肺炎鏈球菌TCSs中WalR的克隆表達、保守性及抗原表位分析

韓道賓駱詩露黃健朱杰華陳澤慧閔迅

（1. 遵義醫學院醫學檢驗系，遵義 563000；2. 遵義醫學院附屬醫院檢驗科，遵義 563000）

肺炎鏈球菌TCSs中WalR的克隆表達、保守性及抗原表位分析

韓道賓1駱詩露1黃健2朱杰華2陳澤慧2閔迅1

（1. 遵義醫學院醫學檢驗系，遵義 563000；2. 遵義醫學院附屬醫院檢驗科，遵義 563000）

通過構建PET28a-WalR表達載體并在大腸桿菌BL21中表達WalR重組蛋白，以評價其對C57小鼠的免疫原性；并分析其在不同血清型肺炎鏈球菌中的保守性和B細胞的抗原表位。以肺炎鏈球菌D39血清型WalR基因為模板，構建重組質粒PET28a-WalR并轉入BL21誘導表達目的蛋白質。采用ClustalX 2.1軟件對WalR蛋白在不同血清型S.pn中的保守性進行分析；利用DNASTAR軟件對其B細胞抗原表位進行分析。結果顯示，成功構建PET28a-WalR重組表達載體，經IPTG誘導后有大量高純度的目的蛋白質，但其主要以包涵體形式存在；WalR蛋白在不同血清型肺炎鏈球菌中高達99.4%，其B細胞抗原表位可能位于9-16、35-42、95-111、113-135、150-161、200-218等氨基酸序列位點。成功獲得大量以包涵體形式表達的肺炎鏈球菌WalR重組蛋白，并對其保守性和抗原表位進行了系統分析。

肺炎鏈球菌；WalR；重組蛋白；保守性；抗原性

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia，S.pn）又稱為肺炎（雙）球菌，主要引起兒童和成年人肺炎、敗血癥、腦膜炎等疾病，也是導致流行性中耳炎的唯一病原體［1，2］。由于青霉素等抗生素的大量使用，s.pn的耐藥性逐年走高。臨床上廣泛出現了多重耐藥的S.pn菌株，甚至耐萬古霉素的S.p n菌株［3］。因此，通過研發免疫原性強、保守性高、價 格低廉的S.pn蛋白質疫苗，是解決S.pn耐藥問題的關鍵［4，5］。

雙組分系統（two-component systems，TCSs）是革蘭陽性菌特有的信號轉導系統，是S.pn通過感受外界環境變化、生長繁殖和維持自身存活的重要感應系統［6，7］。組氨酸蛋白激酶（Histidine kinase，HK/WalK）及其受體（Response regulator，RR/WalR）是S.pn TCS中的一對調節蛋白，其在細胞的能量信號轉導上起著至關重要的作用［8］。WalR主要通過磷酸化和去磷酸化使信號逐級放大，從而引起細胞能量代謝反應。研究證實，這些信號的傳遞往往與 細菌的耐藥性和致病性密切相關，也與其生物膜的形成存在一定的關系［9］。因此，以WalR為蛋白質疫苗作用靶點的相關研究可能具有重要價值。本研究擬通過蛋白重組技術獲得高純度的WalR目的蛋白以觀察其保護效應，并探討其在不同血清型S.pn中的保守性，以期為后續蛋白疫苗的研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 肺炎鏈球菌NCTC7466（D39）標準菌株。大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）菌株，原核表達質粒PET28a為本課題組保存。

1.1.2 試劑 基因組DNA提取試劑盒（北京天根公司），DNA片段純化試劑盒（TaKaRa），質粒提取試劑盒（美國Omega公司），限制性內切酶 BamHⅠ、XholⅠ（TaKaRa），PrimerStar高保真DNA聚合酶、DNA marker、T4DNA連接酶（TaKaRa），異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、LB培養基（上海生工）。

1.2 方法

1.2.1 高保真PCR獲取目的基因 用基因組提取試劑盒對過夜培養后的S.pn菌株D39進行基因組DNA提取，在NCBI基因庫中查找WalR目的基因（705 bp）并且用Primer premier5.0引物設計軟件設計引物，引物如下：

上游引物：CGGGATCC ATGAAAAAAATACTAATTGTAG，

下游引物：CCGCTCGAG TCAAGCATTATTTCTCATGT。

PCR擴增體系：反應體系為50 μL：ddH2O 32 μL、5×PS Buffer 10 μL、dNTP Mixture 4 μL、肺炎鏈球菌模板DNA 1.5 μL、上游引物F和下游引物R各1 μL、Prime Star酶0.5 μL。反應條件98℃ 20 s，54℃ 15 s，72℃ 43 s，30 cycles，72℃延伸5 min。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA純化試劑盒純化后測得濃度儲存于-20℃備用。

1.2.2 PET28a-WalR重組質粒的構建、篩選 將PET28a質粒和目的基因同時用BamHⅠ、XholⅠ雙酶切，酶切后純化并且用T4DNA連接酶連接。連接后轉化到大腸桿菌DH5α感受態中，并且接種于LB培養基平板（含50 μg/mL卡那霉素）。過夜后挑取單個菌落增菌進行菌液PCR，對PCR陽性的菌液增菌提取重組質粒行雙酶切鑒定。

1.2.3 重組WalR蛋白的表達 將上一步篩選得到的重組質粒PET28a-WalR轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中，挑取單個菌落增菌并且進行陽性鑒定，將陽性菌接種到LB培養基中（含50 μg/mL卡那霉素）培養，37℃監測光密度A600=0.4-0.6時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，12℃誘導12 h后9 000×g離心3 min收集細菌，重懸細菌后用超聲破菌儀破菌，12 000×g離心30 min后行SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達形式。

1.2.4 B細胞抗原表位預測 用DNASTAR Lasergene v7.1軟 件 結 合ameson-Wolf法、Emini法、Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法，分別對WalR蛋白抗原指數、表面可能性、親水性、可塑性進行分析來分析WalR蛋白B細胞抗原表位。

1.25 保守性分析 從NCBI GenBank數據庫中獲取不同型別肺炎鏈球菌的WalR蛋白氨基酸序列，用ClustalX 2.1軟件分析對WalR蛋白的序列保守性。

2 結果

2.1 WalR基因擴增

肺炎鏈球菌D39全基因組DNA為模板擴增目的片段，經1% 瓊脂糖凝膠電泳分析（圖1-A），可見大小約為705 bp的目的條帶，與預期值相符。

2.2 重組表達載體的構建

將擴增的目的基因片段與表達載體PET-28a連接，轉化入大腸桿菌DH5α，菌液PCR鑒定如圖1-B所示。對陽性菌提取重組質粒雙酶切鑒定如圖1-C所示。

圖1 目的基因的擴增（A），重組質粒菌液PCR（B）與重組質粒雙酶切鑒定（C）

2.3 重組蛋白的誘導表達

重組質粒轉化入大腸桿菌BL21（DE3）后挑取菌落誘導表達，在經過誘導的菌中看到一條明顯的條帶，分子量約為32 kD大小，即等于26 kD大小的WalR蛋白與6 kD大小的PET28a標簽蛋白的分子量之和，與預期相符。WalR蛋白主要集中在破菌液離心后的沉淀中（圖2），即蛋白主要是以包涵體形式存在。

圖2 WalR重組蛋白表達SDS-PAGE鑒定圖

2.4 WalR蛋白保守性分析

從NCBI蛋白數據庫中獲得不同型別肺炎鏈球菌WalR蛋白氨基酸序列：SP SMRU1009（登錄號：COO32846.1）、SP S-019（登錄號：CMX77473.1）、SP 208_80（登錄號：CKH25805.1）、SP 0311（登錄號：CKI97140.1）、SP 14（登錄號：CRH98180.1）、SP 28F（登錄號：CRH96017.1），對以上氨基酸序列進行比對分析，結果（圖3）顯示WalR蛋白在不同型別菌株間保守性達99.4%。

2.5 B細胞抗原表位分析

從圖4可看出，以親水性、可塑性、抗原指數以及表面可能性4種方法預測的WalR蛋白B細胞抗原表位位置比較接近，綜合得到的結果顯示其較可能成為B細胞抗原表位的氨基酸區段為9-16、35-42、95-111、113-135、150-161、200-218。

3 討論

肺炎鏈球菌疫苗的研發對于減緩肺炎鏈球菌的耐藥具有不可或缺的作用，其發展共經歷了3代［10］，第1代為23價多糖疫苗，第2代為7價結合疫苗，第 3代為蛋白質疫苗。蛋白疫苗的研發已經取得重要進展，研究證實，對鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）重組外膜蛋白（OmpA）對家禽具有顯著的保護效果［11］。肺炎鏈球菌谷氨酰胺tRNA合成酶（glutamyl tRNA syn-thetase，Gts）作為肺炎鏈球菌疫苗候選蛋白質，其保護效果也在BALB /c 小鼠體內得到了驗證［12］。有關肺炎鏈球菌蛋白疫苗Audouy［13］等已在人體中用單一重組PspA變體進行Ⅰ期臨床試驗，結果證實此疫苗能誘導針對異源PspA分子的廣譜交叉反應抗體，產生的抗體可以保護小鼠抵抗腹腔注射S.pn的攻擊。Intercell公司的S.Pn三聯蛋白疫苗已進入了Ⅱ期臨床試驗，目前還沒有上市的S.pn蛋白疫苗。

圖3 不同型別肺炎鏈球菌WalR蛋白保守性分析

圖4 WalR蛋白B細胞抗原表位分析

雙組分系統（TCSs）中蛋白調節對WalK/R在低GC含量的革蘭氏陽性細菌中具有維持細胞壁及表面穩態的雙重作用［14，15］。研究證實，在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）RN4220血清型中通過基因沉默低表達WalR蛋白質后發現細胞對于外界水解抵抗能力降低［16］。低表達WalR蛋白使得細菌產生侵襲性酶的量減少，細菌的自我保護機制減弱，從而就容易被殺滅。WalR蛋白在細胞生長代謝中的重要地位為其成為肺炎鏈球菌候選疫苗提供了保障和支持。

實驗通過ClustalX 2.1軟件對WalR的保守性進行了分析，從它的保守性來看在不同的型別的肺炎鏈球菌中WalR的保守程度高達99.4%，這一點為后期的WalR蛋白疫苗制備奠定了基礎，使得WalR蛋白疫苗可以產生廣泛的保護效果（針對更多的肺炎鏈球菌血清型）。對其B細胞抗原表位分析顯示在氨基酸序列 9-16、35-42、95-111、113-135、150-16 1、200-218可能成為抗原表位。這些抗原表位為后期抗原表位鑒定提供了依據。實驗首先構建重組表達載體并且在大腸桿菌中表達出WalR蛋白，受翻譯速率、折疊速率等因素影響蛋白大部分以包涵體的形式存在，上清中蛋白量很少，課題組通過摸索不同溫度、轉速及IPTG濃度（如誘導溫度設置為12℃、18℃、25℃等；轉速為60 r/min、80 r/min、100 r/min等；IPTG濃度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L等）誘導條件，但遺憾的是仍然未獲得呈上清表達的目的蛋白。可溶性蛋白的獲取還需要進一步的摸索誘導表達條件［17］。包涵體中的蛋白量很大，并且包涵體的致密結構可以使蛋白質的空間結構得以保留。可以采取進一步的包涵體溶解和復性獲取可溶性蛋白［18，19］。在后續的研究中，本課題組擬通過蛋白質復性、重新構建質粒等手段，以期獲得上清表達的重組目的蛋白。

4 結論

通過基因重組對WalR蛋白質進行了原核表達得到大量包涵體形式的蛋白質，ClustalX 2.1軟件分析得出其在不同血清型肺炎鏈球菌中具有高保守性，利用DNASTAR Lasergene v7.1軟件對B細胞抗原表位分析顯示在氨基酸序列 9-16、35-42、95-111、113-135、150-161、200-218可能成為抗原表位。

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（責任編輯 李楠）

Clone and Expression of WalR in Streptococcus pneumonia TCSs and Analyzation of Conservation and Antigenic Epitope

HAN Dao-bin1LUO Shi-lu1HUANG Jian2ZHU Jie-hua2CHEN Ze-hui2MIN Xun1
（1. Department of Medical Laboratory of Zunyi Medical University，Zunyi 563000；2. Clinical Laboratory Department of Zunyi Medical University Affiliated Hospital，Zunyi 563000）

This work aims to express WalR protein in Escherichia coli BL21 through constructing recombinant expression vector PET28a-WalR and to analyze the immunogenicity in the experimental animal C57 mice，as well as to test the conservation in different Streptococcus pneumonia serotypes and B cell antigenic epitopes. Using the WalR gene of S. pneumonia D39 as the template，the recombinant expression vector PET28a-WalR was constructed and then transferred into Escherichia coli BL21 for induced expressing target protein. The conservation of WalR protein in varied S. pneumonia serotypes was analyzed by ClustalX 2.1 software，and the B cell antigenic epitopes was analyzed by DNASTAR Lasergene v7.1. As result，recombinant expression vector PET28a-WalR was constructed successfully and much target protein was obtained by inducement of IPTG，however mainly in inclusion body. The conservation of WalR protein was up to 99.4% among different S. pneumonia serotypes，and the antigenic epitopes of WalR protein were likely located in 9-16，35-42，95-111，113-135，150-161，and 200-218 of amino acid sequence. In conclusion，recombinant S. pneumonia WalR protein in the form of inclusion body was successfully acquired，and the conservation and antigenic epitope were analyzed.

Streptococcus pneumonia；WalR；recombinant protein；conservation；antigenicity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.028

2015-12-02

國家自然科學基金資助項目（81460317），貴州省科技攻關項目（黔科合SY字（2012）3092號）

韓道賓，男，碩士研究生，研究方向：細菌致病分子機制研究；E-mail：you15865885832@126.com

閔迅，男，博士，教授，研究方向：細菌致病分子機制研究；E-mail：2815400619@qq.com