點青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶學性質研究

高慶華胡美榮吳芳彤陶勇王云鵬羅同陽胡常英

（1. 河北省微生物研究所，保定 071051；2. 中國科學院微生物研究所，北京 100101）

點青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶學性質研究

高慶華1胡美榮2吳芳彤1陶勇2王云鵬1羅同陽1胡常英1

（1. 河北省微生物研究所，保定 071051；2. 中國科學院微生物研究所，北京 100101）

旨在克隆點青霉菌（Penicillium notatum）中的葡萄糖氧化酶基因（GOD），在畢赤酵母（Phchia pastoris）中異源表達，純化并研究其酶學性質。利用PCR技術從點青霉 No.8312菌株的基因組 DNA中克隆得到 GOD基因，將該基因克隆到穿梭載體pMD-AOX上并在畢赤酵母X33中表達，對純化后的葡萄糖氧化酶的酶學性質進行分析。結果顯示，X33-GOD可高表達具有活性的GOD，在30℃、pH6.5的條件下，其培養液上清GOD酶活可達496 U/mL，比活123.0 U/mg；重組表達的葡萄糖氧化酶最適溫度為40-45℃，最適pH為6.0，酶的穩定性研究表明，該酶在pH3.5-7.0區間和溫度低于50℃下穩定。1 mmol/L Zn2+對其有激活作用；Ag+對該酶活性有較大抑制作用。構建出GOD的高產畢赤酵母工程菌株，與點青霉GOD相比，具有更高的發酵酶活和比活。

葡萄糖氧化酶；點青霉菌；重組表達

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，EC 1.1.3.4，簡稱GOD）是氧化-還原酶類的典型代表，能夠在氧氣存在時專一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。因其氧化反應生成過氧化氫，在實際應用中葡萄糖氧化酶被用作抗菌劑。另外，葡萄糖氧化酶作為生物催化劑常用于臨床診斷、食品和飲料保鮮［1］；葡萄糖氧化酶作為酶電極還可用于生物傳感器領域［2］。

葡萄糖氧化酶廣泛分布于動植物及微生物體內。研究及生產葡萄糖氧化酶的主要菌株為黑曲霉（Abperrillus niger）和點青霉（Penicillium notatum），這是因為霉菌產酶能力強，易于規模化生成；但黑曲霉和青霉菌發酵生產GOD過程中，過氧化氫酶、纖維素酶及淀粉酶等大量雜酶的存在給純化帶來相當大的困難［3］。

重組葡萄糖氧化酶基因進行異源表達可有效地解決這些問題［4，5］。尤其是畢赤酵母表達外源蛋白具有表達量高、穩定性好、培養成本低和產物易分離純化等優點，適于大體積高密度連續發酵，具有強且易控的醇氧化酶（Alcohol oxidase，AOX）啟動子等優點［6］，可嚴格控制外源基因的表達［7］。

近年來，河北省微生物研究所對保存的青霉屬的點青霉No.8312菌株，采用紫外線誘變方法處理，篩選到了產酶較高菌株，本研究從點青霉菌中克隆得到葡萄糖氧化酶基因，并將其構建在 pMD-AOX載體上，轉化畢赤酵母X33，進行點青霉菌的GOD基因實現異源高效表達。同時，對重組表達的葡萄糖氧化酶進行純化，并對其性質進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 點青霉Penicillium notatum菌株和Escherichia coli DH5α菌株由河北省微生物研究所保存。畢赤酵母Pichia pastoris X33由中科院微生物所饋贈。畢赤酵母表達載體 pMD-AOX（含AOX強啟動子和終止子，G418抗性基因）為中科院微生物所構建。

1.1.2 主要試劑 限制內切酶Not I、Pme I和EcoR I以及Q5 DNA聚合酶為NEB公司產品；鄰聯茴香胺、辣根過氧化物酶、牛血清白蛋白等購自Sigma公司；蛋白質濃度測定試劑盒為上海生工公司產品；DNA Marker和蛋白Marker 購于Fermentas 公司；其他均為國產分析純試劑。真菌基因組提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；質粒提取試劑盒、普通DNA 回收試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。PCR 擴增引物由上海生工合成。

1.1.3 培養基 察氏培養基、含有Amp抗性的 LB培養基、含有G418 的YPD培養基分別用以培養點青霉、大腸桿菌和酵母菌，BMGY培養基（酵母提取物1%、蛋白胨2%、pH6.0磷酸鉀緩沖液100 mmol/L、YNB 1.34%、生物素4×10-5%、甘油1%）為畢赤酵母甲醇誘導表達前培養基。YPCS發酵培養基（g/L）（酵母提取物10，蛋白胨20，酪蛋白水解物5，山梨醇5）為畢赤酵母誘導表達培養基。誘導培養時，每24 h加入1%的甲醇。

1.2 方法

1.2.1 點青霉基因組的提取 按照真菌基因組提取試劑盒方法提取P. notatum的基因組DNA。

1.2.2 葡萄糖氧化酶基因的擴增 擴增來自于P. notatum的葡萄糖氧化酶引物的設計參照NCBI上報導的葡萄糖氧化酶序列（GenBank 登錄號：XM_002563405.1和JN809249.1），其5'端引物序列P1為：5'-ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA-3'，其3'端引物序列P2為：5'-CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA-3'，用這對引物以P. notatum基因組為模板進行PCR擴增。反應體系為50 μL：基因組DNA 100 ng，引物各0.2 μmol/L，dNTPs 250 μmol/L，5×Q5 High-Fidelity DNA Polymerase Buffer 10 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL。PCR反應條件：98℃ 5 min；98℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 60 s，共30個循環；72℃ 10 min。PCR產物經DNA回收試劑盒回收。將經鑒定無誤的連有點青霉葡萄糖氧化酶基因的重組質粒進行測序。

1.2.3 葡萄糖氧化酶基因重組表達載體的構建 為了將葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母中表達，首先去掉其自身的信號肽編碼序列，通過PCR方法設計引物將點青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信號肽編碼序列去除。引物序列如下：GodF：5'-GGCTGAAG CTTACGTAGAATTCTATAGCCCGGCCGAGCAGATCG AC-3'；GodR：5'-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCG GCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC-3'（下劃線分別為上下游引物中限制性內切酶EcoR I和Not I識別位點）。PCR產物經純化回收采用GIBSON連接到表達載體 pMD-AOX的EcoR I和Not I位點上，轉化到 E. coli DH5α。酶切驗證篩選陽性克隆，并送測序。

1.2.4 畢赤酵母的轉化及誘導培養 采用電轉化法［8］，重組質粒 pMD-AOX-GOD經Pme I酶切后線性化。用 2 μg線性化 pMD-AOX-GOD質粒電擊轉化80 μL畢赤酵母X33感受態細胞，然后將轉化細胞涂于含 100 μg/mL G418的YPD平板上，30℃培養96 h。隨機挑選陽性菌落轉接液體YPCS（含100 μg/mL G418，下同），置于 30℃、200 r/min條件下振蕩培養3 d，期間每隔24 h加1%的甲醇。

1.2.5 10 L發酵罐發酵 選取搖床水平上葡萄糖氧化酶活性最高的轉化子研究其發酵罐條件下葡萄糖氧化酶的表達。挑單克隆接種于YPD培養基培養10 h，按3%接種量轉接于100 mL BMGY 培養基至OD600≈6接種于發酵罐，裝液量為2 L BSM培養基，滅菌后，以10%發酵體積接種。參照酵母表達手冊，以濃氨水控制pH5，培養溫度控制在30℃。培養階段甘油耗盡時（溶氧值DO開始明顯上升），開始流加50%甘油，至OD600≈180，停止流加甘油，4 h后往培養基中甘油耗盡，開始流加甲醇誘導，期間每隔24 h加維生素C水溶液（終濃度80 μg/L），12 h測定發酵液酶活。發酵結束以6 000×g、4℃離心20 min收集發酵液上清，將所有收集到的上清液用超濾濃縮純化，提高分泌蛋白的濃度和純度，用BCA 法測蛋白濃度。用上清液進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍R-250染色，脫色液（甲醇250 mL∶冰醋酸50 mL∶水200 mL）脫色，觀察GOD蛋白的表達。

1.2.6 葡萄糖氧化酶的酶活和比活測定

1.2.6.1 GOD活性測定 一般采用鄰聯茴香胺分光光度法。在3 mL的反應體系中，包含0.5 mol/L醋酸緩沖液（pH5.1），0.17 mmol/L鄰聯茴香胺溶液和1.72%葡萄糖溶液及0.1 mg/mL辣根過氧化物酶，35℃震蕩混勻，加入0.1 mL葡萄糖氧化酶溶液，用分光光度計，于A=500 nm自動記錄隨時間變化的吸光度值，根據公式，計算葡萄糖氧化酶活力單位。

式中，X：樣品酶活（U/ mL）；ΔA500：活度值；3.1：反應體積；df為稀釋倍數；7.5：葡萄糖內酯A500消光系數；0.1：加入酶液體積。

1.2.6.2 葡萄糖氧化酶比活性的測定 蛋白濃度測定采用上海生工Modified Bradford Protein Assay Kit測定。得到蛋白質含量以后，同時測得其葡萄糖氧化酶的活性，由此得到葡萄糖氧化酶的比活性。

1.2.7 酶的分離純化 取發酵液在4℃、6 000 r/min離心20 min，去除發酵液中的菌體；將離心得到的上清液加入無水乙醇（終濃度20%），4℃靜置過夜，6 000 r/min離心20 min；取上清液，再加入無水乙醇（終濃度60%），4℃靜置過夜，6 000 r/min離心20 min，將得到的沉淀用0.1 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋到合適的酶活即得到初步純化的GOD酶液。將初步純化的GOD酶液采用DEAE-Sephadex A50進一步純化后經超濾濃縮后即可得精純度的葡萄糖氧化酶酶液。

1.2.8 葡萄糖氧化酶的酶學性質研究

1.2.8.1 溫度對酶活力的影響 （1）最適溫度：取10 μL一定濃度的純化后酶液，分別于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下測定其酶活力。（2）溫度耐受：取一定量的純化后的酶液，分 別 于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃ 和65℃孵育30、60、90和120 min測定酶活力。

1.2.8.2 pH對酶活力的影響 （1）最適pH：取10 μL一定濃度的純化后酶液，分別于不同pH的緩沖液（終濃度均為 40 mmol/L）中，40℃測定其酶活力，并計算其比活。（2）pH耐受：取一定量的純化后酶液，分別于不同pH的緩沖液中孵育5 h；然后，于40℃下，取一定濃度的 10 μL 酶液測定酶活力。

1.2.8.3 金屬離子對酶活力的影響 將10 μL一定濃度的純化后酶液，在 pH6.0緩沖液混合后，分別加入終濃度為 0.1、1.0和10.0 mmol/L的金屬離子，補水到125 μL，40℃下測定其酶活力。

2 結果

2.1 點青霉GOD基因的克隆分析

以點青霉基因組DNA為模板，引物P1和P2進行PCR擴增（圖1）。序列分析結果表明，其基因組DNA長1 815 bp，GC含量為55.4%，無內含子，編碼605個氨基酸（圖2）。用BLAST 進行同源分析，結果顯示與產黃青霉（Penicillium chrysogenum）的GOD基因（GenBank登錄號：XM_002563405.1）有99% 的核酸序列相似性。推導的GOD氨基酸序列與已知的產黃青霉氨基酸序列相似性達99.8%，僅第15位氨基酸發生了Thr-Ala的轉變。

圖1 點青霉基因組PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 表達載體構建與鑒定

將經引物GodF和GodR進行PCR擴增并純化回收的點青霉GOD基因和經過EcoR I和Not I雙酶切的載體pMD-AOX進行Gibson連接以構建重組質粒。用重組質粒轉化感受態大腸桿菌DH5α，并在含Amp的LB平板上篩選陽性菌落。陽性菌落質粒經EcoR I和Not I雙酶切后，得到約6.5 kb和1.8 kb的兩個DNA片段，亦與預期大小相符（圖3）。重組質粒測序結果顯示目的基因的完整閱讀框序列已正確插入到pMD-AOX載體α-因子信號肽DNA序列的下游，表明含點青霉GOD基因的畢赤酵母表達載體 pMD-AOX-GOD已構建成功。

圖2 GOD氨基酸同源性比較

2.3 重組酵母葡萄糖氧化酶的表達

將重組的表達質粒 pMD-AOX-GOD經Pme I酶切后線性化后，電轉化畢赤酵母X33感受態，在YPD平板生長3 d后，隨機挑選陽性菌落轉接液體YPCS，經甲醇誘導72 h后，測定發酵液上清中的葡萄糖氧化酶活性，從32個轉化子中挑選出6株有葡萄糖氧化酶活性的轉化子，表達率為16.7%。說明表達載體pMD-AOX-GOD 于畢赤酵母X33中得到有功能活性表達。

圖3 重組質粒pMD-AOX-GOD瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.4 10 L發酵罐發酵結果

選取X33-GOD中酶活最高株為實驗株在10 L發酵罐中發酵，在甲醇未誘導之前，處于菌株培養和碳源飼喂階段，在這兩個階段內，菌體大量增長，此時無葡萄糖氧化酶蛋白的表達。隨著甲醇的誘導，發酵液中的葡萄糖氧化酶活性逐漸增加（圖4），誘導144 h后發酵液中GOD活性達到最高496 U/mL，蛋白質表達量達到9.4 g/L，SDS-PAGE（圖5）結果表明，發酵液中葡萄糖氧化酶蛋白表達量也在不斷積累，發酵液上清中GOD含量非常高，可以達到電泳純，可大大降低后期GOD純化的成本。

圖4 葡萄糖氧化酶發酵液酶活增長曲線

圖5 10 L發酵罐中葡萄糖氧化酶經甲醇誘導不同時間內的表達量

2.5 重組酵母GOD的分離純化

取 300 mL發酵液經高速冷凍離心，酒精沉淀、溶解后，上DEAE-Sephadex A50層析柱，超濾濃縮，收率可達94%。純化前后電泳圖譜（圖6）顯示，在甲醇的誘導下，GOD在X33中的表達量明顯高于其他雜蛋白。發酵液上清經分離純化后，可見一條濃染的約90 kD的蛋白質條帶，點青霉GOD理論分子量為60.2 kD，這與圖4中點青霉GOD電泳結果（65 kD）相似，但是重組酵母 GOD蛋白條帶明顯比點青霉GOD分子量大。根據該基因中有潛在的糖基化位點，畢赤酵母表達系統又有轉錄翻譯后的加工功能，推測畢赤酵母表達的GOD蛋白質為糖蛋白。

圖6 重組表達GOD蛋白SDS-PAGE

通過蛋白含量標準曲線測定出酶液中的蛋白含量，再通過常規的葡萄糖氧化酶酶活性測定方法，最后得到了該酶的比活。經過測定，畢赤酵母X33-GOD比活為123.0 U/mg。同時，測定的青霉GOD比活僅為101.3 U/mg。

2.6 GOD的酶學性質研究

2.6.1 溫度對酶活力的影響 在pH6.0的測活條件下，改變測活條件的反應溫度，研究溫度對酶活力的影響，最適溫度（圖7-A）顯示，該酶催化反應的最適溫度為40℃-45℃，70℃下酶活力基本接近0。重組 GOD對溫度的穩定性（圖7-B）顯示，在35℃下孵育90 min酶活力基本保持不變，孵育到120 min時降低了12個酶活單位；在40℃下孵育90 min降低了15個酶活單位，孵育到120 min時降低了20個酶活單位；在45℃和50下℃孵育30 min降低了15個酶活單位，孵育到120 min時降低了40個酶活單位；在55℃下孵育30 min降低了20個酶活單位，孵育到120 min時降低了50個酶活單位；60℃孵育30 min，酶活力大約降低了30個酶活單位，孵育90 min后酶活力幾乎檢測不到。

圖7 溫度對GOD酶活力（A）及熱穩定性（B）的影響

2.6.2 pH對酶活力的影響 在40℃的測活體系中，改變緩沖液的pH值，分析重組表達的葡萄糖氧化酶的酶活力發現，酶活力對反應的pH作圖，得到一個相對平緩的曲線，最適 pH為6.0（圖8-A）。重組葡萄糖氧化酶對pH的穩定性（圖8-B）表明，在不同pH的緩沖液中孵育5 h，重組表達的葡萄糖氧化酶在pH3.5-7.0的緩沖液中的酶活力能維持在90%以上，在pH3.0和pH8.0緩沖液中，酶的活性降低為原來的60%左右。

圖8 pH對GOD酶活力（A）及pH穩定性（B）的影響

2.6.3 金屬離子對酶活力的影響 不同濃度的金屬離子對葡萄糖氧化酶的酶活力影響（圖9）顯示，在0.1 mmol/L的金屬離子濃度條件下，葡萄糖氧化酶的酶活力大多能維持在80%以上（除Ag+），Ag+對其有抑制作用；在金屬離子濃度為1.0 mmol/L時，葡萄糖氧化酶的酶活力大多能維持在80%以上，其中Zn2+對其有激活作用，Ag+對其有抑制作用；當金屬離子濃度為10 mmol/L時，Ag+、Cu2+和Fe3+對GOD活力的抑制作用非常明顯，Ag+尤為顯著，GOD的剩余酶活力僅為1%。

圖9 金屬離子對重組GOD的影響

3 討論

GOD作為安全的生物抗氧化劑，在科研醫藥和食品工業生產上被廣泛應用。目前，在產生菌的誘變育種篩選及產酶條件的優化上做了大量工作［9-12］，也有一些學者進行了黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母中的克隆和表達［3，13，14］。畢赤酵母表達系統優點是蛋白表達量高，可將外源蛋白分泌至胞外，且被表達的蛋白中雜蛋白少；畢赤酵母還具有對表達產物進行加工、折疊和翻譯后修飾［15］。本研究依據已知產黃青霉的GOD序列從點青霉中成功克隆了GOD基因，通過BLAST，相似性達99%，說明在青霉屬中GOD相對保守；點青霉GOD發生了氨基酸置換（Thr15-Ala），由于點突變能改變酶分子的催化反應動力學參數及催化反應活化能的現象，從而影響蛋白質熱穩定性［16］。

本研究構建的畢赤酵母菌工程菌株X33-GOD在10 L發酵罐中30℃、pH6.5條件下發酵培養時，培養液GOD 酶活可達496 U/mL。X33-GOD比原始出發菌株點青霉的酶活（30 U/mL）提高近16倍。郭元芳等［13］報道的畢赤酵母SMD1168 表達黑曲霉accc30161GOD，其培養液上清GOD酶活力為107.18 U/mL；周亞鳳等［3］構建出GOD的高產酵母工程菌株，經甲醇誘導3-4 d，發酵液中的GOD 活力為30-40 U/mL；李卓夫［17］將青霉GOD在畢赤酵母GS115中異源表達，在3 L發酵罐水平中，甲醇誘導132 h，發酵液中的最高酶活為111.3 U/mL。因此，本研究構建的畢赤酵母X33-GOD工程菌株具有很高的推廣應用價值。

本研究所分泌表達的GOD的單亞基分子量為90.0 kD，比原始菌株點青霉所產GOD單亞基分子量高約25 kD，分子量差異主要是由于糖基化造成的。糖基化對畢赤酵母分泌表達的GOD在蛋白折疊中起重要作用，能使酶蛋白結構具有更好的穩定性，這種過糖基化現象在黑曲霉GOD在畢赤酵母的表達中也存在［3］。

在青霉和黑曲霉中提取GOD需要經過DEAE離子交換層析和凝膠過濾層析兩步才能純化，花費時間長并且費用也相對較高［18，19］。畢赤酵母發酵表達GOD，不需破碎菌體，發酵的上清液經離心就能得到，且畢赤酵母表達系統極少分泌自身蛋白，雜蛋白含量低，只需經過酒精沉淀和一步離子交換層析就可以達到電泳純，純化收率高，費用低廉，該方法適合工業化生產，有利于大規模純化。

酶學性質研究發現，相比以往報道的重組黑曲霉GOD和產黃青霉GOD的最適溫度僅有40℃［19，20］，本研究重組表達的來源于點青霉的GOD的最適溫度是40-45℃，范圍較寬；并且該酶熱穩定性良好，在35-55℃之間都能保持良好的酶學活性，酶的熱穩定性提高很可能也是由于過糖基化所造成的，畢赤酵母分泌表達的黑曲霉GOD也表現出了熱穩定性的提高［21］；其次該酶在pH3.5-7.0之間能保持90%以上酶相對活力，有較高的應用價值。

本研究中Zn2+對酶有一定的激活作用，而Ag+、Cu2+和Fe3+對酶的活性有抑制作用，這與張茜［19］報道的尼崎青霉菌GOD的性質一樣。而Kelley等［22］報道當Cu2+達到10 mmol/L時，GOD活性仍沒有被抑制；蘇茉等［18］研究認為Zn2+對黑曲霉H1-9b所產GOD的活性有抑制作用。

4 結論

將點青霉菌的葡萄糖氧化酶基因（GOD）克隆到載體 pMD-AOX質粒，線性化質粒pMD-AOXGOD，轉化到畢赤酵母Pichia pastoris X33中異源表達，獲得了GOD的高產畢赤酵母工程菌株。結果顯示，與點青霉GOD 相比，畢赤酵母Pichia pastoris X33GOD具有更高的發酵酶活和比活。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning of Gene for a Glucose Oxidase from Penicillium notatum and Its Enzymatic Properties

GAO Qing-hua1HU Mei-rong2WU Fang-tong1TAO Yong2WANG Yun-peng1LUO Tong-yang1HU Chang-ying1
（1. Institute of Microbiology，Hebei Academy of Sciences，Baoding 071051；2. Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

The purpose of this work is to clone the gene of glucose oxidase（GOD）from Penicillium notatum，which was then in heterologous expression in Pichia pastoris，and the enzymatic properties of purified proteins were studied. GOD gene was cloned from genome DNA of P. notatum No. 8312 strain using PCR technique，the gene was ligated to the vector pMD-AOX and then expressed in strain X33 of P. pastoris，and finally the enzymatic properties of the purified proteins were analyzed. As results，the strain X33-GOD highly expressed the GOD with activity. Its activity of GOD in cultured supernatant reached 496 U/mL and the specific activity was 123.0 U/mg at 30℃ and pH6.5. The optimal temperature and pH of recombinant GOD was 40-45℃ and 6.0 respectively. The result of stability of the enzyme showed that the enzyme was stable when the temperature under 50℃ and the pH3.5-7.0，and it can be activated by 1 mmol/L Zn2+and obvious inhibited by Ag+. The recombinant engineering P. pastoris strain with high-yield GOD has a higher fermentation activity and specific activity compared with GOD from P. notatum.

glucose oxidase；Penicillium notatum；recombinant expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.023

2015-11-09

河北省科技計劃項目（14292804D），河北省科學院科技計劃項目（20150503 LR62-3）

高慶華，男，博士，研究方向：微生物發酵技術；E-mail：gaoqinghua_mbb@126.com