落地生根胎生苗發育及其相關基因研究進展

蔣文婷 曾會明

（北京林業大學林學院，北京 100083）

落地生根胎生苗發育及其相關基因研究進展

蔣文婷 曾會明

（北京林業大學林學院，北京 100083）

落地生根通過在葉片上形成胎生苗而進行無性繁殖。胎生苗在發育過程中經歷了與合子胚發育類似的各個階段。胎生苗的發育同時具有器官發生和胚胎發生的特征。研究表明，胎生苗的形成需要SHOOT MERISTEMLESS（STM）基因；LEAFY COTYLEDON 1（LEC1）基因在胎生苗發育過程中表達，但落地生根胎生苗的形成并不需要LEC1基因。FUSCA3（FUS3）基因、SAHH基因以及其他相關基因在落地生根胎生苗發育過程中的作用有待進一步的研究。對落地生根胎生苗的發育過程及相關基因進行綜述，以期為相關研究提供一定的參考。

落地生根；胎生苗；STM；LEC1；FUS3

落地生根（Kalancho? daigremontiana）又名土三七、打不死、葉生根等，屬于景天科（Crassulaceae）伽藍菜屬，為多年生肉質草本植物。起源于馬達加斯加島，其分布廣泛，遍及馬達加斯加、東非和南非，延伸至熱帶非洲、阿拉伯半島和東南亞［1］，并廣泛分布于我國廣東、廣西、云南、福建和臺灣等地。落地生根形態奇特且極易栽培，具有較強的觀賞性。此外，落地生根具有較高的藥用價值，常用于治療皮膚病、呼吸系統疾病、腦部疾病等，還可制備抗菌消炎藥劑等［2］，對關節腫痛、熱性胃痛、跌打損傷等具有良好的療效［3］。

眾所周知，落地生根具有很強的再生能力，屬營養體胎生植物類型。其在葉片凹陷處形成胎生苗，胎生苗根系成熟后便與母體分離，形成新的獨立植株，進行無性繁殖。落地生根產生胎生苗的周期短、數量大，且同步性較強，容易成活，是無性繁殖的好材料［4］。

落地生根在結實環境外形成體細胞胚的能力，從本質上為研究體細胞胚的發生提供了具有吸引力的模式系統。而落地生根的植物體細胞具有顯著的生成完整有機體的能力，科學界對這種非凡的再生能力已感興趣多年［5］。目前，國內對落地生根的研究多集中于化學成分［6-8］、藥用價值［9，10］等方面，而對胎生苗發育及其相關基因方面的研究較少。因此，本文就目前對落地生根胎生苗的發育過程以及基因控制等方面的研究進行綜述，以期為相關研究提供一定的參考。

1 胎生苗的形態發生

1.1 胎生苗簡介

在植物界中，有一類植物在種子脫離母體前便萌發為幼苗，或者在母體的營養器官或繁殖器官上直接分化出幼苗，幼苗與母體自然脫落、長成新的植株，這類植物統稱為胎生植物。其中，稱前者為種子胎生或真胎生，后者為營養體胎生或者假胎生［11，12］。產生于母體的幼苗統稱為胎生苗。在我國40種營養體胎生植物中，大多數珠芽和鱗芽產生于莖上，而落地生根的胎生苗產生于葉緣凹陷處，具有一定的特殊性［4］。

盡管進行了廣泛的調查研究，葉片胎生苗的特性仍然存在一定的爭議，這導致其術語的多樣性。胎生苗被定義為“芽”、“胚”或“葉胚”、“葉的假珠芽”、“胚狀體”、“葉的分生組織”、“不定芽”、“葉附生芽”等。Warden［13］在對當時廣泛應用的術語進行回顧的基礎上，得出盡管葉片胎生苗發育中形成類似胚的結構，但由于缺少兩極性，具有閉合的維管系統且獨立于母體外，因此胎生苗并不是真正的胚。同時胎生苗也不是芽，芽發育為正常的葉片，而胎生苗在形態學上由類似子葉的特殊結構發育而來。因此，Warden［13］結合當時的信息認為對胎生苗描述最恰當的術語為“葉苗分生組織”。此后，Batygina等［14］對落地生根和羽葉垂花樹（K. pinnata）的葉片胎生苗進行了形態學和組織學研究，得出胎生苗是“葉的胚”或“胚”。目前為止，有關胎生苗的特性及其形態發生的證據并不完全，因此任何結論的得出都需要做進一步的研究分析。

1.2 胎生苗的發育過程

落地生根通過在葉片上形成胎生苗而進行無性繁殖。落地生根的葉片呈卵圓、橢圓或長三角形，對生，肉質多汁，具有帶鋸齒狀的葉緣。胎生苗形成于成熟葉片的葉緣凹陷處，它們并不是同時形成的，而是從每片葉片的葉尖逐漸延伸到葉片基部，對稱地沿著葉緣發育［15］。在伽藍菜屬的其他物種中也發現了類似的生殖模式，自20世紀起科學界對此便很感興趣［14-17］。

Batygina等［14］和Garcês等［15］先后詳細描述了落地生根胎生苗的發育過程，袁強等［4］對胎生苗的發育進行了解剖學研究。結合前人的研究成果，對胎生苗的發育過程進行描述和總結。在葉片胎生苗發育的早期階段，由于它由單個或幾個細胞組成，并且葉緣的凹陷以及凹陷中的突起與之同時發育，因此很難識別這個階段的胎生苗［14，15］。在形態學上，胎生苗發育第一階段的證據是形成了1.5 cm長的圓頂狀突起，類似于球形胚和芽分生組織。隨后，胎生苗發育經過類似心形胚階段，并發育出類似子葉的葉片［15］。眾所周知，合子胚的發育經過球形胚、心形胚和魚雷胚的階段，最后發育為成熟胚。落地生根胎生苗的發育類似于合子胚，在其發育過程中可區分出類似的階段［14］。胎生苗的葉片為對生，由葉緣凹陷中的突起發育而來，在形成初期，兩片葉片一大一小，但在隨后的發育中葉片大小逐漸變得幾乎相等［14，18］。胎生苗兩片葉片之間存在有葉原基，在隨后的發育中形成對生的兩片小葉。葉片在發育中形成大量葉綠體和淀粉等儲能物質［14，4］，并形成完整的維管系統。發育完全的胎生苗四枚葉片兩兩對生，相互交錯排列為圓球狀，并在頂端保留生長點［4］。胎生苗葉片發育完成后至其脫離母體前，在其下胚軸基部形成不定根［14，15］。待根系成熟后，胎生苗與母體脫離，遇到適宜環境迅速長成新的獨立植株。胎生苗發育成熟后與母體脫離，是由于葉片的基座細胞程序性死亡形成了離層［5］。

1.3 胎生苗發育的特性

Batygina等［14］認為胎生苗在發育過程中可區分出類似于合子胚發育的各個階段，胎生苗葉片的形成與合子胚的子葉類似。Garcês等［15］進行共焦成像顯示：胎生苗與胚類似，在發育的所有階段均具有獨立于母體的閉合維管系統。Batygina等［14］卻認為胎生苗維管系統與母體有短暫連接，但不能以此認定胎生苗為芽。然而，胎生苗與胚不同，不形成主根和芽尖，而是在下胚軸基部形成不定根，這與芽相似［14，15］。基于胎生苗這些形態特征同時類似于芽和胚，Garcês等［5］得出落地生根胎生苗的形成同時結合了器官發生和胚胎發生（圖1）。袁強等［4］對落地生根胎生苗發育進行解剖學觀察發現：胎生苗形成于葉緣凹陷處具有一定的特殊性，胎生苗葉片與不定根的分化具有時序性，以及胎生苗有易落和易繁性。

圖1 落地生根與胎生苗［5］

2 與胎生苗形態發生相關的基因

盡管形態學和解剖學研究提供了關于胎生苗發育的詳細的描述性信息，但對于我們深入理解胎生苗形態建成的機理仍具有一定的局限性，下面將從相關基因調控方面來進一步闡述落地生根胎生苗的發育。

落地生根胎生苗的發育經歷了類似器官發生和胚胎發生的過程，而植物的器官發生和胚胎發生的過程是基因有序的、選擇性表達的結果。目前，在對落地生根胎生苗發育的研究中發現，與其形態建成相關的基因主要有SHOOT MERISTEMLESS（STM）基因、LEAFY COTYLEDON 1（LEC1）基因、FUSCA3（FUS3）基因和SAHH基因。其中，STM基因為胎生苗器官發生調節因子，而LEC1基因和FUS3基因為胚胎發生調節因子，它們共同參與胎生苗的發育過程。

2.1 STM基因

KNOX（KNOTTED-like homeobox）基因編碼具有同源異型盒結構域的蛋白，其中多數蛋白具有轉錄因子的功能，在植物發育中是重要的調節因子［19］。根據同源異構結構域的表達模式及序列的相似性，通常將KNOX基因分為KNOX1和KNOX2基因［20］。KNOX1（class one genes）基因對分生組織的形成和維持具有調控作用，并在葉片發育中起關鍵作用，主要包括STM基因，KNAT1、KNAT2和KNAT6基因［21］，玉米中的同源KNOX1基因［22］及水稻中的OSH1基因［23］等。其中STM基因是調控植物分生組織形成的重要基因，植物發育過程中參與胚芽分生組織的形成，在頂端分生組織的發育中，STM是最早表達的基因［21］。擬南芥中，STM基因功能缺失性突變導致植株無法形成頂端分生組織（SAM）并抑制植株幼苗期的發育［24］。轉基因植株中KNOX1基因結構性過量表達可使葉片上形成異常的芽體［25-27］。KNOX1基因家族的單基因突變體葉片有明顯的發育缺陷以及形態上出現較突出的變化［28］。

落地生根STM（KdSTM）蛋白與擬南芥STM蛋白有75.5%的同一性，且KdSTM和擬南芥STM均位于KNOX1基因第1級進化枝上。因此，KdSTM是STM的直系同源［15］。在落地生根胎生苗發育過程中對KdSTM mRNA進行定位檢測，頂端分生組織和腋生芽中有高水平的KdSTM轉錄物［15］，這與大多數單子葉植物的STM表達模式一致［29］。胎生苗的發育起始于單個或幾個細胞［14］，在葉緣這一小群細胞中同樣檢測到了KdSTM mRNA。在胎生苗發育到心形胚階段，維管束和胎生苗上部類似子葉的葉片中KdSTM轉錄物的量增加［15］。而在擬南芥合子胚中，STM的表達僅局限于球形胚階段的細胞中，在子葉原基中并未發現；在玉米體細胞胚發生中，KNOX1基因的表達范圍比玉米合子胚中的更廣［30，31］。因此，KdSTM在胎生苗發育的全程中均有表達，這種表達模式與合子胚以及體細胞胚并不相同［30，32］。Garcês等［15］用RNA干擾（RNAi）下調KdSTM RNA水平以確定其功能。多數轉基因株系胎生苗的形成表現為完全抑制，在形成胎生苗的株系葉緣檢測到KdSTM mRNA，說明KdSTM在此株系中為不完全抑制，這是由于頂端分生組織中花椰菜花葉病毒35s啟動子活性降低將此區域與基因沉默效應隔離所致［33，34］。因此，KdSTM在胎生苗發生的起始部位、器官發生和胚胎發生中均有表達，且多數KdSTM RNAi植株中胎生苗形成表現為完全抑制，充分說明胎生苗的形成需要KdSTM，其可能通過啟動和/或維持葉片凹槽處未分化的細胞庫起作用［15］。將KdSTM基因構建表達載體并轉化煙草，發現轉基因煙草的早期出現較小分枝的側芽而野生型無側芽出現［35］，進一步說明KdSTM基因對芽的再生具有一定的促進作用。

2.2 LEC1基因

LEC1、LEC2和FUS3基因編碼LEAFY COTYLEDON（LEC）蛋白，是植物胚胎形態發生和成熟所需的胚胎調控基因。Meinke等［36］對擬南芥lec突變體lec1、lec2和fus3進行研究發現，該突變體存在顯著的胚胎成熟缺陷。Lotan等［37］首次在擬南芥中分離出LEC1基因，并發現擬南芥LEC1基因在胚胎發生時期表達，在合子胚和體細胞胚中的表達模式相類似。繼從擬南芥中克隆出LEC1基因后，先后分別在玉米［30］、胡蘿卜［38］和向日葵［39］等植物中克隆得到LEC1基因，并且與擬南芥LEC1基因具有較高的同源性。LEC1基因編碼CCAAT-box結合因子HAP3亞基的同源物，并可能以轉錄因子亞基的身份對胚胎發育相關基因的活性進行調控來調節胚胎發生［40］。研究表明，LEC1在轉基因植物中的異位表達可在營養細胞中誘導體細胞胚和類似體細胞胚結構的形成［37］。LEC1的功能缺失性突變導致胚胎停止發育和因不能忍受干燥環境而無法存活［41］。說明LEC1基因在合子胚和體細胞胚發育過程中具有重要功能。

落地生根LEC1（KdLEC1）的同源序列與擬南芥LEC1型AHAP3蛋白保守B區的蛋白序列有72.2%的同一性。KdLEC1編碼的氨基酸殘基與LEC1型具有特異性。因此，KdLEC1為LEC1的直系同源。對該基因進行序列分析，顯示KdLEC1基因的C末端區域B功能位點缺失20個核苷酸，導致其編碼的蛋白增加11個特有的氨基酸，并在B功能位點提早出現終止密碼子而形成截短的LEC1蛋白［15］。LEC1是控制胚形成和發育的關鍵調控因子。在擬南芥和其他植物中，只有在胚胎發生中能夠檢測到LEC1的表達，在營養生長中并未檢測到。在落地生根合子胚的魚雷胚階段發現KdLEC1的轉錄物，而SAM中無法檢測到，這與LEC1在擬南芥胚中的模式相似［37］，說明KdLEC1同樣是落地生根胚胎發生的標志基因。對發育中的胎生苗進行檢測分析得到KdLEC1 mRNA與KdSTM的模式相似，在胚的早期階段和心形胚階段均檢測到KdLEC1 mRNA［15］。這些結果表明落地生根胎生苗發育過程中經歷了類似器官發生和胚胎發生的階段。

lec1突變導致胚變得不耐干燥，從而使種子無法萌發［41］。KdLEC1蛋白為擬南芥LEC1蛋白的截短形態，為探究KdLEC1能否阻止擬南芥lec1突變，轉化不同版本的KdLEC1基因于WT擬南芥和lec1突變植株，結果顯示只有當KdLEC1 B功能區域的刪減核苷酸被相應的來自擬南芥LEC1-LIKE（L1L）基因的核苷酸所取代從而重建完整的B功能區域時，0.65%的lec1突變種子才產生可存活的幼苗，這個百分比與轉化LEC1基因的WT擬南芥的百分比相似［15］。說明完整的B功能區域通過給予lec1突變種子干燥耐受力來阻止lec1突變，而KdLEC1的B區缺失20個核苷酸，無法阻止lec1突變。而L1L可以阻止lec1突變，因此二者在功能上是等效的［40］。研究表明LEC1型B結構域特有的氨基酸殘基——Asp55是其調控胚胎發生的必要條件［42］。落地生根無法產生有生殖能力的干燥種子，可能是由于KdLEC1不能給予合子胚干燥耐受力［5］。

盡管KdLEC1基因B功能區域不完整，無法給予種子干燥耐受力和阻止lec1突變，為驗證其在葉片胎生苗形成中是否有獲得性附加功能，Garcês等［15］檢測了在KdLEC1下調對胎生苗發育的影響，所有KdLEC1 RNAi植株在其葉緣形成了與未轉化或轉化空載體的對照植株相同水平的胎生苗，表明落地生根胎生苗的形成不需要KdLEC1基因。KdLEC1在擬南芥胚胎發生中無法呈現正常的LEC1基因功能，在胎生苗發育過程中KdLEC1 RNA的積累可能僅僅是胚胎發生環境中啟動子響應的活化反映。

2.3 FUS3基因

FUS3基因屬LEC基因家族，編碼B3功能區蛋白［43，44］，為胚胎發生的標志基因。Luerssen等［44］發現FUS3基因在擬南芥胚胎發育早期表達，說明FUS3基因在植物胚胎發育中具有一定作用。潘麗娟等［45］對花生FUS3基因進行克隆和表達分析，推測其在花生的胚胎形成和發育中發揮重要作用。擬南芥fus3突變體在形態上與lec1突變體相似［46，47］，表明兩種蛋白調控共同的下游基因系列［48］。且有研究表明FUS3與LEC1在合子胚與體細胞胚中的表達模式相似［49］。Gaj等［50］對LEC1、LEC2和FUS3三個突變體中的體細胞胚發生情況進行分析，發現與野生型相比，3個基因的單突變體其胚胎發生頻率顯著降低，雙突變體和三突變體的體細胞胚胎發生則完全被抑制，說明LEC/FUS基因在體細胞胚發生過程中起重要作用。

落地生根FUS3（KdFUS3）蛋白與擬南芥FUS3蛋白有64%的同一性，系統發生分析顯示KdFUS3屬于單系FUS3蛋白家族。定量（q）RT-PCR結果顯示KdFUS3在落地生根的芽尖沒有顯著水平的表達，與KdLEC1類似，在授粉子房和葉緣發育的所有階段均有高水平的表達，在胎生苗發育的最晚期階段表達量達到最高。KdLEC1和KdFUS3這2個胚胎發生標志基因在胎生苗發育和授粉子房中高水平表達，而在頂端分生組織中不表達或低水平表達，說明在落地生根胎生苗發育過程中包含了與胚胎發育類似的過程［15］。然而，KdFUS3基因在胎生苗發育中的功能還不清楚，仍需進行深入研究。

2.4 SAHH基因

S-腺苷高半胱氨基酸水解酶（S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAHH）是廣泛存在于生物細胞內的一種酶，對S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）可逆水解為腺苷（adenosine，Ado）和高半胱氨酸（homocysteine）有一定的催化作用，參與細胞代謝中的甲基化作用。SAHH基因錯位突變或進行RNAi實驗，可導致SAHH功能部分缺失，植株表現為生長緩慢，生殖能力弱小或變弱［52，52］。鐘天秀等（Zhong）［53］從落地生根胎生苗差減文庫中篩選出SAHH cDNA片段，Real-time PCR檢測顯示該基因片段在胎生苗樣本中的表達量為無胎生苗的4倍。鑒于SAHH基因在胎生苗中的高表達量，推測其在胎生苗的發育過程中具有一定的作用，但其具體的功能還需進一步的研究予以確定。蘇振聲等［54］克隆了落地生根SAHH基因全長序列，運用生物信息學技術預測其編碼蛋白的理化性質及空間結構，為研究落地生根胎生苗發育的分子機制提供了基因資源和研究方向。目前為止，SAHH基因在落地生根胎生苗發育過程中的功能還有待進一步的深入研究。

3 展望

目前，對落地生根胎生苗的研究取得了一定的成果，胎生苗發育的形態學過程已經比較清楚，相關基因的研究也取得了一定進展。但是，胎生苗發育集合器官發生和胚胎發生，其具體的分子調控機制尚不明確，有必要進行深入的研究。KdSTM基因的作用機制，KdFUS3和SAHH基因在胎生苗發育中的功能仍是有待解決的問題。此外，更多相關基因的發現和探究也是有必要的。

近年來，對擬南芥的突變體進行研究得到，與植物分生組織的發生與維持有關的基因除STM基因外，還有KNOX1中的其他基因以及WUS（WUSCHEL）、CLV3（CLAVATA3）和CLV1（CLAVATA1）等基因［55］。除LEC1基因和FUS3基因外還有許多基因調節著其胚胎發生，如LEC2、KNOLLE、AGL11、AGL15及SIN等基因［56］。這些與植物器官發生和胚胎發生有關的基因在落地生根中的表達情況和具體功能仍未有所研究，未來可在相關方面進行探討和研究。隨著分子生物學技術的不斷發展與更新，以及科學界對落地生根胎生苗發育研究的不斷深入，更多與胎生苗發育相關的基因將會被陸續發現和研究，并且不僅要揭示單個基因的表達與功能，還要對基因間的聯系和配合進行一定的研究，從而進一步完善胎生苗發育的分子機制。

此外，在伽藍菜屬的一些物種中，胎生苗的形成受外界壓力、植物激素等因素的影響。羽葉垂花樹（K. pinnata）中，直到葉片脫落或用激動素處理葉片時才形成胎生苗［57］。Bryophyllum marnierianun中，葉片離開植株后在葉緣形成胎生苗，而與莖一同切除的葉片上不形成胎生苗。Kulla［58］檢測了一些激素對Bryophyllum marnierianun離體葉片胎生苗形成的影響，其中生長素對其沒有影響，而細胞分裂素中的玉米素、激動素和芐氨基嘌呤（BAP）強烈抑制胎生苗的發育，揭示細胞分裂素在葉片與植株連接時是使胎生苗原基保持休眠的因素。此外，生長素和乙烯對胎生苗根系的發育具有一定的影響，只有當來自胎生苗頂芽的生長素積累到某一臨界值時根系才開始發育，乙烯則通過降低該臨界值而使根系發育提早［59］。迄今為止，外界壓力及植物激素等對落地生根胎生苗發育的影響尚不清楚，未來仍需在相關方面進行深入研究，以期探討胎生苗發育的機理。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Plantlet Development and Relevant Genes of Kalancho? daigremontiana

JIANG Wen-ting ZENG Hui-ming
（School of Forestry，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

Kalancho? daigremontiana reproduces asexually by forming plantlets on the leaves. During the developing process，the plantlets experience the various stages similar to that of zygotic embryo. The development of the plantlet share features of both organogenesis and embryogenesis. Research has shown that SHOOT MERISTEMLESS（STM）gene is required for the formation of plantlet. LEAFY COTYLEDON 1（LEC1）gene is expressed during the development of plantlet，however，it is not needed in the formation of the plantlet of K. daigremontiana. The functions of FUSCA3（FUS3），SAHH and other relevant genes in the development of the plantlet of K. daigremontiana still needs further investigation. This paper summarized the development of K. daigremontiana plantlet and relevant genes，aiming at providing some references for related researches.

Kalancho? daigremontiana；plantlet；STM；LEC1；FUS3

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.002

2015-12-03

“863”計劃項目（2013AA102607）

蔣文婷，女，碩士研究生，研究方向：草坪草生物技術育種；E-mail：jiangwentinghaha@163.com

曾會明，男，博士，副教授，研究方向：草坪草生物技術育種；E-mail：sciinfo@bjfu.edu.cn