利用蘋果EST-SSR分析木瓜屬種質遺傳多樣性

張艷艷齊紅郭慶梅孫稚穎周鳳琴李圣波

（1. 山東中醫藥大學，濟南 250355；2. 濟南市食品藥品檢驗檢測中心，濟南 250001；3. 山東亞特生態技術有限公司，臨沂 266071）

利用蘋果EST-SSR分析木瓜屬種質遺傳多樣性

張艷艷1齊紅2郭慶梅1孫稚穎1周鳳琴1李圣波3

（1. 山東中醫藥大學，濟南 250355；2. 濟南市食品藥品檢驗檢測中心，濟南 250001；3. 山東亞特生態技術有限公司，臨沂 266071）

利用蘋果屬的EST-SSR標記對33份木瓜種質資源進行遺傳多樣性研究，以分析引物在木瓜屬中的通用性。篩選出15對引物進行PCR擴增，其中9對引物顯示多態性，共擴增出71條帶，其中多態性條帶59條，多態性條帶比率83.10%，并且可成功區分不同種。PIC多態性信息含量平均值為0.45，Nei’s 基因多樣性（H）、Shannon指數（I）的平均值分別為0.45、0.71。根據 EST-SSR 數據的UPGMA聚類分析將材料分為五大類，木瓜屬的不同基原樣本各聚為一支，能很好地將5個種植物區分，顯示出單系性。研究結果表明，蘋果屬的EST-SSR標記在木瓜屬上具有高度的可轉移性，可應用于木瓜屬植物的資源評價及遺傳關系研究。

EST-SSR；木瓜屬；通用性

EST-SSR又稱表達序列標簽微衛星（EST-based microsatellite），是在SSR標記基礎上發展出來的一種新的標記方法。EST-SSR標記是指在已知的EST序列中，篩選出含有SSR的序列，根據簡單重復序列兩端的保守序列設計引物進行PCR擴增，由于植物上不同物種間微衛星重復單元的堿基組成和拷貝數不同而顯現出多態性［1］。由于EST-SSR側翼序列在物種之間高度保守，EST-SSR標記可在不同物種之間通用［2］。EST-SSR 具有開發過程簡單、成本低、能夠反映出轉錄區的差異等優點，所以成為微衛星標記的引物重要的來源。因此，EST-SSR分子標記的方法可以作為一種既簡便又高效的進行木瓜屬植物親緣關系遠近的判斷和進行品種鑒定的工具。木瓜屬（Chaenomeles）為薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）植物，本屬全世界有5個種，分別為木瓜（C. sinensis）、皺皮木瓜（C. speciosa）、毛葉木瓜（C. cathayensis）、西藏木瓜（C. thibetica）及日本木瓜（C. japonica）。木瓜是一種名貴的藥食兩用藥材，具有舒筋活絡和胃化濕之功效［3］。木瓜屬植物親緣關系復雜，同物異名和同名異物現象十分普遍。因此，開發出一種快速有效的方法對木瓜品種進行鑒定分類十分必要。

《中國藥典》2010年版規定藥用木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果實，味酸、性溫，歸肝、脾經，具舒筋活絡和胃化濕等功效。木瓜在部分省區以光皮木瓜或榠楂入藥；毛葉木瓜分布較廣，產量高，據報道為市場皺皮木瓜的主要來源；西藏木瓜多野生，僅在西藏、云南等部分地區有分布和使用；而日本木瓜曾在部分地區當作木瓜，現未見繼續使用。木瓜種質變異與分化嚴重，形成了很多的農家品種，隨之藥材的產量和質量也發生明顯的差異。目前需要對種質樣品間的遺傳多樣性進行分析，探索木瓜不同種質樣品間遺傳多樣性與形態學特征之間的對應關系。由于目前木瓜屬基因水平研究還處于起步階段，木瓜屬的EST庫尚未建立，從其近緣植物開發引物是進行研究的有效途徑。本研究從蘋果屬中篩選出適合木瓜屬遺傳分析的ESR-SSR引物，進行基因組DNA擴增，從分子水平上分析其遺傳關系，旨在探討蘋果屬ESR-SSR引物用于木瓜屬的可行性，以期簡便高效的對木瓜屬植物進行品種鑒定，判斷親緣關系遠近。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年4 月在山東亞特生物有限公司木瓜種植基地采集33份木瓜屬種質資源，其中西藏木瓜樣品編號XZ01-05、毛葉木瓜MY01-03、皺皮木瓜ZP01-19、日本木瓜RB01-03、光皮GP01-03，采摘各植株的幼嫩葉片，硅膠干燥保存。

1.2 方法

1.2.1 EST-SSR 引物查找 蘋果屬EST序列來源于PlantGDB（http://www.plantgdb.org/）和NCBI（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST），檢索到并且下載了339 058條，查詢截止時間為 2014年11月2日。

采用EST-trimmer（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/ misa/download/est_trimmer.pl）軟件去除5'端或 3'端帶有 polyA 或 polyT尾巴的序列，并截去過短的低質量序列片段。采用CAP3軟件對 EST 序列進行聚類和拼接處理，以獲得無冗余和盡可能長的重疊序列（contig）。通過Perl語言的 MISA程序篩選SSR位點，篩選標準［4］為：序列長度不小于 100 bp且不大于700 bp，單核苷酸重復的次數≥10次，二核苷酸重復的次數≥6次，三到六核苷酸重復的次數≥5次。

1.2.2 EST-SSR引物設計 利用Primer 5.0 軟件對符合條件的EST-SSR序列進行引物設計。參數設置為：產物長度設為 100-350 bp，引物長度為18-22 bp，最佳為20 bp，GC含量40%-60%，引物退火溫度為50-60℃；盡量避免 Dimer 和二聚體出現，從軟件給出96分以上的引物中選取25對合成引物，引物由上海生工合成。

1.2.3 DNA的提取和PCR擴增 實驗材料均為硅膠干燥葉片，取樣約20 mg，液氮充分研磨，利用DNA 提取試劑盒提取DNA。PCR反應體積為 20 μL，體系內含：2×Taq master mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、引物各1 μL（2.5 μmol/L）、DNA 模板1 μL（約30 ng）。PCR擴增程序為 ：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，適宜退火溫度45 s，72℃延伸1 min，35次循環；72℃延伸 7 min，4℃保存。

1.2.4 PCR產物的檢測 擴增產物在1% 瓊脂糖凝膠電泳上檢測，條帶清晰并與預期片段大小相近的SSR產物表明擴增成功。具有清晰條帶的擴增產物通過6%聚丙烯酰胺凝膠分離，在120 V恒壓下電泳，電泳時間為 2 h，銀染后觀察并照相。

1.2.5 數據分析 用數字1和0分別表示電泳條帶的有或無，在 Excel 中建立1和0矩陣。利用NTSYS-pcversion2.11軟件進行數據處理，品種間的相似系數按 Jaccard 公式計算，以非加權類平均法（unweighted pair-group method with arithmetic averages，UPGMA）進行聚類分析和構建系統樹。利用Popgene32軟件進行數據分析，計算多態性條帶所占的比率（PPB%），觀測等位基因數（Number of putative alleles，na）、有效等位基因數（Number of effectivealleles，ne）、Nei’s遺傳多樣性指數（H）和Shannon.s指數（I），SSR 位點的多態性信息量（PIC）按Smith等［5］的公式計算，即PIC=1-∑fi2，其中fi 為 i 位點的基因頻率。以評價蘋果屬植物 EST-SSR引物在木瓜屬 SSR標記的可行性。

2 結果

2.1 EST-SSR引物的信息分析

對來自蘋果屬EST庫的339 058條單一基因序列經拼接后，得到無冗余contigs 25 727條，采用MISA 腳本共搜索到含SSR 位點的EST序列3 228條，共搜索到SSR位點3 885個。在所有可用的EST-SSR 序列中，以二核苷酸為重復單元的序列最多，為2 534條，占 65.23%，二核苷酸重復類型中以AG/CT最為豐富，其次為AT/AT。

2.2 EST-SSR引物篩選結果

利用Primer 5.0 軟件設計EST-SSR引物，結合自動與人工篩選，共得到25對備選引物。利用不同引物對隨機選取的部分品種基因組DNA 樣品初步擴增篩選，篩選出條帶清晰的9對引物（表1），有效擴增率為30%。利用引物M7對不同品種擴增，結果（圖1）表明利用蘋果屬EST序列應用于木瓜屬SSR標記是可行的，并能有效用于木瓜種質鑒定。

表1 EST-SSR引物信息

2.3 EST-SSR標記的多態性分析

用篩選的 9 對引物對33種木瓜屬植物進行多態性分析，共得到71 條清晰可辨的條帶，其中多態性條帶59條，多態性條帶比率83.10%（表2）。觀測平均等位基因數為2.55，有效等位基因數為1.91，Nei’s遺傳多樣性為0.45，Shannon信息指數為0.71。PIC值是衡量等位信息含量的理想指標，9對引物擴增后計算結果0.25＜PIC＜0.5，說明SSR位點均為中度多態性位點。

2.4 聚類分析

UPGMA聚類樹狀圖（圖2）顯示，SSR標記能將33份木瓜屬不同種質完全區分開，其相似性系數的變化在0.53-0.99之間，種質間的遺傳差異性較大。以0.795相似系數為閾值，能將33份種質資源聚為三大類，第一類包括光皮木瓜，第二類包括全部19份皺皮木瓜種質，第三類又分為3個亞類：第一亞類包括5份西藏木瓜種質，第二亞類包括3份毛葉木瓜，第三亞類包括3份日本木瓜。該聚類結果與傳統形態分類學結果大致相同，說明分子標記的多態性與形態表現的多樣性基本一致，而分子標記能反映遺傳上的差異，對物種鑒定的準確度更高。

圖1 引物M7在33份樣品中的擴增結果

表2 引物擴增結果

3 討論

由于EST-SSR多態位點多，信息含量高，可反映豐富的遺傳變異信息，常被用于藥材及品種的鑒定。大量研究表明，EST-SSR引物的跨種擴增可應用于多種植物的遺傳多樣性研究。楊維澤等［6］利用百合等3種植物的EST-SSR標記對云南重樓（多葉重樓的變種）進行擴增，成功擴增出預期條帶，結果表明在滇重樓中具有較高的通用性。陳永霞等［7］選取小麥、玉米等禾谷作物的EST-SSR引物研究扁穗牛鞭草的遺傳變異和親緣關系，結果表現出豐富的遺傳多樣性。目前，在薔薇科的屬種間證實了ESR-SSR引物的通用性。例如，秦玥等［8］從薔薇科EST庫中開發了10對華仁杏SSR引物，為華仁杏資源的品種鑒定及分子標記輔助育種研究奠定基礎。Vendramin等［9］從桃EST庫中設計合成了21對EST-SSR引物，在李屬的6個種植物中擴增，擴增成功率高達78.1%。而通過蘋果屬SSR引物探究EST-SSR標記在其他屬種間的通用性研究更為廣泛，主要用于山楂［10］、梨［11］等，已有14個SSR引物被定位到了梨的公共圖譜［1］。

由于目前木瓜屬基因組研究工作落后，難以在較短的時間開發大量的EST-SSR標記，而木瓜和蘋果同屬于薔薇科蘋果亞科，具有較高的同源性。本研究采用蘋果屬植物上開發的EST-SSR標記，在木瓜屬植物上獲得較高的可轉移性，說明這些從蘋果基因組開發的EST-SSR的序列在木瓜屬上保守性較高，并且可以揭示一定的多態性水平。

由EST-SSR標記的引物篩選結果可以看出，25對EST-SSR備選引物中，9對擴增出清晰條帶，有效擴增率為36.00%。33份木瓜的相似系數在0.53-0.99之間，種質資源間有較大的遺傳變異，遺傳多樣性較高。由聚類結果可知，木瓜屬親緣關系較近的種聚在一起，其4個種的親緣關系較近，僅有光皮木瓜表現出顯著的單系性，并未與其余4種聚為一支，說明親緣關系較遠。這與其他分子標記，如AFLP標記［12］、SRAP標記［13］、RAPD標記［14］和ISSR標記［15］，對木瓜屬遺傳親緣關系的研究結果一致。聚類圖（圖2）顯示西藏木瓜與毛葉木瓜聚為一支，親緣關系密切，本研究支持王明明等［15］對木瓜屬品種親緣關系的SRAP分析的研究結果。俞德俊等［16］也認為西藏木瓜與毛葉木瓜親緣關系十分緊密。

圖2 基于 EST-SSR 分析33個種質的遺傳相似性聚類圖

結合形態學特征分析皺皮木瓜19個樣品的聚類結果，發現單獨聚為一類都具有比較典型的區別于其他單株的形態學特征，尤其是花色、花型。其中單獨分支的ZP06、ZP07、ZP19在形態學特征也與其他差異明顯，表現為葉長圓狀披針形，下表面有褐柔毛，大果型，種子呈扁三角形。其他多為中小果型，種子多呈長三角形，聚類結果與形態方面也有對應一致的差異結果，如ZP04、ZP05花大紅色，ZP09、ZP11花色為淺粉色，ZP12、ZP13為粉白色，ZP08、ZP14、ZP15、ZP16的氣香濃郁。張亞利［17］的研究也證實分子標記聚類結果和形態學聚類結果有一定的一致性。

基于EST數據庫開發的蘋果EST-SSR引物是可行的，并能用于木瓜屬種質的鑒定，同時在指紋圖譜構建、種質資源分析、遺傳作圖等研究方面有廣闊的應用前景。因此，從近緣物種 EST-SSR 上開發更多的木瓜屬SSR引物是有效途徑。

4 結論

利用蘋果 EST 數據庫開發了 9對多態性豐富的 EST-SSR 引物，并用其對 33份木瓜屬品種資源的親緣關系進行研究，共擴增出結合位點 71個，總的多態性比率為 83.10%，供試材料相似系數的變化在0.53-0.99，在相似性系數 0.795 處可將33份材料分為 3 組。本研究結果表明篩選的9對蘋果屬ESTSSR可用于木瓜屬種質的鑒定。

致謝：山東省農業科學研究院生物信息中心王興軍教授的課題組提供本研究分子實驗平臺，特此感謝。

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（責任編輯 李楠）

Analysis of Genetic Diversity in Chaenomeles Using Apple EST-SSRs

ZHANG Yan-yan1QI Hong2GUO Qing-mei1SUN Zhi-ying1ZHOU Feng-qin1LI Sheng-bo3
（1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji’nan 250355；2. Jinan Food and Drug Control/Testing Center，Ji’nan 250001；3. Shandong Yate Eco-tech Co.，Ltd.，Linyi 266071）

EST-SSR markers of Malus pumila Mill. were selected to investigate the genetic diversity of germplasm resources in 33 cultivars of Chaenomeles，and hence to confirm the transferability of SSRs information from Malus to Chaenomeles. In this study，15 selected primers were employed for PCR amplification and 9 primers presented polymorphic bands；71 bands were generated by all EST-SSR，of which 59（83.10%）were polymorphic；the different cultivars listed here were successfully distinguished. The average of polymorphic information content（PIC）were 0.45. The average of Shannon index（I） and Nei’s genetic diversity index（H）were 0.71 and 0.45. UPGMA cluster based on the EST-SSR data，the materials were divided into 5 groups. Different samples of Chaenomeles were gathered together and could be distinguished by system tree. The results showed that EST-SSR markers developed from M. pumila showed high transferability to Chaenomeles，and they may be used in germplasm evaluation and genetic relationship for Chaenomeles.

EST-SSR；Chaenomeles；transferability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.014

2015-10-27

國家科技支撐計劃（2011BAI06B06），山東省科技發展計劃項目（2011GSF11904）

張艷艷，女，碩士研究生，研究方向：中藥質量控制與資源；E-mail：yan13579.com@qq.com

郭慶梅，女，教授，博士生導師，研究方向：中藥質量控制與資源；E-mail：qmguo@sina.com