拮抗多種植物病原真菌Streptomyces triostinicus C2的分離與鑒定

彭衛福吳志明陳未曾勇軍李昆太

（1. 江西農業大學作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室 江西省作物生理生態與遺傳育種重點實驗室，南昌 330045；2. 江西農業大學生物科學與工程學院 江西省農業微生物資源開發與利用工程實驗室，南昌 330045）

拮抗多種植物病原真菌Streptomyces triostinicus C2的分離與鑒定

彭衛福1吳志明2陳未2曾勇軍1李昆太2

（1. 江西農業大學作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室 江西省作物生理生態與遺傳育種重點實驗室，南昌 330045；2. 江西農業大學生物科學與工程學院 江西省農業微生物資源開發與利用工程實驗室，南昌 330045）

旨在分離篩選獲得對植物病原真菌具有抑制作用的拮抗菌。以水稻紋枯病菌為指示菌，采用平板對峙培養法進行拮抗菌的分離篩選；根據菌體形態學觀察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，對拮抗菌進行菌種鑒定。結果顯示，從采集自云南、廣東、安徽、湖北、江西等地的18個土樣中分離篩選到一株對水稻紋枯病菌具有良好抑制效果的菌株C2，該菌株初步鑒定為Streptomyces triostinicus，并暫命名為鏈霉菌 C2；進一步測定鏈霉菌C2的抗菌譜發現，它對水稻紋枯病菌、水稻稻瘟病菌、葡萄炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和橘青霉等多種植物病原真菌均具有良好的抑制作用，其抑菌率分別為49.78%、56.62%、80.96%、18.59%和94.10%。鏈霉菌C2是一株植物病原真菌廣譜拮抗菌。

分離與鑒定；放線菌菌株C2；植物病原真菌；廣譜拮抗

植物病害一直是影響作物產量、質量和食品安全的重要因素。據統計，全球每年因植物病害而造成的農業產量下降比例就高達10%-16%［1］。植物病害的主要病原包括細菌、病毒、真菌、線蟲等，其中70%-80%的植物病害是由病原真菌侵染所致［2］。植物病原真菌常借助侵染墊、附著胞和吸器等侵染結構來完成寄主的侵染，并在寄主組織中大量生長，從而誘發植物真菌病害的發生［3，4］。例如，由稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）而引發的水稻稻瘟病和紋枯病，已成為全球性的水稻主要病害［5，6］；尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種世界性的土傳病原真菌，可引起瓜類、豆科、茄類、棉等100多種植物枯萎病的發生［7-9］；此外，由炭疽病菌（Colletotrichum）引發的植物炭疽病，也是造成蔬菜、果實和花木植物重大損失的一類常見真菌病害［10］。

目前，植物病害的防治主要依賴于化學農藥的施用，但是長期大量使用化學藥物不僅會造成農藥殘留，危害人畜健康，污染環境，而且在殺害病原菌的同時也殺傷了其他根際促生菌，破壞了生態平衡［11］。農業微生物資源是維系可持續發展農業生態環境的基礎資源。利用農業微生物或其代謝產物進行植物病害的防治，具有安全、環保、無殘留等優點，而且不易使病原菌產生耐藥性，同時還能提高作物品質、增強植物抗性、改善土壤環境等多重作用，這都是化學農藥無法匹敵的［12］。因此，微生物生防顯示出越來越廣闊的應用前景。

本研究以水稻紋枯病菌為指示菌，開展植物病原真菌拮抗菌的分離篩選、鑒定及其拮抗活性評價等研究，以期為其在植物病害的生物防治應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 拮抗菌株C2：由本實驗室從采集江西省南昌市的某黃瓜菜地中分離篩選獲得。供試植物病原真菌：水稻紋枯病菌（R. solani）、稻瘟病菌（M. grisea），西瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. niveum）、葡萄炭疽病菌（C. gloeosporioides）和橘青霉（P. citrinum），均由本實驗室保藏。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）、酵母浸出物麥芽膏培養基（ISP M2）、燕麥培養基（ISP M3）、無機鹽淀粉培養基（ISP M4）、甘油 天門冬酰胺培養基（ISP M5）、高氏一號培養基、察氏培養基、葡萄糖酪氨酸培養基（ISP M7）、普戈式二號培養基、柴斯鈉培養基、纖維素分解培養基、明膠液化培養基、淀粉水解培養基、牛奶液化培養基和硝酸鹽還原培養基［13，14］。

1.1.3 主要試劑和儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒，Taq DNA聚合酶；DNA marker，PCR通用引物。2720 Thermal cycler PCR儀，3730-XL測序儀，Tanon 2500凝膠成像系統，雙光速紫外分光光度計，光學顯微鏡，掃描電鏡，超凈工作臺，恒溫培養箱等。

1.2 方法

1.2.1 拮抗放線菌菌株的分離篩選 放線菌菌株的分離純化：為了獲得豐富的放線菌資源，從云南、廣東、安徽、湖北、江西等地共采集了18個不同類型的土樣。分別稱取10 g土樣加入到裝有90 mL無菌水的三角瓶中制成10-1的土壤懸浮液，以無菌水梯度稀釋至10-3、10-4、10-5；吸取0.2 mL各梯度稀釋液，分別涂布在加有50 mg/L放線菌酮和50 mg/L重鉻酸鉀的高氏一號培養基平板上，30℃培養7 d；挑取呈放線菌菌落特征的單菌落，轉接高氏一號培養基進一步分離純化和保存。

采用平板對峙培養法進行拮抗菌的篩選［15］：用無菌牙簽挑取先期分離純化的放線菌菌落放置在PDA平板中央，30℃下培養5 d后取出；在距拮抗放線菌四周2 cm處接種直徑為8 mm的水稻紋枯病菌菌塊，以不接種放線菌菌落的平板為對照；待對照組的水稻紋枯病菌菌絲長滿平板時，測定實驗組的抑菌帶寬度（R2）和放線菌菌落直徑（R1），并根據R2/R1的比值大小，篩選出抑菌活性強的放線菌菌株。

1.2.2 拮抗菌株的鑒定 菌絲形態學觀察：采用平皿插片法，將拮抗菌株接種于高氏一號固體培養基上，28℃培養7-14 d，取插片在光學顯微鏡下觀察基內菌絲和氣生菌絲的形態，用掃描電鏡觀察孢子絲和孢子的形態。

培養特征和生理生化特征：參照《鏈霉菌鑒定手冊》［14］和《放線菌的分類和鑒定》［16］中的方法，進行拮抗菌的碳源利用、明膠液化、淀粉水解、牛奶凝固與胨化、硝酸鹽還原、產H2S等實驗。

分子生物學鑒定：使用AxyPrep細菌基因組DNA小量制備試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA，采用通用引物27F（5'-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG -3'） 和1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）PCR擴增拮抗菌株的16S rDNA。PCR反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min 30 s，45個循環；最后72℃延伸7 min。待PCR反應完成后，取3 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段。將測序得到的16S rDNA序列在NCBI網站進行BLAST比對，用MEGA 4.1軟件以Neighbor-Joining法構建系統發育樹，確定拮抗菌株的親緣關系和分類地位。

1.2.3 拮抗菌株的抑菌譜測定 采用菌絲生長速率法測定拮抗菌株對不同植物病原真菌的抑制效果［5］：挖取2 cm×1 cm大小的拮抗菌株菌塊接種至裝量為40 mL/250 mL三角瓶的液體發酵培養基（蔗糖30 g/L，玉米淀粉 20 g/L，玉米漿 20 g/L，黃豆餅粉10 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KH2PO40.25 g/L，MnCl20.05 g/L，MgSO41 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH7.2-7.4）中，180 r/min、28℃下搖床培養96 h，發酵液無菌過濾；將無菌發酵上清液與冷卻至50℃左右的PDA培養基按1∶25的體積比充分混合，制備含藥平板；用打孔器（Φ=8 mm）將供試植物病原真菌菌塊接種至平板中心，28℃恒溫培養3-7 d，每處理做3次重復；以不加無菌發酵液的PDA平板為對照，用十字交叉法測定供試植物病原真菌的菌落直徑，按如下公式計算菌絲生長抑制率：

2 結果

2.1 水稻紋枯病菌拮抗菌C2的分離篩選

以水稻紋枯病菌為指示菌，采用平板對峙法從采自云南、廣東、安徽、湖北、江西等地的18個土樣中分離篩選到12株對水稻紋枯病菌具有較強拮抗作用的菌株。其中，菌株C2對水稻紋枯病菌的抑制能力最強，其抑菌帶寬度和R2/R1值分別達到（29.18±0.48）mm和4.57（圖1）。

圖1 對峙培養下菌株C2對水稻紋枯病菌的抑菌效果

菌株C2在高氏一號培養基上的菌落特征（圖2）顯示，菌株C2的單菌落較為飽滿，呈白色，表面具有豐富的孢子，具有明顯的放線菌菌落特征。為了進一步鑒定該菌株的種屬情況，對其開展了菌體形態學觀察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析。

圖2 菌株C2在高氏一號培養基的菌落形態

2.2 菌株C2的鑒定

2.2.1 菌株C2的菌絲形態特征 菌株C2在PDA培養基上培養7 d后，在光學顯微鏡和掃描電鏡下觀察到的菌絲體形態如圖3所示。

菌株C2在PDA培養基上生長發育良好，基內菌絲和氣生菌絲發達豐富，氣生菌絲發育成熟后分化成孢子（圖3-A箭頭所指）；在掃描電鏡下，菌株C2的孢子絲呈螺旋彎曲的鏈狀，單孢子呈圓柱狀，表面光滑（圖3-B箭頭所指）。根據光學顯微鏡和掃描電鏡下的菌絲形態特征，可以初步鑒定菌株C2為鏈霉菌屬。

圖3 菌株C2菌絲形態特征

2.2.2 菌株C2的培養特征和生理生化特征 菌株C2在9種培養基上的培養特征（表1）顯示，菌株C2在大多數培養基上生長良好，在PDA和ISP M2培養基上產黃色可溶性色素，在馬鈴薯培養基上產黑色可溶性色素；菌株C2的菌落多為白色，在高氏一號和ISP M2培養基上可產豐富的孢子；氣生菌絲呈白色或灰色，基內菌絲主要為淺黃色和污白色。

表1 菌株C2的培養特征

菌株C2的碳源利用情況和生理生化特征（表2）顯示，菌株C2可以利用D-甘露醇、蔗糖、山梨醇、肌醇、D-葡萄糖、麥芽糖、淀粉，不能利用D-木糖、D-果糖、棉籽糖和阿拉伯糖；菌株C2不能水解淀粉和分解纖維素，能使明膠液化以及牛奶凝固與胨化，不能產硫化氫和還原硝酸鹽。

表2 菌株C2的生理生化特征

2.2.3 菌株C2的分子生物學鑒定 菌株C2的基因組DNA經PCR擴增后得到一條約為1.5 kb的特征帶，經測序其16S rDNA的序列長度為1 393 bp。將該序列與NCBI數據庫中相應的16S rDNA序列進行Blast比對，采用Neighbor-Joining方法構建菌株C2的系統發育樹，結果（圖4）顯示菌株C2與Streptomyces triostinicus的系列同源性達到99%。

根據菌絲形態觀察、生理生化特征并結合16S rDNA序列分析，菌株C2初步鑒定為Streptomyces triostinicus，將其命名為Streptomyces triostinicus C2。

2.3 鏈霉菌C2對植物病原真菌的抑菌譜測定

采用生長速率法測定了鏈霉菌C2發酵液對5種供試植物病原真菌的抑菌效果，結果（表3）顯示，鏈霉菌C2對供試的5種植物病原真菌（水稻紋枯病菌、水稻稻瘟病菌、葡萄炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和橘青霉）均有不同程度的抑制作用，其抑菌率分別為49.78%、56.62%、180.96%、8.59%和94.10%。 由此可見，鏈霉菌C2對植物病原真菌具有廣譜拮抗的特點，這為其應用于不同植物病害的生物防治提供了參考。

圖4 基于16S rDNA序列構建的C2菌株系統發育樹

表3 菌株C2發酵液對植物病原真菌的抑制率

3 討論

用于生物防治的微生物種類繁多，主要有細菌、真菌、放線菌等［17］。例如，作為植物根際促生菌中最大的細菌種群，假單胞桿菌（Pseudomonas spp.），尤其是熒光假單胞菌（P. fluorscens），能有效地定殖在植物根際，控制植物病害、促進植物生長，是植物病害生防研究中的一個重要類群［18］。放線菌具有復雜的次級代謝系統，能產生諸多結構新穎、生物活性顯著的次級代謝產物，在植物病害防治中具有舉足輕重的作用。據統計，目前大約有60%的農用抗生素是由鏈霉菌（Streptomyces spp.）產生的［19］。其中，由灰色產色鏈霉菌（S. griseochromogenes）產生的滅瘟素（Blasticidin S）、春日鏈霉菌（S. kasugaensis）產生的春日霉素（Kasugamycin）、可可鏈霉菌阿索變種（S. cacaoi var. asoensis）產生的多氧霉素（Polyoxins）、吸水鏈霉菌檸檬色變種（S. hygroscopicus var. limoneus） 產生的井岡霉素（Validamycin A）等，更是成功地商業化運用于水稻、蔬菜和果類等的真菌病害防治之中［20］。

本研究篩選到一株廣譜拮抗鏈霉菌C2，初步鑒定為Streptomyces triostinicus。同樣，曹琦琦等［21］在開展植物病原真菌拮抗菌的分離篩選過程中，也獲得一株對水稻紋枯病菌具有高效拮抗作用的Streptomyces triostinicus。然而目前的研究表明，Streptomyces triostinicus系喹喔啉類（Quinoxaline）抗腫瘤抗生素的主要產生菌［22］，如三骨菌素A（Triostin A）和棘霉素（Echinomycin）［23，24］。也有研究發現，Streptomyces triostinicus可以產具有抗腫瘤活性的放線菌素V（Actinomycin V）［25］。

值得注意的是，本研究是以生防為目的分離篩選到一株植物病菌真菌拮抗菌Streptomyces triostinicus，但該菌株是否也會產三骨菌素A、棘霉素和放線菌素V等抗腫瘤抗生素，有待進一步對其活性組分進行結構鑒定。另外，盡管菌株C2所具備的廣譜性拮抗植物病原真菌特點為其在不同類型植物病害上的生防應用奠定了基礎，但是其抑菌機理以及在田間的防病效果，也有待進一步研究。

4 結論

本研究以水稻紋枯病菌為指示菌，從多地土壤中篩選到一株對水稻紋枯病菌、水稻稻瘟病菌、葡萄炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和橘青霉等多種植物病原真菌均具有抑制效果的鏈霉菌，該菌株經鑒定并命名為Streptomyces triostinic us C2。

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（責任編輯 狄艷紅）

Isolation and Identification of Streptomyces triostinicus C2 Antagonizing on a Variety of Plant Pathogenic Fungi

PENG Wei-fu1WU Zhi-ming2CHEN Wei2ZENG Yong-jun1LI Kun-tai2
（1. Key Laboratory of Crop Physiology，Ecology and Genetic Breeding of Ministry of Education，Key Laboratory of Crop Physiology，Ecology and Genetic Breeding of Jiangxi Province，Jiangxi Agriculture University，Nanchang 330045；2. Engineering Laboratory for the Development
and Utilization of Agricultural Microbial Resources，College of Biological Sciences and Technology，Jiangxi Agriculture University，Nanchang 330045）

The research purposes of this work are to isolate and screen a strain against phytopathogenic fungi. The antagonistic strain was isolated and screened using plate confrontation culture with Rhizoctonia solani as indicator，and was further identified on the basis of morphological characteristics，physiological and biochemical characterization，and 16S rDNA sequence analysis. From 18 soil samples collected from Yunnan，Guangdong，Anhui，Hubei，and Jiangxi Provinces of China，the isolated actinomycete strain C2 presented a strong inhibitory effect on R. solani，and it was preliminarily identified as Streptomyces triostinicus，designated as Streptomyces strain C2 here. The bioassay results showed that Streptomyces strain C2 possessed a broad-spectrum inhibitory effect on a range of plant fungi such as R. solani，Pyricularia grisea，Colletotrichum gloeosporioides，Fusarium oxysporum f. sp. niveum，and Penicillium citrinum，and the inhibition percentage was 49.78%，56.62%，80.96%，18.59%，and 94.10%，respectively. Conclusively，Streptomyces strain C2 was an antagonistic strain with broad-spectrum in suppressing the growth of various plant fungal pathogens.

isolation and identification；actinomycete strain C2；phytopathogenic fungi；broad-spectrum antagonist

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.016

2015-10-30

國家科技支撐計劃項目（2011BAD16B0402，2013BAD07B12），江西省青年科學家培養對象計劃項目（20142BCB23025），國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201410410008）

彭衛福，男，博士研究生，研究方向：農業微生物；E-mail：pengwei_fu@126.com

李昆太，男，博士，副教授，研究方向：微生物代謝調控；E-mail：atai78@sina.com