nèi)原有種質(zhì)的特殊“復指紋”能夠繼續(xù)保持其特殊性。“擴容性”的大小可以反映出引物組合對種質(zhì)的區(qū)分能力，而“擴容性”的大小不僅與組合中各引物自身的多態(tài)性有關，更直接取決于引物組合的多態(tài)性。因此，核心引物的選擇至關重要，其選擇程序應具有科學性。王鳳格等(2003)便指出了核心引物的篩選應遵循一定的算法。

隨著種質(zhì)資源的日益豐富，商業(yè)流通對構(gòu)建DNA指紋圖譜有著深刻要求；再者，由于種質(zhì)之間遺傳信息不斷交叉，不同種質(zhì)的區(qū)分難度也不斷增加，各物種高質(zhì)量的核心引物組合亟待確立。筆者倡議以“三步法”確立核心引物組合的引物：首先以穩(wěn)定重復性、alleles數(shù)目、PIC值等為第一、二、三…指標選出“候選引物”，然后以“隨機組合”從“候選引物”中選出“候選組合”，最后分別以總alleles數(shù)目、PIC值等為第一、二…指標確定出最佳隨機組合，即核心引物組合。

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Abstract: Bulblet formation and development of Lanzhou lily (Liliumdavidiivar.unicolor) by tissue culture could provide technical solutions to realize the mass production of Lanzhou lily bulblet, which needs three steps to achieve, including multiple shoots proliferation, induction of bulblets and enhancement growth of bulblets. The starch content and the characteristic parameters of bulblet were detected at different culture stages. This study acquired an advanced technique that could effectively promote the bulblet formation and development, and induce the growth of main stem. The results demonstrated that the bulblet diameter, weight and number of scales were up to 1.66 cm, 2.48 g and 26.33 pieces, respectively. The starch content showed a gradual increasing trend according to the culture process, which indicated that the starch content was positively correlated to the development of bulblet. In addition, the bulblet size, weight and number of scales showed a positive correlation. The growing point of bulblet was easy to form the main stem when the number of scales reached to 26 or more. In this paper, the invented three-step tissue culture technology effectively promotes bulblet enhancement development, and enlargement of the bulblet can effectively shorten the field growth cycle, improve lily production on time, and also, it can provide technical reference for achievement of mass production of enhancement bulblet.

Key words:Liliumdavidiivar.unicolor, bulblet, development, starch, plant hormone

CLC number： Q943.1, S644.1Document code： AArticle ID： 1000-3142(2016)03-0297-06

Construction of SSR fingerprint for ornamental peach based on primers “random combination”

WANG Qing-Ming1，2, CHENG Yi1, MA Jian-Wei1, ZHANG Yun-Ting1, ZHANG Yong1*

( 1.CollegeofHorticulture,SichuanAgriculturalUniversity, Ya’an 625014, China； 2.GuangyuanAcademyofAgriculturalSciences， Guangyuan 625014， China )

Abstract:In the recent years, the nomenclature of the cultivars of ornamental peach in China is falling into mess under the rapidly increasing of new cultivars. This makes it more and more hardly to deal with the market regulation. Meanwhile, there is no statistically unified scientific standard for the methods of constructing SSR fingerprint in research community, especially for filter the core primers that consisted of the finally unique group, the concrete operating procedures are plenty, variable and mess. In order to explore the statistically unified scientific method for filtering the core primers of the finally unique group and construct the SSR fingerprint for experimental ornamental peach, we selected 35 pairs of SSR primers reported previously to test on 22 ornamental peach germplasms. After PCR amplification and analysis firstly, 8 pairs of primers among them with high polymorphism called “candidate primers” were detected 31 polymorphism bands in total, ranging from 3-5 per pairs of primer. And the 8 pairs of primers gained 0.458-0.668 in PIC values and 1.374-3.340 in MI values correspondingly. Secondly, we analyzed …successively by “random combinations” method, obtained 3 different primer combinations consisting with lest of primers called “candidate combination”, which possessed the strongest discrimination ability. All of the three could distinguish 18 accessions. And the 3 best primer groups were not consisted with the series of primers which possessed high leaves of PIC values, MI values or high numbers of alleles and so on, but a series primers which possessed an high leaves of complementarity. Lastly, the combination “4-3” (BPPCT001+BPPCT015a+BPPCT017+BPPCT025), which possessed the most polymorphism bands in total of the primers among groups, was finally chosen to establish the fingerprint for the 22 ornamental peach germplasms tested. The rerults showed that to filter candidate primers according to routine polymorphic index could select the few pairs of primers which possessed the strongest discrimination ability per pairs of primer; to filter candidate combination according to “random combination” could furtherly select the few compound modes which possessed the strongest complementarity; to filter core primer combination according to numbers of the bands in total of primers among groups could finally select the unique group which possessed the largest expandable sex. Therefore, “3 steps” for candidate primers-candidate combination-core primer combination was advocated as a scientific method to fitter the core primers of SSR fingerprint. It did constructed the SSR fingerprint for the 22 ornamental peach germplasms tested, and would provide a new approach to construct SSR fingerprints for other crops.

Key words:ornamental peach， germplasm， SSR marker， molecular ID， primer combination method

Bulblet formation and development of Lanzhou lily (Liliumdavidiivar.unicolor) by tissue culture

ZHANG Jin-Zhong1, WEI Shao-Long1, SUN Jia-Man2,HAN Yuan-Shan1, ZHOU Wei1

( 1.BiologicalTechnologyInstituteofGuangxiAcademyofAgriculturalSciences, Nanning 530007, China;2.GuangxiKeyLaboratoryforCropGeneticImprovementandBiotechnology, Nanning 530007, China )

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201408028 10.11931/guihaia.gxzw201407020張進忠， 韋紹龍， 孫嘉曼， 等. 蘭州百合組培鱗莖發(fā)育研究 [J]. 廣西植物， 2016， 36(3)：297-302

收稿日期:2014-12-28修回日期： 2015-03-24

基金項目：四川省教育廳重點項目(12ZZ011)；四川農(nóng)業(yè)大學學科建設“雙支”計劃項目；教育部留學歸國人員資助項目[Supported by the Key Project of Sichuan Education Department(12ZZ011); Project Sponsored by SCAU; Foundation for Returned Overseas Students of Sichuan Province]。

作者簡介：王清明(1990-)，男，四川達州人，碩士，主要從事園藝植物種質(zhì)資源與遺傳育種研究，(E-mail)332686960@qq.com。 *通訊作者： 張勇，博士，副教授，主要從事園藝植物種質(zhì)資源與遺傳育種研究，(E-mail)zhyong@sicau.edu.cn。

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)03-0289-08

王清明, 程怡, 馬建偉， 等. 基于引物“隨機組合”構(gòu)建觀賞桃SSR指紋圖譜 [J]. 廣西植物， 2016， 36(3)：289-296

WANG QM, CHEN Y, MA JW, et al. Construction of SSR fingerprint for ornamental peach based on primers “random combination” [J]. Guihaia， 2016，36(3)：289-296