重組溶葡萄球菌酶成品蛋白含量測定方法的建立

許燕張宜濤葉貴子陸海榮黃青山

（1. 復旦大學生命科學院遺傳學研究所，上海 200433；2. 昆山博青生物科技有限公司，昆山 215316）

重組溶葡萄球菌酶成品蛋白含量測定方法的建立

許燕1，2張宜濤2葉貴子2陸海榮1黃青山1，2

（1. 復旦大學生命科學院遺傳學研究所，上海 200433；2. 昆山博青生物科技有限公司，昆山 215316）

重組溶葡萄球菌酶（recombinant lysostaphin，rLysn）對金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌活性，是一種新型抗菌藥物，含有該酶的藥用制劑在臨床上能有效控制金葡菌感染。為在rLysn成品中增加蛋白含量測定以控制制劑的質量，建立了成品中rLysn蛋白含量測定方法，并進行驗證。采用體積排阻高效液相色譜法（size exclusion high performance liquid chromatograph，SEHPLC）測定rLysn理化對照品及成品蛋白質含量。色譜柱：TSK gel 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 μm）；流動相：20 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）+0.3 mol/L NaCl；流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：280 nm。結果顯示，rLysn在2-32 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r2=1）；低、中、高3種濃度的rLysn理化對照品空白加標平均回收率為102.9%，成品加標平均回收率為102.1%；3種不同上樣量在不同時間內測定，蛋白含量RSD＜1%；每隔1 h測定同一支供試品溶液，蛋白含量RSD為0.98%；同一批供試品溶液取6份進樣，蛋白含量RSD為1.71%。實驗結果表明，采用SE-HPLC方法簡便，準確性、精密度、穩定性及重復性好，可用于rLysn成品蛋白質含量的測定。

重組溶葡萄球菌酶；蛋白質含量；體積排阻高效液相色譜法

金黃色葡萄球菌是臨床最常見的化膿性球菌，是醫院交叉感染的主要來源［1-3］。金葡菌感染能誘發多種疾病，且容易引發大規模爆發性感染，尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的多藥耐藥性和交叉耐藥性給臨床治療帶來極大的困難［4-11］。目前，以萬古霉素為代表的糖肽類抗生素是治療MRSA感染的首選用藥。但是，近年來，由于萬古霉素的應用增加，陸續發現對萬古霉素中介和耐藥的金葡菌（VISA和VRSA）［12-14］。因此，迫切需要開發與傳統抗生素作用模式不同的新型抗菌藥物。

溶葡萄球菌酶（lysostaphin，Lysn）是一種含Zn2+的金屬蛋白酶，具有肽鏈內切酶活性［15］，能特異性地水解金葡菌細胞壁肽聚糖交聯結構甘氨酸五肽橋，從而產生破壁溶菌作用，具有極強的抗金葡菌活性［16-18］。體外條件下rLysn清除金葡菌的作用非?？?，在≥MIC水平（約0.03-0.125 μg/mL），對受試菌通常30 min 內可殺滅90%以上，2-4 h可殺滅99.9%以上［19］。對MRSA也有同樣顯著的體外抗菌效果，并且優于糖肽類抗生素萬古霉素［20-22］。Lysn對金葡菌具有的快速溶菌作用，使得其成為國內外研發抗耐藥金葡菌感染的熱點［23-25］。目前國內已經將重組溶葡萄球菌酶（recombinant lysostaphin，rLysn）研制成藥用制劑，用于治療皮膚創面金葡菌感染。

對rLysn成品中的蛋白含量測定，可以控制和評價rLysn成品的質量。由于rLysn在制劑制備過程中加入了人血白蛋白作為保護劑，常規的蛋白含量測定方法不適合成品中蛋白含量的測定。目前采用的C18柱反相高效液相色譜法測定rLysn成品蛋白質含量［26］，但該法的分離效果不好，且洗脫程序復雜。本實驗采用體積排阻高效液相色譜法（size exclusion-high performance liquid chromatography，SEHPLC），測定rLysn成品中的蛋白含量，旨在高效分離rLysn和人血白蛋白，并簡化實驗流程，為提高rLysn成品質量標準奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和標準品 rLysn理化對照品（蛋白含量為619 μg/支，批號：20120202）、rLysn成品（400 U/支，批號：20120801）、不含rLysn的空白制劑（安慰劑，批號：20120802），上海高科聯合生物技術研發有限公司制備。

1.1.2 主要試劑及儀器 Agilent 1260 HPLC色譜儀，美國Agilent公司；色譜柱：TSK gel 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 μm），日本Tosoh公司；NaCl，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4，分析純，國藥集團。

1.1.3 色譜條件 色譜柱：TSK gel 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 μm）；流動相：20 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）含0.3 mol/L NaCl；流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：280 nm。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 對照品溶液 將rLysn理化對照品用超純水溶解并稀釋制成1 mg/mL和1.6 mg/mL的溶液。

1.2.1.2 供試品溶液 取rLysn成品1支，用1 mL超純水溶解。

1.2.2 方法的驗證

1.2.2.1 線性分析 取1 mg/mL理化對照品溶液，分別進樣2、4、8、16和32 μL，按此進樣量各重復進樣2次，以進樣量（μg）為橫坐標，樣品峰面積（S）為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，計算相關系數（r2）。

1.2.2.2 準確性驗證 取1.6 mg/mL理化對照品溶液將空白制劑和rLysn成品溶解并稀釋至理化對照品加標終濃度分別為0、0.2、0.4和0.8 mg/mL，每一濃度上樣20 μL。計算加標回收率。按照上述方法重復測定3次。

1.2.2.3 精密度驗證 用濃度為1 mg/mL的理化對照品溶液，采用體積法進樣，分別進樣4、8和16 μL，得到低、中、高3種進樣量（4、8和16 μg）的峰面積。每一種進樣量在不同工作日分別測定一次，計算每一種進樣量的峰面積的均值、標準差和RSD。

1.2.3 穩定性 取同一份供試品溶液，每次上樣20 μL，每小時進樣1次，共6次，計算rLysn峰面積和RSD。

1.2.4 重復性 取同一批供試品溶液6份，分別進樣1次，每次上樣20 μL，計算rLysn峰面積和RSD。

2 結果

2.1 SE-HPLC色譜分析

rLysn理化對照品及rLysn成品的SE-HPLC色譜圖（圖1）顯示，rLysn和人血白蛋白的分離度大于2.5，表明本色譜方法能夠滿足成品中各組分達到基線分離。

圖1 SE-HPLC色譜分析圖

2.2 方法的驗證

2.2.1 線性范圍 經5次進樣，計算峰面積，結果見下表1，得到的回歸方程和相關系數分別為y=185.93x-2.0042，r2=1；y=189.46x-17.138，r2=1；y=188.49x-6.9125，r2=1。結果表明，rLysn在2-32 μg范圍內與峰面積成良好的線性關系（注：后續數據均由回歸方程Y=189.46x-17.138，r2=1得出）。

2.2.2 準確性 空白制劑加標回收率結果見表2，3種濃度的加標回收率在101.6%、103.8%和103.5%，平均回收率為102.9%，表明該測定方法準確性高。成品加標回收率結果見表3，3種濃度的加標回收率分別為105.8%、98.7%和101.8%，平均回收率為102.1%，進一步表明該測定方法準確性高。

表1 五種不同上樣量rLysn理化對照品的峰面積

2.2.3 精密度 3種不同上樣量的rLysn理化對照品，分別于不同試驗日進行精密度試驗。數據取自3次標準曲線實驗結果（表4），RSD＜1%，表明該方法精密度高。

2.2.4 穩定性 取同一份供試品溶液，每小時進樣1次，共6次，結果見表4，RSD為0.98%，表明樣品溶解后在6 h內穩定性良好。

2.2.5 重復性 取同一批供試品溶液6份，分別進樣1次，共6次，結果見表4，RSD為1.71%，表明該方法重復性良好。

3 討論

rLysn對金葡菌具有良好的體外抗菌活性，且對甲氧西林敏感的金葡菌（MSSA）和MRSA有同樣顯著的抗菌效果。rLysn藥用制劑，能有效治療金葡菌感染，且不易產生耐藥性［27］。對rLysn制劑中主藥蛋白即rLysn含量進行測定，能有效控制和評價制劑的質量。

由于rLysn凍干粉制劑中含有人血白蛋白，為了確定成品中rLysn的蛋白質含量，需要選用一種合適的方法，能夠將rLysn與人血白蛋白有效分離，同時又能定量測定rLysn的蛋白質含量。根據兩者分子量大小差異，采用體積排阻高效液相色譜法，將成品中的rLysn與其它作為保護劑的蛋白成分按照分子量大小進行分離。由于選擇體積排阻高效液相法，洗脫程序變得簡化，我們選擇含氯化鈉的磷酸緩沖液作為流動相。該方法在一定條件下，可以將rLysn和人血白蛋白有效分離，在2-32 μg上樣量范圍內，rLysn理化對照品上樣量和峰面積之間呈現良好的線性關系，相關系數r2=1。因此，可以制備標準曲線，根據成品中rLysn的峰面積計算出成品中rLysn的蛋白質含量。

表2 三種濃度的空白制劑加標回收率結果

表3 三種濃度的成品加標回收率結果

表4 SE-HPLC法的精密性、穩定性及重復性驗證結果

與RP-HPLC法相比，SE-HPLC法能更好的分離rLysn和人血白蛋白，該法的線性范圍2-32 μg比RP-HPLC法的5-30 μg范圍更寬，準確性比RPHPLC法更好，精密度（RSD＜1%）遠高于RP-HPLC法（RSD在3%-6%），且穩定性良好。在rLysn成品蛋白質含量測定上，SE-HPLC比RP-HPLC更加簡便、準確，更適合用于rLysn成品蛋白質含量測定。

4 結論

本實驗建立了一種測定rLysn成品蛋白質含量的SE-HPLC法，該方法簡便、準確、重復性好。在該方法確定的測定條件下，可以將rLysn和人血白蛋白有效分離，并且以rLysn理化對照品作對照，在一定上樣量范圍內，可以對樣品中的rLysn進行準確定量。該方法可用于rLysn成品蛋白質含量的測定，從而更好的控制和評價該制劑的質量。

［1］李勝利, 張嬰元, 吳菊芳, 等. 葡萄球菌醫院感染的調查研究［J］. 中華醫院感染學雜志, 1998, 8（2）：65-67.

［2］李梓萌, 孫志, 李威, 等. 金黃色葡萄球菌的耐藥性分析及流行病學分型［J］. 中華醫院感染學雜志, 2012, 22（12）：2485-2487.

［3］周勇, 楊樂和, 林雪峰, 等. 金黃色葡萄球菌臨床分離株的耐藥譜變遷［J］. 中華醫院感染學雜志, 2012, 22（11）：2409-2411.

［4］Edelsberg J, Weycker D, Barron R, et al. Prevalence of antibiotic resistance in US hospitals［J］. Diagn Microbiol Infect Dis, 2014, 78（3）：255-262.

［5］Hudson LO, Murphy CR, Spratt BG, et al. Diversity of methicillinresistant Staphylococcus aureus（MRSA）strains isolated from inpatients of 30 hospitals in Orange County, California［J］. PLoS One, 2013, 8（4）：e62117.

［6］K?ck R, Becker K, Cookson B, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）：burden of disease and controlchallenges in Europe［J］. Eurosurveillance, 2010, 15（41）：19688.

［7］中華醫學會甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌感染治療策略專家組. 中華醫學會感染與抗微生物治療策略高峰論壇：甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌感染的治療策略—專家共識［J］. 中國感染與化療雜志, 2011, 11（6）：401-416.

［8］鄭燕紅, 蔡海明. 臨床感染病原菌分布及耐藥菌分析［J］. 醫藥導報, 2011, 30（9）：1222-1223.

［9］趙先穎, 徐元宏, 江曉平. 醫院感染葡萄球菌菌種變遷與耐藥性近況［J］. 中國微生態學雜志, 2003, 15（1）：40-46.

［10］余慧菊, 康金鳳, 劉瑛. 合理應用抗菌藥物能減緩細菌耐藥性產生［J］. 中國科技信息, 2005（12）：136-141.

［11］Grundmann H, Aires-de-Sousa M, Boyce J, et al. Emergence and resurgence of meticillin-resistant Staphylococcus aureus as a public-health threat［J］. Lancet, 2006, 368：874-885.

［12］Khare M, Keady D. Antimicrobial therapy of methicillin resistant Staphylococcus aureus infection［J］. Expert Opin Pharmacother, 2003, 4（2）：165-177.

［13］Howden BP, Davies JK, Johnson PDR, et al. Reduced vancomycin susceptibility in Staphylococcus aureus, including vancomycinintermediate and heterogeneous vancomycin-intermediate strains：resistance mechanisms, laboratory detection, and clinical implications［J］. Clinical Microbiology Reviews, 2010, 23（1）：99-139.

［14］劉亞麗, 徐英春. 異質性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌：困擾我們的難題［J］. 中國感染與化療雜質, 2013, 13（6）：495-498.

［15］Park PW, Senior RM, Griffin GL, et al. Binding and degradation of elastin by the staphylolytic enzyme lysostaphin［J］. Int J Biochem Cell Biol, 1995, 27（2）：139-146.

［16］Ehlert K, Tschierske M, Mori C, et al. Site-specific serine incorporation by Lif and Epr into positions 3 and 5 of the staphylococcal peptidoglycan interpeptide bridge［J］. Journal of Bacteriology, 2000, 182（9）：2635-2638.

［17］Climo MW, Ehlert K, Archer GL. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45（5）：1431-1437.

［18］Harrison EF, Cropp CB. Comparative in vitro activities of lysostaphin and other antistaphylococcal antibiotics on clinical isolates of Staphylococcus aureus［J］. Appl Environ Microb, 1965, 13（2）：212-215.

［19］Yang XY, Li CR, Lou RH, et al. In vitro activity of recombinant lysostaphin against Staphylococcus aureus isolates from hospitals in Beijing, China［J］. J Med Microbiol, 2007, 56（1）：71-76.

［20］楊信怡, 游雪甫, 蔣建東. 溶葡球菌酶的抗菌活性研究進展［J］. 中國新藥雜志, 2005, 14（9）：1113-1117.

［21］楊信怡, 游雪甫, 婁人慧, 等. 重組溶葡球菌酶的體外抗菌活性研究［J］. 中國新藥雜志, 2006, 15（24）：2107-2111.

［22］陳旭, 王文奎, 孟志民, 等. 重組溶葡萄球菌素對燒傷創面分離的金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性評估［J］. 上海交通大學學報：醫學版, 2012, 32（11）：1411-1414.

［23］Shaw LN, Golonka E, Szmyd G, et al. Cytoplasmic control of premature activation of a secreted protease zymogen：deletion of Staphostatin B（SspC）in Staphylococcus aureus 8325-4 yields a profound pleiotropic phenotype［J］. Journal of Bacteriology, 2005, 187（5）：1751-1762.

［24］Zygmunt WA, Harrison EF, Browder HP. Microbiological activities of lysostaphin and penicillins against bacteriophage 80/81 strains of Staphylococcus aureus［J］. Appl Environ Microb, 1965, 13（3）：491-493.

［25］楊信怡, 游學甫, 蔣建東. 溶葡球菌酶研究進展［J］. 中國生化藥物雜志, 2005, 26（6）：372-374.

［26］莫云杰, 李國棟, 陸海榮, 等. 重組溶葡萄球菌酶成品中主藥蛋白質含量的測定［J］. 中國生化藥物雜志, 2006, 27（3）：163-165.

［27］盧曦, 任志濤, 李聰然. 重組溶葡萄球菌酶體外誘導的金黃色葡萄球菌耐藥株生物學特征［J］. 中國感染與化療雜志, 2015, 15（3）：230-235.

（責任編輯 狄艷紅）

Establishment of A Method for Determination of Protein Content in the Final Product Containing Recombinant Lysostaphin

XU Yan1，2ZHANG Yi-tao2YE Gui-zi2LU Hai-rong1HUANG Qing-shan1，2
（1. Institute of Genetics，School of Life Sciences，Fudan University，Shanghai 200433；2. Kushan BioGreen Technology Co.，Ltd.，Kunshan 215316）

Recombinant lysostaphin（rLysn），duo to its solid antibacterial activity to Staphylococcal aureus，is novel antibacterial medicine，and therapeutic agent containing this enzyme may efficiently control the infection of S. aureus. In order to control the quality of pharmaceutical preparations with rLysn，a method of measuring the protein content in the final product with rLysn was established and verified. Size exclusion high performance liquid chromatograph（SE-HPLC）was employed to measure the protein content in both physico-chemical control and the final product with rLysn under the conditions as below：a TSK gel 2000SWXL column（7.8 mm×30 cm，5 μm），the mobile phase composed of phosphate buffer（20 mmol/L，pH7.0）and NaCl（0.3 mol/L），the flow rate was 0.5 mL/min，the temperature was 25℃，and the detection wave length was 280 nm. As results，the rLysn（within 2-32 μg）was linearly correlated with the area of the elution peak（r2=1）. The weighted average recovery rate for physico-chemical controls in 3 rLysn concentrations of low，medium and high was 102.9%，while the weighted average recovery rate was 102.1%. Three supernatants were measured at different time，and RSD of protein content ＜ 1%；while measurement was done for each supernatant in 1 h interval，RSD of the protein content was 0.98%；and 6 samples from one targeted solution were measured，RSD of the protein content was 1.71%. Above results reveal that SE-HPLC is simple and convenient，accurate，precise，stable and repeatable approach，thus may be used for the determination of protein content in the final product of rLysn.

recombinant lysostaphin；protein content；size exclusion high performance liquid chromatography

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.008

2015-11-10

國家科技重大專項（2008ZX09101-032），上海市博士后科研資助計劃（14R21421300）

許燕，女，碩士，研究方向：抗感染藥物；E-mail：xuyan131@163.com

陸海榮，男，博士，研究方向：抗感染藥物；E-mail：haironglu09@fudan.edu.cn

黃青山，男，博士，副教授，研究方向：抗感染和抗腫瘤藥物；E-mail：qshuang@fudan.edu.cn