香蕉水通道蛋白SIP2-1基因的克隆和表達(dá)分析

許奕侯曉婉徐碧玉金志強(qiáng)胡偉宋順

（1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站 海南省香蕉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570102；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101；3. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，湛江 524091）

香蕉水通道蛋白SIP2-1基因的克隆和表達(dá)分析

許奕1，2侯曉婉3徐碧玉2金志強(qiáng)1，2胡偉2宋順1

（1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站 海南省香蕉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570102；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101；3. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，湛江 524091）

從香蕉中克隆了一個(gè)水通道蛋白（AQP）基因MaSIP2-1。序列分析表明，該基因存在一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框（ORF）717 bp，編碼 239個(gè)氨基酸。多序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析表明，MaSIP2-1所編碼的蛋白與其他植物中AQP編碼的蛋白具有較高的一致性。其中與馬來(lái)西亞野生香蕉、油棕、麻風(fēng)樹、野茶樹的AQP編碼的氨基酸序列的同源性較高，分別為98%、74%、65%和63%。器官特異性分析表明，MaSIP2-1在香蕉的根、莖、葉片、花和果實(shí)中均有所表達(dá)，其中在莖中表達(dá)量較高。通過(guò)對(duì)其在干旱、高鹽、低溫、澇害脅迫下的表達(dá)結(jié)果分析顯示，該基因響應(yīng)干旱、高鹽、澇害3種脅迫。

水通道蛋白；SIP；香蕉；生物信息學(xué)；脅迫；熒光定量PCR

植物的生長(zhǎng)依賴植物的根系從土壤中吸取水分運(yùn)輸?shù)狡渌鞴僦校?］。然而，干旱、高鹽、寒冷等外界環(huán)境的脅迫會(huì)導(dǎo)致植物水分缺失而影響植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。水分的運(yùn)輸是維持植物使其具有忍耐干旱和高鹽脅迫的一個(gè)重要過(guò)程［2-4］。水通道蛋白（AQP）能夠運(yùn)輸水分以及其他小分子物質(zhì)，如甘油、CO2和硼等［5-7］。AQP在植物中的生物活性是多樣性的，包括種子萌發(fā)、氣孔運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞伸長(zhǎng)及響應(yīng)外界脅迫等［8，9］。在許多植物中都已經(jīng)鑒定出了AQP蛋白，包括擬南芥中的35個(gè)［10］，水稻種的33個(gè)［11］，玉米種的36個(gè)［12］。水通道蛋白根據(jù)序列同源性分成4類，包括液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast in-trinsic protein，TIPs）、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsic protein，PIPs）、NOD26-like內(nèi)在蛋白（NOD26-like intrinsic proteins，NIPs）和小的內(nèi)在蛋白（small and basic intrinsic proteins，SIP）［13］。這4類AQP具有高度保守結(jié)構(gòu)，均有6個(gè)傾斜的右旋性跨膜結(jié)構(gòu)（TM1-TM6），并被5個(gè)環(huán)（Loop）所連接［12］。AQP在植物中涉及許多發(fā)育過(guò)程，如種子萌發(fā)、果實(shí)成熟、細(xì)胞伸長(zhǎng)等［9］。在Liu等［14］研究中，過(guò)表達(dá)OsPIP1；1能夠增加轉(zhuǎn)基因水稻種子產(chǎn)量，提高種子的發(fā)芽率。而GhPIP1；2 和 GhgammaTIP1能使水分快速進(jìn)入液泡，從而促進(jìn)棉花纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)［15］。此外，關(guān)于AQP對(duì)植物抵御外界非生物脅迫的研究近年來(lái)成為研究其功能的一個(gè)熱點(diǎn)，許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，植物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)AQP的活性響應(yīng)各種逆境的脅迫，如旱害、冷害、鹽害、機(jī)械損傷、滲透脅迫及重金屬脅迫等。本研究從香蕉中克隆出一個(gè)MaSIP2-1基因，并對(duì)其在非生物脅迫處理下的表達(dá)模式做了研究，旨在為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年1 月初采集巴西香蕉（Musa acuminata L.AAA group‘Brazilian’）的根、莖、葉、花及果實(shí)，用無(wú)菌水清洗后立即放置于液氮中速凍，于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)所用香蕉均采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州組培中心。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得 從香蕉A基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中得到一個(gè)AQP家族基因MaSIP2-1，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物S1，S2（表1），擴(kuò)增MaSIP2-1全長(zhǎng)序列。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 s；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)。按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定。對(duì)已鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 將基因MaSIP2-1的cDNA序列和開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）編碼的氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLASTx進(jìn)行同源性搜索和比對(duì)，利用Clustal X1.81 和MEGA 3.1 軟件分析MaSIP2-1蛋白與其他植物的SIP2-1蛋白的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

表1 香蕉MaSIP2-1基因的克隆及實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物

1.2.3 MaSIP2-1在香蕉不同器官中的表達(dá)分析 以香蕉五葉一心期的根、莖、葉片及花和果實(shí)采后當(dāng)天的cDNA為模板，采用RT-PCR 方法分析其組織特異性表達(dá)。以香蕉MaActin片段為內(nèi)參，引物為NCBI 上已登錄序列MaActin1和MaActin2，MaSIP2-1引物為P1和P2。PCR 反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 7 s，56℃ 15 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)后作熔解曲線（95-55℃，0.1℃· s-1）。

1.2.4 基因的表達(dá)分析

1.2.4.1 干旱脅迫處理 取20株五葉一心、心葉未展、生長(zhǎng)健壯的香蕉幼苗，分為4組，每組5株。測(cè)定各組中土壤水分含量并調(diào)整為一致。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：第1組：正常生長(zhǎng)（作為對(duì)照），按規(guī)律澆水，土壤相對(duì)含水量保持在75%-80%；第2組：低度失水干旱脅迫，土壤相對(duì)含水量保持在55%-60%；第3組：中度失水干旱脅迫，土壤相對(duì)含水量保持在45%-50%；第4組：高度失水干旱脅迫，土壤相對(duì)含水量保持在30%-35%。將所有香蕉苗均放入恒溫人工氣候箱中培養(yǎng)。設(shè)定環(huán)境溫度為25-30℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，空氣相對(duì)濕度40%。利用烘干土法控制調(diào)節(jié)土壤相對(duì)含水量，每隔3 h進(jìn)行測(cè)定，達(dá)到不同脅迫標(biāo)準(zhǔn)后取出植株葉片置于液氮中迅速冷凍，提取RNA。

1.2.4.2 高鹽脅迫處理 在培養(yǎng)液（1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液）中加入300 mmol/L NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理。白天的平均溫度為33-35℃，夜間的平均溫度為26-28℃，光照充分，于0、2、4和6 h分別觀察和取樣。將材料的葉片置于液氮中冷凍，提取RNA。

1.2.4.3 低溫脅迫處理 選取生長(zhǎng)一致，長(zhǎng)勢(shì)健壯的香蕉幼苗，分為5組，置于人工氣候箱培養(yǎng)進(jìn)行低溫處理。處理方法如下：從25℃開(kāi)始降溫到15℃、10℃、7℃和5℃四個(gè)不同的溫度。第1組：對(duì)照組，將香蕉苗在25℃下連續(xù)培養(yǎng)12 h；第2組將香蕉苗從25℃降至15℃環(huán)境中并培養(yǎng)12 h；第3組：使香蕉苗從25℃降至10℃，并在10℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)12 h；第4組：將培養(yǎng)箱溫度降至7℃，將香蕉苗置于其中生長(zhǎng)12 h；第5組：使香蕉苗從25℃降至在5℃，并在該低溫下處理材料12 h。處理期間光照強(qiáng)度均為2 000 lx，相對(duì)濕度為85%。處理完畢后，取各組材料心葉下第一片完全展開(kāi)葉立即置于液氮中冷凍，提取RNA。

1.2.4.4 水澇脅迫處理 選取長(zhǎng)勢(shì)一致的土栽苗，將根部全部浸入水中進(jìn)行澇害實(shí)驗(yàn)，設(shè)置淹水0、12、24 和36 h 4個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。定期取樣：直徑為1 mm左右白色新嫩根，迅速吸干根表面水分，立即用液氮速凍，提取RNA。

圖1 MaSIP2-1編碼的氨基酸序列與其他植物SIP2-1蛋白氨基酸同源性分析

2 結(jié)果

2.1 MaSIP2-1的克隆及序列分析

以正常生長(zhǎng)的巴西蕉幼苗葉片cDNA為模板，MaSIP2-1 S1和MaSIP2-1 S2為引物，從香蕉栽培品種巴西蕉中克隆到一個(gè)AQP家族基因，其ORF為717 bp，編碼239個(gè)氨基酸。利用DNAman 將MaSIP2-1 cDNA 推導(dǎo)的氨基酸序列與NCBI中已登錄的其它高等植物的SIP氨基酸序列進(jìn)行同源關(guān)系比較，結(jié)果（圖1）顯示，各種植物SIP編碼的氨基酸序列存在較高的同源性，多數(shù)達(dá)63%以上。BLASTX分析表明，MaSIP2-1編碼的氨基酸序列與馬來(lái)西亞野生蕉MaSIP2-1-like（XP_009402451.1）、油棕EgSIP2-1（XP_010909819）、麻風(fēng)樹JcSIP2-1（XP_012079611）、野茶樹CsSIP2-1（AHE93339.1）編碼的氨基酸序列具有較高的一致性，分別為98%、74%、65%和63%。利用Clustal X1.81和MEGA 3.1軟件，將MaSIP2-1 cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列與NCBI中已登錄的其它植物的SIP氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的比對(duì)分析。結(jié)果（圖2）表明，本研究得到的 巴西蕉MaSIP2-1基因所編碼的氨基酸序列與馬來(lái)西亞野生蕉MaSIP2-1-like具有較近的親緣關(guān)系。

圖2 不同植物SIP2-1氨基酸序列的系統(tǒng)樹分析

2.2 MaSIP2-1在香蕉不同器官中的表達(dá)特性

MaSIP2-1在香蕉的根、莖、葉片、花和果實(shí)各器官中均有所表達(dá)，其中在莖中表達(dá)量較高，是葉中表達(dá)量的12.22倍。在葉中的表達(dá)量最低為1，而在根、花和果實(shí)中表達(dá)量分別為3.83和1.3（圖3）。

圖3 MaSIP2-1在香蕉不同器官中的qPCR表達(dá)分析

2.3 MaSIP2-1基因在非生物脅迫處理下的表達(dá)分析

為了研究MaSIP2-1基因是否響應(yīng)外界非生物脅迫，利用qPCR對(duì)MaSIP2-1在干旱、高鹽、低溫、水澇脅迫處理下葉片中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，如圖4所示，在干旱處理下，MaSIP2-1在土壤水分含量為60%是表達(dá)量最高，隨著水分含量降低，其表達(dá)量逐漸受到抑制。用300 mmol/L高鹽對(duì)香蕉幼苗進(jìn)行脅迫處理，于0、2、4 和6 h分別取樣，如圖5所示，MaSIP2-1在高鹽脅迫處理4 h時(shí)被高度誘導(dǎo)表達(dá)，隨后其表達(dá)量又下降，呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，其在4 h的表達(dá)量分別為0、2和6 h的12.72、6.10和1.71倍。

圖4 MaSIP2-1在干旱脅迫下的差異表達(dá)

圖5 MaSIP2-1在高鹽脅迫下的差異表達(dá)

對(duì)其進(jìn)行低溫脅迫處理，如圖6所示，隨著溫度的降低，MaSIP2-1的表達(dá)量均沒(méi)有呈現(xiàn)太大的變化，表達(dá)量均在1以下，其并未受到溫度的誘導(dǎo)表達(dá)。

在澇害脅迫處理下，如圖7所示，將香蕉苗淹水處理24 h后，其表達(dá)量達(dá)到最高值為2.13，而在處理36 h后其表達(dá)量反而達(dá)到最低值，說(shuō)明淹水處理24 h時(shí)能夠高度誘導(dǎo)MaSIP2-1的表達(dá)。

3 討論

許多研究表明，水通道蛋白基因的表達(dá)和生物活性受到包括非生物脅迫，植物激素等許多信號(hào)的影響［6，10，16-19］。其響應(yīng)非生物脅迫的調(diào)控及生物學(xué)功能是十分復(fù)雜的，在許多轉(zhuǎn)基因植株中，已經(jīng)證明了一些水通道蛋白能夠提高對(duì)非生物脅迫的耐受性［7，9，20-22］。例如，在擬南芥中過(guò)表達(dá)MaPIP1；1提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱和高鹽脅迫的響應(yīng)，而且轉(zhuǎn)基因株系的根系增長(zhǎng)，根毛增多［23］。過(guò)表達(dá)TaAQP8使轉(zhuǎn)基因植株根系在高鹽脅迫下根系伸長(zhǎng)［24］。在高鹽脅迫下，煙草NtAQP1能使轉(zhuǎn)基因植株提高水分利用率［7］。在200 mmol/L NaCl的處理下，大麥 HvPIP2能夠調(diào)節(jié)水分的流失，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的水轉(zhuǎn)運(yùn)活性［17］。在植物中過(guò)量表達(dá)一些AQP能夠提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱脅迫的耐受性［7，9，22，24］。例如，過(guò)表達(dá)TaAQP7提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱脅迫的耐受性［24］。在干旱脅迫時(shí)，麻瘋樹根和莖中 JcPIP2被誘導(dǎo)表達(dá)［25］。在擬南芥中轉(zhuǎn)化大麥TaTIP2；2提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱的響應(yīng)，而且這種響應(yīng)是通過(guò)不依賴于ABA的信號(hào)途徑［26］。MusaPIP1；2轉(zhuǎn)香蕉植株中，表現(xiàn)出了較好的抗逆的特性［27］。在Sreedharan 的研究中，將MusaPIP1；2轉(zhuǎn)化香蕉，轉(zhuǎn)基因植株在干旱處理后復(fù)水，其恢復(fù)能力明顯強(qiáng)于野生型。同時(shí)，對(duì)其生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，相對(duì)于對(duì)照其丙二醛含量降低，脯氨酸含量提高，相對(duì)水含量提高，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的抗旱性。

圖6 MaSIP2-1在低溫脅迫下的差異表達(dá)

圖7 MaSIP2-1在水澇脅迫下的差異表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)從香蕉中克隆出香蕉水通道蛋白基因MaSIP2-1，為了進(jìn)一步研究MaSIP2-1能否響應(yīng)外界的非生物脅迫，本實(shí)驗(yàn)用干旱、高鹽、低溫以及水澇脅迫處理香蕉幼苗，結(jié)果表明，在干旱脅迫處理下，土壤水分含量為60%時(shí)MaSIP2-1被高度誘導(dǎo)表達(dá)，當(dāng)土壤水分減少至45%和30%時(shí)，MaSIP2-1表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明該基因響應(yīng)外界干旱脅迫。在高鹽脅迫處理下，當(dāng)處理2 h時(shí)其表達(dá)量升高，在4 h時(shí)達(dá)到峰值，處理6 h后表達(dá)反而下調(diào)，呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MaSIP2-1受到高鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。該結(jié)果與候曉婉等［28］報(bào)道的巴西蕉和粉蕉中MaPIP2-6在甘露醇和高鹽脅迫處理下的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，在處理早期輕微下降，而后被誘導(dǎo)達(dá)到最大值，接著下降。結(jié)果表明，該基因在響應(yīng)滲透脅迫的過(guò)程中，可能在早期出現(xiàn)了一個(gè)‘Shock’，隨后呈現(xiàn)出被誘導(dǎo)的趨勢(shì)。而在低溫處理下，該基因的表達(dá)量變化差異不顯著，其表達(dá)量均在1以下，表明其并未受到低溫誘導(dǎo)表達(dá)。在擬南芥中，低溫脅迫能夠誘導(dǎo)AtPIP2；5和AtPIP2；6表 達(dá)，卻抑制了AtPIP1；5和AtPIP2；3等基因的表達(dá)［29］。因此，AQP家族成員對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)出不同的模式。在水澇脅迫處理時(shí)，與對(duì)照相比，淹水處理12 h時(shí)MaSIP2-1表達(dá)下調(diào)，而處理24 h時(shí)MaSIP2-1被高度誘導(dǎo)表達(dá)，達(dá)到峰值，為對(duì)照的2.2倍，隨著處理時(shí)間的增加當(dāng)達(dá)到36 h時(shí)，其表達(dá)量下調(diào)達(dá)到最低值，說(shuō)明MaSIP2-1能夠被水澇脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

4 結(jié)論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中克隆到的香蕉MaSIP2-1屬于AQP家族中SIP亞類中的一個(gè)，QPCR實(shí)驗(yàn)表明MaSIP2-1能夠參與非生物逆境脅迫應(yīng)答，響應(yīng)非生物脅迫包括干旱、高鹽和水澇脅迫。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Molecular Cloning and Expression Analysis of Aquaporins SIP2-1 Gene from Banana

XU Yi1，2HOU Xiao-wan3XU Bi-yu2JIN Zhi-qiang1，2HU Wei2SONG Shun1
（1. Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement，Haikou Experimental Station，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，
Haikou 570102；2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology（Ministry of Agriculture），Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101；3. South Subtropical Crops Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang 524091）

In the present study，we isolated an aquaporin gene from banana，and designated as MaSIP2-1. MaSIP2-1’s complete ORF was 717 bp，and it encoded 239 amino acids. Alignment of amino acid sequences and phylogenetic analysis indicated that the protein encoded by MaSIP2-1 was in high similarity with AQP-encoding protein in the other known plants；and highly homologous with amino acid sequences in Musa acuminate，Elaeis guineensis，Jatropha curcas，and Camellia sinensis by 98%，74%，65%，and 63%，respectively. Organ-specific analysis showed that MaSIP2-1 constitutively expressed in roots，stems，leaves，flowers and fruits，and the highest in stems. Stress analysis demonstrated that MaSIP2-1 responded to the stress such as the drought，salt and waterlogging.

aquaporins；SIP；banana；bioinformatics；stress；real-time PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.012

2015-10-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31071788，31501371），海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（314099），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS-32），“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA10020605）

許奕，女，碩士，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：lukydog163@163.com

宋順，男，碩士，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：sss1984006@163.com