高山被孢霉的基因組及轉錄組的提取技術研究

凌瑞孫立潔，2陳祥松袁麗霞吳金勇姚建銘

（1. 中國科學院合肥物質科學研究院等離子體物理研究所，合肥 230031；2. 中國科學院湖北產業技術創新與育成中心，武漢 430072）

技術與方法

高山被孢霉的基因組及轉錄組的提取技術研究

凌瑞1孫立潔1，2陳祥松1袁麗霞1吳金勇1姚建銘1

（1. 中國科學院合肥物質科學研究院等離子體物理研究所，合肥 230031；2. 中國科學院湖北產業技術創新與育成中心，武漢 430072）

基因組和轉錄組的高通量測序對樣品的純度和含量要求較高，旨在通過研究高山被孢霉在不同培養條件下和采用不同菌絲處理方法對其基因組和轉錄組質量的影響來確定最佳提取方式。結果表明，PDA培養基培養的菌絲與發酵培養基培養的菌絲經基因組提取后在瓊脂糖凝膠電泳中有明顯不同的表現，使用發酵培養基培養的菌絲提取的基因組DNA無降解，而以PDA培養基培養的菌絲提取的基因組DNA出現部分降解。在使用國產試劑盒做高山被孢霉轉錄組RNA提取實驗中發現，使用液氮速凍后破碎菌絲并結合使用β-疏基乙醇更易提取到高濃度且無降解的轉錄組樣品。

高山被孢霉；基因組；轉錄組；提取技術

隨著微生物分子技術的發展，對真菌基因組和轉錄組進行全序列測定進而分析關鍵酶、基因及其動態變化是定向改造菌種特性的依據，并已逐漸成為微生物領域的研究熱點。提取基因組和轉錄組則是測序的第一步，其質量及收率決定著能否進行有效測序并得到高質量數據。多種真菌的基因組提取方法已見報道［1-3］，但每種真菌有其獨特的生理特性，基因組和轉錄組的提取技術和方法不盡相同。高山被孢霉（Mortierella alpina）是一類絲狀真菌，是工業化生產花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）的高產菌種，在基因序列中，有高達60%的基因參與脂肪酸代謝［4］。

高山被孢霉培養條件一般有3種：PDA固體培養基、PDA液體培養基和發酵培養基。由PDA固體培養基及PDA液體培養基培養的菌絲提取基因組的優勢在于簡單易行、節約培養時間；其缺點是菌絲量較小，易受PDA培養基中馬鈴薯DNA的干擾；由液體發酵培養基中的菌絲提取基因組的優勢在于菌絲量大，可降低外源DNA干擾，提取效率高，缺點是培養時間過長，操作相對繁瑣復雜。

高山被孢霉轉錄組的提取過程相對于基因組提取過程對環境和操作技術的要求更高、更復雜。對于高山被孢霉轉錄組的提取方法報道較少［5］，隨著生物技術的快速發展，使用繁瑣的化學試劑進行各類生物和細胞組織的基因組和轉錄組的提取已基本被方便快捷高效的試劑盒所取代，而進口的試劑盒價格高昂，使得很多實驗室望而卻步。本研究首次使用國產試劑盒對高山被孢霉轉錄組進行提取，并通過電泳、OD值、RT-PCR進行驗證，旨在確定提取高山被孢霉轉錄組的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 高山被孢霉Mortierella alpina cfcc88447，購于中國林業微生物菌種保藏管理中心。高山被孢霉Mortierella alpina G2，由本實驗室分離獲得，菌種以甘油管保存于-80℃冰箱內，每6個月轉存一次。

1.1.2 儀器和設備 氣相色譜儀：GC1690，島津；自動凝膠成像儀：JS-680D，500萬像素，上海培清；流式芯片：Agilent 2100 生物分析儀，美國；微量紫外分光光度計：Thermo NANODROP，美國；PCR擴增儀：Bio-Rad，MyCycler，美國。

1.2 方法

1.2.1 培養基 PDA固體培養基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，KH2PO40.05%，MgSO40.025%，pH自然。PDA液體培養基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.05%，MgSO40.025%，pH自然。菌種種子液培養基：葡萄糖8%，酵母粉2%，pH自然。菌種發酵培養基：葡萄糖8%，酵母粉2%，pH自然。

1.2.2 菌種的培養與菌絲收集 菌種活化：將甘油管保存的菌種分別轉接到PDA固體及液體培養基，28℃培養5-8 d，濕度40%-60%。

接種方式：制備菌懸液，按5%的接入量至100 mL種子液培養基，220 r/min，28℃，培養3 d。

發酵培養：按8%的接入量接入100 mL發酵培養基，220 r/min，28℃，培養7-10 d。

菌絲收集：刮取PDA固體培養基表面菌絲，避免刮到培養基。PDA液體培養基及發酵培養基中的菌絲使用接種環挑取，于無菌條件下使用超純水反復清洗4-5次，將洗凈菌絲轉移至無菌燒杯中。

1.2.3 高山被孢霉基因組提取 菌絲處理方法：將清洗完全的PDA固體培養基菌絲、PDA液體培養基和發酵培養菌絲置于真空冷凍干燥機中抽真空24 h至菌絲完全干燥，干燥后的菌絲放于研缽中，倒入液氮進行研磨，將菌絲研磨的盡量細，收集菌粉，轉到離心管中。基因組提取方法：稱取菌粉0.04 g，使用QIAGEN試劑盒DNeasy Plant Mini Kit進行抽提。

1.2.4 高山被孢霉轉錄組提取 挑取發酵6 d的高山被孢霉菌絲至15 mL離心管中，用DEPC處理水清洗菌絲，反復多次，盡量去除多余水。稱量菌絲0.5 g至離心管中，使用北京艾德萊生物科技有限公司的RN38-EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取［6］；比較對破碎組織及分離RNA的兩種方法，方法一是直接取新鮮的菌絲組織稱取。0.5 g放入研缽，加入裂解液室溫下充分研磨成勻漿，迅速研磨讓組織和裂解液立即充分接觸以抑制RNA酶活性；方法二是稱取0.5 g菌絲用液氮速凍后取出立即進行研磨，加強菌絲壁的裂解程度，研好后呈細漿狀。此時加入5% β-巰基乙醇及裂解液，于65℃水浴中預熱，加入到研磨好的菌漿中立即吹打混勻裂解，振蕩混勻后按照試劑盒步驟進行提取。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 菌體生物量的測定 搖瓶發酵結束后，發酵液用布氏漏斗進行抽慮；抽干的菌體會形成菌餅，計算干重W即為生物量。

1.2.6.2 總油脂抽提和計算方法（索氏提取法）將烘干的菌體放入研缽進行研磨至細小的顆粒狀，稱取上述研磨的顆粒（粉末）1-2 g，取精確值W0，用濾紙包住，系上棉繩，放入烘箱105℃烘至恒重（約30 min），稱濾紙包重量W1；將烘后的濾紙包放入索氏提取器內，用石油醚進行索氏提取，8-10 h后取出，105℃烘干，稱紙包重量W2。

總油脂%=（W1-W2）/ W0×100%

1.2.6.3 油脂中ARA百分含量的測定和計算 （1）樣品處理（甲酯化）：稱取研磨菌渣0.1 g左右，加入0.5%氫氧化鉀甲醇溶液1 mL，60℃水浴30 min，每5 min搖勻一次，加入三氟化硼甲醇溶液1 mL，60℃水浴30 min，每5 min搖勻一次，取出后，加入2 mL正己烷，混勻后加入1 mL飽和氯化鈉溶液，反應完畢。4 000 r/min離心5 min，取上層進行氣相檢測。（2）氣相色譜條件：DB-23ms（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛細管色譜柱柱；柱溫程序：90℃保持1 min，以9℃/min升至240℃，保持5 min；載氣：氮氣；流速：約2.0 mL/min；進樣口溫度：250℃；進樣模式：分流進樣（分流比1∶10）；進樣量：1 μL；檢測器溫度：280℃。（3）計算方法：ARA百分含量的計算使用的是面積歸一法，即ARA在氣相檢測圖譜中的峰面積占總峰面積的百分比。

1.2.7 瓊脂糖凝膠電泳對基因組的分析 DNA樣品進行電泳：取1 μL loading buffer（6×）與5 μL DNA樣品混合，緩慢將樣品及Marker分別注入加樣孔中，跑膠電壓90 V。在瓊脂糖凝膠電泳成像系統中使用配套軟件，進行樣品質量分析。樣品濃度使用Thermo NANODROP設備進行測定。

1.2.8 瓊脂糖凝膠電泳對轉錄組的分析 RNA樣品進行電泳：取1 μL loading buffer（6×）與5 μL RNA樣品混合，緩慢將樣品及Marker分別注入加樣孔中，跑膠電壓100 V。在瓊脂糖凝膠電泳成像系統中使用配套軟件，進行樣品質量的分析。樣品濃度使用Thermo NANODROP設備進行測定。

1.2.9 RT-PCR 取1.2.4中方法二提取的轉錄組，使用北京艾德萊生物科技有限公司的PC1801試劑盒合成第一鏈cDNA。引物設計：選取高山被孢霉GMER蛋白設計引物進行RT-PCR，即LR1：5'-AT GTCTCCCTCAAAGTCGGTCATCATGGTC-3'；LR2：5'-CCATAGTTGGAGTCGTGGGGAGGTCCTT-3'。反應體系：使用北京艾德萊生物科技有限公司的PC0902 Taq PCR MassterMix。PCR擴增程序如為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1-2 kb/min，共40個循環；72℃ 8 min。

1.2.10 高山被孢霉結晶紫染色方法 載玻片固定：在無菌條件下，用接種環挑取少量菌絲于干凈的載玻片上涂布均勻，加熱以殺死菌種并使其粘附固定；草酸銨結晶紫染1 min；自來水沖洗，去掉浮色。

2 結果

2.1 高山被孢霉菌絲來源對基因組提取的影響

對PDA固體培養基培養的高山被孢霉菌絲、PDA液體培養基中的菌絲和三角瓶中培養的液體發酵菌絲進行同等條件下的基因組提取實驗，比較菌絲生理狀態、提取純度和提取收率，并確定最優的基因組提取方法。本實驗所使用菌種為高山被孢霉cfcc88447，培養于PDA固體培養基、PDA液體培養基的菌絲與發酵培養基中生長的菌絲略有不同（表1），顯微鏡觀察染色后的對比圖片見圖1，染色前培養于PDA固體培養基、PDA液體培養基和發酵培養基中的菌絲生長狀態，見圖2。

瓊脂糖凝膠電泳圖（圖3）顯示，PDA培養基中菌絲提取的基因組條帶不清晰，并出現了嚴重拖尾現象（圖3中泳道1和2），而Marker樣品的條帶清晰，分離效果較好，證明電泳條件無問題。相對比而言，使用液體發酵菌絲提取的高山被孢霉基因組條帶非常清晰，無拖尾現象。經反復實驗證實，均出現此結果，表明PDA培養基培養的高山被孢霉菌絲用作基因組提取原料，樣品出現了部分DNA斷裂現象，且培養基中的馬鈴薯不易徹底去除，從而導致對DNA樣品造成污染，進而對基因組測序造成干擾，影響DNA測序過程的分析和結果的準確性。對基因組樣品進行收率計算，使用液體發酵菌絲提取的基因組收率高且條帶清晰，滿足測序要求（表2）。

2.2 高山被孢霉轉錄組提取方法的嘗試和改進

進口轉錄組提取試劑盒價格昂貴，且并非適合所有微生物轉錄組的提取，有時出現提取效率低，轉錄組純度和質量不理想等問題。本研究首次嘗試使用國產轉錄組試劑盒進行高山被孢霉的轉錄組提取［7，8］，研究使用國產試劑盒提取高山被孢霉的轉錄組提取效果和條件，如該方法成功，將大大節約提取成本，還可對國產品牌起到一定的宣傳推廣作用。該實驗所用菌株為本實驗室保存的高山被孢霉G2菌。按照試劑盒提供方法所述進行轉錄組提取實驗，見1.2.4中的具體提取方法描述，使用方法一中所述的在新鮮的菌絲體中加入裂解液，室溫下將菌絲充分研磨成勻漿，經反復實驗，該方法提取得到的RNA濃度偏低達不到轉錄組測序所需總量和濃度要求（圖4中泳道1），推測由于高山被孢霉細胞壁中幾丁質含量較高，普通裂解液不能對其進行完全破碎，導致RNA釋放受限，收率偏低。因而，在菌絲體處理方法上加以改進，使用1.2.4中所述的方法二進行提取，并用液氮對菌絲進行迅速冷凍加強菌絲壁的破碎程度，然后使用裂解液及β-巰基乙醇的共同作用來裂解細胞壁釋放總RNA（圖4泳道2），經反復實驗，均證明RNA濃度提高了10-20倍以上，5S條帶非常弱，說明RNA無明顯降解，經RTPCR，成功獲得GMER的基因片段（圖4泳道3），因此所獲高山被孢霉轉錄組的濃度和質量均達到測序的標準［9］，具體濃度見表3。

圖1 高山被孢霉PDA固體培養基（A）、PDA液體培養基（B）、發酵培養基（C）經草酸銨結晶紫染色后的形態比較

圖2 高山被孢霉PDA固體培養基菌絲（A）、PDA液體培養基菌絲（B）、發酵培養基菌絲（C）的形態比較

表1 高山被孢霉（cfcc 88447）不同培養條件下菌絲主要特點

圖3 菌絲不同培養方式提取基因組的瓊脂糖凝膠成像圖譜比較

根據表3中數據顯示可知，使用兩種方法所獲得的RNA最終的A260/A230均大于2，說明使用該試劑盒脫鹽較充分，A260/A280均大于2，且在數值2.2左右，說明蛋白去除較徹底，經比較兩種菌絲的前處理方法，證明以第二種方法，將菌絲速凍后進行研磨提取，并加入β-巰基乙醇，可大大提高RNA收率，其質量也可達到測序所需標準。綜合分析證明該試劑盒適合于高山被孢霉的轉錄組提取。

表2 高山被孢霉（cfcc 88447）不同培養條件下提取基因組質量比較

圖4 RNA及RT-PCR瓊脂糖凝膠成像

表3 菌絲破裂處理方法對轉錄組RNA質量的影響比較

2.3 高山被孢霉基因組和轉錄組提取所使用的發酵菌絲的驗證

高山被孢霉的每批次發酵是否正常主要是通過評判發酵菌絲的生物量、其中總油脂含量和ARA的百分含量這3項指標，用以作為任何下一步實驗結果討論的基本依據。本研究中所涉及的基因組和轉錄組提取條件和技術的研究所使用的發酵菌絲體均同步進行了該3項指標的測定，達到預期水平后方可進行下一步的提取條件和技術的研究工作，ARA的GC圖譜見圖5，ARA的峰出現在17.763 s，含量為油脂總量的31.8791%。提取用菌絲發酵產量及正常發酵取值范圍，見表4。

圖5 氣相檢測ARA圖譜

表4 高山被孢霉發酵產量

3 討論

高山被孢霉屬于長菌絲真菌類，含有豐富的多糖和蛋白質，菌絲壁較厚，在不同的培養基中培養的菌絲體狀態均不相同，需找出可提取高質量DNA的菌絲體培養來源，以滿足基因組測序和其他分子生物學操作的高標準要求。在真菌菌絲來源方面，本研究嘗試了使用來源為PDA固體培養基、PDA液體培養基和發酵培養基的菌絲作為實驗材料，經反復證明，PDA固體培養基和PDA液體培養基培養的菌絲提取的基因組出現部分降解斷裂現象，并不適合用于DNA提取，推測是由于PDA培養基中含有馬鈴薯，不易去除干凈，可干擾最終DNA的純度影響測序結果，并且可能由于PDA培養基培養的菌絲內可降解DNA的酶含量較高，或者馬鈴薯中可降解高山被孢霉的DNA酶難以去除導致最終DNA的部分降解。而使用發酵液培養的菌絲作為原料進行基因組的提取，可獲得符合要求的高質量DNA，無斷裂降解，且收率較高，可滿足包括基因組測序在內的各類分子生物學操作分析使用。關于真菌的基因組提取方法，文獻中多有報道，一般可采用冷凍研磨CTAB法及試劑盒提取法，所得的總DNA純度和濃度也較高，較適合分子生物學操作的要求［10］。另有文獻指出采用微波爐加熱法取代液氮研磨以使絲狀真菌破壁，也達到了較好的提取效果［11-13］。

經本研究表明，使用國產試劑盒用于提取高山被孢霉轉錄組，方法簡易，效率高，蛋白質殘留少，效果穩定，重復性好等優點，經電泳、OD值、RTPCR三種方法的驗證，提取的RNA適合于轉錄組測序及常規分子生物學分析，在液氮研磨及β-巰基乙醇的提取方法中，經證明可增加RNA收率在10-20倍以上，并且RNA無降解。推測可能是由于真菌組織中含有一定量的酚類化合物，其被氧化后與RNA結合，從而導致RNA分離困難，β-疏基乙醇的加入可避免酚類化合物被氧化，進而提高RNA的終濃度。而且，高山被孢霉菌絲體長且細胞壁因幾丁質含量較高，使用常規的普通裂解液很難將壁完全破碎，因此使用低溫速凍的物理學破壁方法配合裂解液才能達到完全或大部分破壁的目的，提高收率，同時提取轉錄組所用菌絲的發酵產量正常，通過新一代測序技術可以有效確定高山被孢霉發酵期間基因表達情況。

因不同真菌或植物在細胞壁結構、轉錄組大小及酚類等雜質對RNA提取的影響，在提取過程中，對試劑盒的基本方法加以改進已較為普遍。除了本研究提到的改進方法，另有研究表明在進行葡萄葉片RNA提取時，延長提取試劑與樣品的接觸時間操作可以顯著提高RNA提取純度［14］。隨著轉錄組的研究及RNA-Seq逐步受到重視，利用新一代測序技術能夠更為快速、準確地為人們提供更多的生物體轉錄信息，進而揭示生物體的基因表達、研究結構變異及發現新基因等［15］。

4 結論

在基因組提取過程中，經本研究對高山被孢霉3種培養方式的對比表明，PDA固體培養基及PDA液體培養基培養的高山被孢霉菌絲因出現了部分DNA斷裂、培養基中的馬鈴薯對DNA樣品造成污染等，提取的DNA會影響測序結果的分析及準確性。與之相反，使用液體發酵液中培養的菌絲提取的高山被孢霉基因組條帶清晰基本無降解，且收率較高，可用于DNA測序分析。在轉錄組提取過程中，使用經改進的菌絲前處理方法，即使用快速冷凍物理方法，并配合β-巰基乙醇的共同作用，經證明可大大增加RNA收率，且RNA降解率非常化純度高，所提RNA適于測序或其他相關研究。

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（責任編輯 狄艷紅）

Technologies of Extracting Genome and Transcriptome from Mortierella alpina

LING Rui1SUN Li-jie1，2CHEN Xiang-song1YUAN Li-xia1WU Jin-yong1YAO Jian-ming1
（1. Institute of Plasma Physics Chinese Academy of Sciences，Hefei Institute of Physical Science，Chinese Academy of Sciences，Hefei 230031；2. Hubei High-tech Innovation and Business Incubation Center，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072）

High-throughput sequencing of transcriptome and genome demands the high purity and content of sample，the purpose of this work is to determine the optimal extraction technology by studying the effects of Mortierella alpina in different culture conditions and using different hypha processing methods on the genome and transcriptome quality. The results showed that the mycelium from liquid fermentation medium after genome extraction presented a significant difference in agarose gel electrophoresis compared to the mycelium from PDA culture medium，the former gave degradation-free genome DNA but the latter was extracted genomic DNA of some degradation. During using domestic brand kit to study M. alpina tanscriptome RNA extraction，it was found that using liquid nitrogen fast-frozen method to break the hypha cell wall combined with applying β-Mercaptoethanol resulted in more likely to extract the high concentration and no-degradation transcription sample.

Mortierella alpina；genome；transcriptome；extraction technology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.005

2015-09-06

國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）（2014AA021703），教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目（教外司留［2013］693號）

凌瑞，女，碩士研究生，研究方向：微生物發酵工程與代謝調控；E-mail：lrr@mail.ustc.edu.cn

姚建銘，男，研究員，研究方向：低能離子束誘變育種、微生物發酵工程與代謝調控；E-mail：jmyao@ipp.ac.cn

孫立潔，女，副研究員，研究方向：微生物發酵工程與代謝調控；E-mail：ljsun@ipp.ac.cn