垃圾填埋場(chǎng)甲烷氧化菌及甲烷減排的研究進(jìn)展

王曉琳曹愛(ài)新周傳斌趙愷凝趙國(guó)柱

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085）

垃圾填埋場(chǎng)甲烷氧化菌及甲烷減排的研究進(jìn)展

王曉琳1曹愛(ài)新2周傳斌2趙愷凝1趙國(guó)柱1

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085）

垃圾填埋場(chǎng)是全球最重要的人為甲烷排放源之一，其全球年甲烷釋放量為35-69 Tg，垃圾填埋場(chǎng)甲烷減排是目前全球溫室氣體研究的熱點(diǎn)。甲烷氧化菌能夠氧化分解甲烷，作為減少大氣甲烷排放的重要生物匯，對(duì)保持大氣中甲烷濃度的平衡具有重要意義。從甲烷氧化菌的類(lèi)型及其特征、甲烷氧化機(jī)理著手，介紹了多樣性研究方法、填埋場(chǎng)中甲烷氧化菌的活性影響因素及甲烷生物減排應(yīng)用等最新研究進(jìn)展。在綜述前人研究的基礎(chǔ)上，探討了目前研究的不足，提出了利用甲烷氧化菌復(fù)合微生物菌劑等綜合處理措施，旨為垃圾填埋場(chǎng)甲烷減排的研究和應(yīng)用提供新的思路。

垃圾填埋場(chǎng)；甲烷；甲烷氧化菌；溫室氣體；生物減排

甲烷是一種重要的溫室氣體，其全球增溫潛勢(shì)是二氧化碳的25倍，我國(guó)將甲烷列為重點(diǎn)控制的溫室氣體之一［1］。研究表明，自前工業(yè)化時(shí)期以來(lái)，大氣中甲烷的排放對(duì)全球變暖的貢獻(xiàn)率約為20%［2］。據(jù)估算，全球每年通過(guò)自然源和人為源排放至大氣的甲烷為500-600 Tg［3］，而垃圾填埋場(chǎng)是最為重要的人為甲烷排放源之一，其年甲烷釋放量為35-69 Tg，垃圾填埋場(chǎng)的甲烷減排技術(shù)受到越來(lái)越多的關(guān)注［1］。填埋場(chǎng)中大量的可生物降解垃圾是其甲烷釋放的主要來(lái)源。填埋場(chǎng)的甲烷產(chǎn)量會(huì)達(dá)到峰值后緩慢下降，但釋放量會(huì)在其封場(chǎng)后仍然持續(xù)幾十年［4］。我國(guó)的生活垃圾衛(wèi)生填埋場(chǎng)雖然有導(dǎo)氣和填埋氣收集裝置，但也僅能收集60%-80%的填埋氣，仍有大量的甲烷排放到環(huán)境中。土壤中的甲烷氧化微生物在維持大氣中的甲烷濃度平衡中具有非常重要的作用，有研究表明土壤中的甲烷氧化菌貢獻(xiàn)了甲烷氧化總量的5%-15%，是重要的全球甲烷匯之一［5］。填埋場(chǎng)的存量垃圾和表層覆土中都有甲烷氧化菌的存在，因此強(qiáng)化其甲烷氧化功能、削減垃圾填埋場(chǎng)中無(wú)組織排放的甲烷，已成為垃圾處理、溫室氣體減排、生態(tài)及環(huán)境工程微生物等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［6］。

1 甲烷氧化菌類(lèi)型及其特征

甲烷氧化菌是一類(lèi)以甲烷為唯一碳源和能源的甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物［7］，可將甲烷經(jīng)一系列酶促反應(yīng)氧化成二氧化碳，于1906 年首次被分離出來(lái)。根據(jù)代謝途徑、膜結(jié)構(gòu)、主要磷脂脂肪酸成分等系列特征，甲烷氧化菌分為T(mén)ypeⅠ、TypeⅡ和Type X三種類(lèi)型。TypeⅠ型甲烷氧化菌歸屬于γ-變形菌門(mén)（gammaproteobacteria），通過(guò)磷酸核酮糖途徑同化甲醛；TypeⅠ型甲烷氧化菌中的Methylococcus和Methylocaldum也被稱(chēng)為T(mén)ype X型甲烷氧化菌，是一類(lèi)耐熱的甲烷氧化菌［8］。與Ⅰ型一樣，X型利用磷酸核酮糖途徑同化甲醛。X 型和Ⅰ型的不同之處在于 X型含有低水平的絲氨酸途徑酶，生長(zhǎng)溫度要比Ⅰ型和Ⅱ型高，且DNA中的GC%比大多數(shù)Ⅰ型高。而TypeⅡ型甲烷氧化菌歸屬于α-變形菌門(mén)（Alphaproteobacteria），通過(guò)絲氨酸途徑同化甲醛［9］。隨著研究的深入，人們又發(fā)現(xiàn)了屬于疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）的極端嗜酸嗜熱甲烷氧化菌［10-14］，其同化甲醛的途徑也為絲氨酸途徑。目前已知的甲烷氧化菌有24個(gè)屬［15-19］，主要類(lèi)型及其生物學(xué)特征，見(jiàn)表1。雖然甲烷氧化菌被認(rèn)為是以甲烷為唯一碳源和能源的甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物，但隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了Methylocella silvestris［20］等兼性甲烷氧化菌，這些菌除能利用甲烷外，還能利用多碳化合物、乙醇和烷烴作為碳源［21，22］。

表1 已知甲烷氧化菌的分類(lèi)及其生物學(xué)特征

2 甲烷的微生物氧化機(jī)理

雖然甲烷氧化菌的種類(lèi)和生存環(huán)境多種多樣，但通過(guò)其生物化學(xué)作用氧化甲烷的原理基本一致。Hanson等［7］解析了甲烷的生物氧化機(jī)理，如圖1所示。甲烷首先被氧化為甲醇，催化該過(guò)程的關(guān)鍵酶是甲烷單加氧酶（methane monooxygenase，MMO），該酶有兩種不同類(lèi)型，一種是顆粒狀或膜結(jié)合甲烷 單 加 氧 酶（particulate methane monooxygenase，pMMO），幾乎存在于所有已發(fā)現(xiàn)的甲烷氧化菌中；另一種是位于細(xì)胞質(zhì)中的可溶性甲烷單加氧酶（soluble methane monooxygenase，sMMO），僅存在于部分甲烷氧化菌中。雖然它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)具有相似的功能，但這兩種酶的基因和結(jié)構(gòu)明顯不同［23］。由于MMO 是甲烷氧化菌的功能酶系，且?guī)缀跛泻醚跫淄檠趸己衟MMO，因此已廣泛利用MMO作為生物標(biāo)記物進(jìn)行甲烷氧化菌生態(tài)學(xué)研究。接著甲烷氧化產(chǎn)生的內(nèi)源甲醇和由幾丁質(zhì)及木質(zhì)素降解形成的外源甲醇在甲醇脫氫酶（methanoldehydrogenase，MDH）的作用下氧化成甲醛。然后甲醛在甲醛脫氫酶的作用 下氧化成甲酸。同時(shí)，Ⅰ 型甲烷氧化菌可以利用磷酸核酮糖途徑同化甲醛，作為其生長(zhǎng)繁殖需要的碳源和能源；Ⅱ型甲烷氧化菌則通過(guò)絲氨酸途徑完成這個(gè)同化作用［24］。最后甲酸在甲酸脫氫酶作用下氧化為二氧化碳。

圖1 甲烷氧化菌氧化甲烷的機(jī)理圖［7］

3 甲烷氧化菌多樣性的研究方法

甲烷氧化菌多樣性研究可以很好地反應(yīng)甲烷氧化菌在環(huán)境樣品中的物種豐富度、各類(lèi)遺傳信息及其所執(zhí)行的功能和過(guò)程，為我們?nèi)媪私饧淄檠趸捌溲趸到饧淄榈墓δ艿於嘶A(chǔ)。研究甲烷氧化菌多樣性的方法主要有培養(yǎng)法、分子生物學(xué)法和穩(wěn)定同位素示蹤法［25］。因傳統(tǒng)的培養(yǎng)法得到的甲烷氧化菌分離培養(yǎng)物并不能代表填埋土里真正的甲烷氧化菌群落，會(huì)造成大量信息的丟失，特別是不可培養(yǎng)的甲烷氧化菌，所以目前研究者多采用分子生物學(xué)法和穩(wěn)定同位素示蹤法。

研究甲烷氧化菌常用的分子標(biāo)記物主要是16S rRNA和功能基因。16S rRNA作為研究最多和最透徹的基因序列，因其高度保守性和特異性，通過(guò)高通量測(cè)序Hiseq、Miseq等技術(shù)，已被廣泛地應(yīng)用于甲烷氧化菌的檢測(cè)及相關(guān)的分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。功能基因因其在復(fù)雜的環(huán)境樣品中具有高度敏感性和可識(shí)別不可培養(yǎng)的功能微生物的優(yōu)點(diǎn)也被越來(lái)越被廣泛使用［26］。pmoA（編碼顆粒性甲烷單加氧酶的α-亞基）已在大多數(shù)甲烷氧化菌中被測(cè)序，是目前研究最為深入的功能基因。另外，mmoX（編碼可溶性甲烷單加氧酶）、mxaF（編碼甲醇脫氫酶的較大亞基）［27］和nifH（編碼固氮酶的關(guān)鍵部分雙氮還原酶）［28，29］等功能基因也較為常用。

末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、變性梯度凝電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是常用的分析環(huán)境樣品中甲烷氧化菌多樣性的方法，與實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)結(jié)合使用，可以定量地分析環(huán)境樣品中甲烷氧化菌群落特征。傳統(tǒng)的定量方法——最大釋然法（most-probable-number，MPN）已被用來(lái)探測(cè)沼澤［30］、濕地［31］、稻田［32］等環(huán)境樣品中的甲烷氧化菌的數(shù)量，但因其取決于特定培養(yǎng)基中甲烷氧化菌的生長(zhǎng)情況，具有很大的偏好性。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，許多新興的技術(shù)也相繼出現(xiàn)。熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是利用帶有熒光標(biāo)記的探針與甲烷氧化菌的特征基因序列進(jìn)行雜交，來(lái)探測(cè)同源的核酸序列，最終來(lái)鑒定環(huán)境樣品中甲烷氧化菌的存在及豐度。它具有無(wú)需培養(yǎng)和無(wú)需單獨(dú)分離基因的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在其目標(biāo)物的16S rRNA需為已知的缺點(diǎn)［26］。

穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)（stable isotope probing，SIP）和微生物標(biāo)記物結(jié)合使用，可以有效的分析甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性。這項(xiàng)技術(shù)主要有DNA-SIP［33］、RNA-SIP［34］、磷脂脂肪酸（PLFA）-SIP［35］和最新的mRNA-SIP［36］。PLFA-SIP由于靈敏度高于DNA-SIP，經(jīng)常被用于甲烷氧化菌的檢測(cè)。PLFA是活體微生物細(xì)胞膜的重要組分，它在自然生理?xiàng)l件下相對(duì)穩(wěn)定，而通常細(xì)胞外的磷脂含量較少，當(dāng)微生物死亡時(shí)，磷脂會(huì)被迅速代謝［25］。因土壤中不同微生物的特征性PLFA組成和含量有所不同，所以與穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)結(jié)合可以指示特定微生物群落的結(jié)構(gòu)特征與生物量。土壤中Ⅰ型甲烷氧化菌的特征性PLFA以14C-PLFA和16C-PLFA為主，而Ⅱ型甲烷氧化菌則以18C-PLFA 為主［37，38］。但PLFA-SIP方法本身具有一定的局限性，其對(duì)微生物種類(lèi)的判斷主要依賴(lài)于樣品PLFA圖譜和已知的純培養(yǎng)甲烷氧化菌PLFA圖譜的比對(duì)，難以對(duì)環(huán)境樣品中甲烷氧化菌種類(lèi)進(jìn)行精確的鑒定［39］。

另外，以pmoA為目標(biāo)基因的微陣列（microarray）、基因芯片技術(shù)，也已應(yīng)用于檢測(cè)和定量垃圾填埋覆土中的甲烷氧化菌［40，41］，它可以清晰地反映垃圾填埋場(chǎng)在不同深度的空間趨勢(shì)。另外，納米二次離子質(zhì)譜（nanoSIMS）［42］、微流體數(shù)字PCR［43］等技術(shù)也被用來(lái)探究甲烷氧化菌群的功能特征。

4 填埋土層中甲烷氧化菌活性影響因素

影響垃圾填埋場(chǎng)覆土層甲烷氧化活性的主要因素有土壤成分、含水率、溫度、甲烷及氧氣濃度、NH4+、土壤pH值等。

4.1 土壤成分

增加土壤有機(jī)質(zhì)的含量，可以明顯提高甲烷的氧化活性［44］。因有機(jī)質(zhì)可以為甲烷氧化菌提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其數(shù)量和活性顯著增加［45］。Kightley等［46］通過(guò)在填埋覆土中添加富含有機(jī)質(zhì)的活性污泥發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，甲烷氧化能力提高了26%，而添加無(wú)機(jī)鹽K2HPO4的覆土，甲烷氧化能力變化不大。同時(shí)，有研究表明，有機(jī)質(zhì)含量高的生物覆蓋層與普通的泥沙覆土相比，前者不僅具有較高的甲烷氧化活性，可達(dá)441 μg CH4h-1· g· dw-1，而且甲烷氧化菌的數(shù)量也相對(duì)較高［47］。

4.2 含水率

當(dāng)填埋場(chǎng)覆土層含水率達(dá)到最適時(shí)，氣體易于擴(kuò)散，微生物活性較高，甲烷氧化活性最高；含水率過(guò)高時(shí)，甲烷和氧氣在土壤中的擴(kuò)散受到限制，使底物供應(yīng)受阻，從而降低了甲烷氧化能力［48］；含水率過(guò)低，則會(huì)使甲烷氧化菌的活性降低，其甲烷氧化性能顯著降低［49］。Scheutz［50］認(rèn)為填埋場(chǎng)覆土層中甲烷氧化的最佳含水率在25%左右。而Zhang等［51］研究添加活性污泥的填埋覆土發(fā)現(xiàn)，含水率與甲烷氧化活性呈倒U型關(guān)系，在24%-36%時(shí)，達(dá)到最大值。

4.3 溫度

LISP協(xié)議網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)除了將LISP主機(jī)間的互通進(jìn)行考慮外，還對(duì)LISP和非LISP主機(jī)間的通信進(jìn)行了考慮。如圖3給出了LISP和非LISP之間互通的整體網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)。

一般認(rèn)為甲烷氧化的最適溫度為25-35℃［49］。研究發(fā)現(xiàn)，在2℃時(shí)，甲烷氧化作用仍然存在［50，52］，表明即使在冬季甲烷氧化菌仍然可以有效地氧化甲烷，降低垃圾填埋場(chǎng)的甲烷排放量，但冬季垃圾填埋場(chǎng)甲烷的氧化效率要明顯低于夏季。Borjesson［53］發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的甲烷氧化菌都屬于I型，表明溫度具有選擇效應(yīng)，可以確定哪種類(lèi)型的甲烷氧化菌在給定的環(huán)境系統(tǒng)中起主導(dǎo)作用。同時(shí)，研究表明填埋場(chǎng)受所處氣候帶的影響，不同氣候帶中甲烷氧化菌的最適溫度也存在差異［54］。

4.4 甲烷及氧氣濃度

填埋場(chǎng)覆土層內(nèi)甲烷和氧氣的分布是由下層甲烷的產(chǎn)生和上層氧氣擴(kuò)散共同影響的。Li等［55］研究了不同濃度的甲烷對(duì)覆土層中甲烷氧化菌的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲烷濃度為5.0 ×104ppmv和1.0 ×105ppmv時(shí)，甲烷氧化菌的豐富度最高。且隨著甲烷和氧氣濃度的增高，甲烷氧化活性也不斷提高，最大可 達(dá) 98.7 ×1016mol·cell-1·h-1。Pawlowska［56］與He等［57］研究指出，覆土層內(nèi)好氧甲烷氧化速率最大的深度在10-20 cm之間，且隨著深度不斷增加，氧化效率逐漸減小，這應(yīng)與氧氣的濃度減小有關(guān)。

無(wú)機(jī)氮 對(duì)填埋場(chǎng)覆土層中甲烷氧化效果的影響較為復(fù)雜，正面或負(fù)面的影響都可能存在。現(xiàn)普遍認(rèn)為對(duì)甲烷氧化有抑制作用［58，59］，其抑制機(jī)理可能在于和CH4具有相似的分子結(jié)構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)甲烷氧化菌酶系統(tǒng)相同的位點(diǎn)或降低甲烷氧化酶活性，從而起到抑制甲烷氧化的作用［50］。Vissche等［60］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲烷濃度不同時(shí)，起到的作用也不同，低甲烷濃度時(shí)，可起到40%的抑制作用，且NH4Cl和（NH4）2SO4的抑制效果也大體一致，高甲烷濃度時(shí)，則起到促進(jìn)作用。

4.6 土壤pH值

填埋場(chǎng)覆土層甲烷氧化的最適pH值一般取決于土壤的材料。Zhang［61］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在添加了礦化垃圾的覆土中，甲烷氧化最佳pH為6.5-8.0。而甲烷氧化菌在沙質(zhì)脫鈣土壤中要求的pH一般在7以下，最低可到4.5［50］。現(xiàn)一般認(rèn)為，在自然環(huán)境條件下，甲烷氧化菌氧化甲烷的最佳pH為中性，pH值范圍在6.5-7.5［51］，而純培養(yǎng)時(shí)，甲烷氧化菌的最適 宜pH值為6.6-6.8［7］。

填埋場(chǎng)覆土層的植被可以有效提高甲烷氧化效率。原因可能是覆土層植被的根系可疏松土壤，形成氣體傳輸通道，增加氣體擴(kuò)散，從而形成適于甲烷氧化菌生長(zhǎng)的環(huán)境來(lái)提高其甲烷氧化能力［62］。Bohn等［63］在覆土中種植豆科植物發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，甲烷氧化能力顯著提高，這應(yīng)該與豆科植物的固氮作用有關(guān)，同時(shí)，他還認(rèn)為植物的蒸騰作用可以減少垃圾滲濾液，從而調(diào)節(jié)了覆土的含水率。

5 垃圾填埋場(chǎng)的甲烷生物減排

針對(duì)垃圾填埋場(chǎng)大部分填埋氣不能有效利用、甲烷排放濃度高等環(huán)境問(wèn)題，目前除了對(duì)甲烷氣體進(jìn)行收集燃燒或作為燃料開(kāi)發(fā)利用外，研究主要通過(guò)生物手段控制甲烷排放，主要包括檢測(cè)甲烷氧化優(yōu)勢(shì)菌，改良垃圾填埋覆土層以擴(kuò)大甲烷氧化菌培養(yǎng)，抑制產(chǎn)甲烷菌和準(zhǔn)好氧填埋等生物減排技術(shù)。

5.1 填埋土層中的甲烷氧化優(yōu)勢(shì)菌的檢測(cè)分析

Gebert等［64］利用末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)和微列陣技術(shù)研究了德國(guó)5個(gè)垃圾填埋場(chǎng)的覆土的甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，甲烷氧化菌的組成在這5個(gè)垃圾填埋場(chǎng)的不同填埋深度都基本相似。Ⅱ型甲烷氧化菌中的Methylocystis和Ⅰ型甲烷氧化菌中的Methylobacter和Methylococcus為優(yōu)勢(shì)菌屬，這與Stralis-Pavese等［41，65，66］的研究結(jié)果較為一致。而Chang等［67］通過(guò)借助pmoA的基因芯片技術(shù)研究種植不同植物的垃圾填埋土發(fā)現(xiàn)，Ⅹ型甲烷氧化菌Methylocaldum占主導(dǎo)作用，而Methylocystis在種植光棍樹(shù)（milk bush）的深層土壤中為優(yōu)勢(shì)菌。另外，Singh等［68］研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型甲烷氧化菌在種植牧草的垃圾覆土中占主導(dǎo)作用，Ⅱ型甲烷氧化菌在種植灌木林的垃圾覆土中發(fā)揮重要作用 。這可能與Ⅰ型甲烷氧化菌對(duì)氧濃度更加敏感，更喜歡高氧濃度，而Ⅱ型甲烷氧化菌對(duì)甲烷濃度更敏感，更適應(yīng)于高甲烷濃度下生長(zhǎng)有關(guān)。Lee等［69］研究了實(shí)驗(yàn)室模擬垃圾填埋生物覆蓋層的甲烷氧化菌，在不同深度土層的樣品中，利用熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌的數(shù)量無(wú)顯著差異。在上層（0-10 cm）樣品中，I型和II型甲烷氧化菌都發(fā)揮重要作用，而在中層（10-40 cm）和底層（40-50 cm）樣品中，I型比II型甲烷氧化菌更占主導(dǎo)地位。

5.2 甲烷氧化菌的強(qiáng)化

根據(jù)已知的影響填埋土層中甲烷氧化菌的活性因素，在填埋覆土層添加礦化垃圾、活性污泥等可以有效地強(qiáng)化甲烷氧化菌的生物活性，加快甲烷的氧化速度［70，71］。礦化垃圾是在填埋場(chǎng)中填埋多年，基本達(dá)到穩(wěn)定化，已可進(jìn)行開(kāi)采利用的垃圾，在長(zhǎng)期的生物降解過(guò)程中，其表面附著了數(shù)量龐大、種類(lèi)繁多、代謝能力極強(qiáng)的微生物群落。因其本身富含甲烷氧化菌（1.25×108-1.25×109CFU/g），且成本低、氧化效果明顯，并可增加再生填埋庫(kù)容，使填埋場(chǎng)空間循環(huán)利用，所以是甲烷氧化覆蓋層的一種很好材料［72］。Lou等［73］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加礦化垃圾和活性污泥，甲烷去除率分別可達(dá)78.7%和66.9%，且發(fā)現(xiàn)當(dāng)用14年以上的礦化垃圾處理時(shí)，效果最好。Zhang等［51］研究發(fā)現(xiàn)，以6∵4的比例添加礦化垃圾和活性污泥到覆土中，甲烷氧化效率可達(dá)到最佳。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)粉煤灰、陶粒等材料含水率低、孔穴豐富、比表面積大的優(yōu)點(diǎn)［74］，可添加到礦化垃圾和活性污泥中，配合使用來(lái)增強(qiáng)甲烷氧化效果。另外，種植植物也是改良填埋覆土的一種有效方法，目前填埋場(chǎng)覆土種植的植物主要集中在芒草、苜蓿和楊樹(shù)等［63，65，75］。有研究發(fā)現(xiàn)，利用礦化垃圾中的硫酸鹽還原菌進(jìn)行甲烷的共氧化是甲烷自然減排的另一種途徑［76］。

甲烷 氧化菌除了能夠氧化甲烷作為生長(zhǎng)所必需的碳源和能量外，由于甲烷單加氧酶的底物非特異性，使得還可以氧化一些碳?xì)浠衔锛安糠蛀u代烴。因垃圾填埋氣中除了甲烷和二氧化碳外，還有約占填埋氣總體積1%的各種非甲烷有機(jī)氣體，如氯乙烯、苯及甲苯等，且大多有毒。所以甲烷氧化菌的這一性質(zhì)對(duì)于垃圾填埋氣中非甲烷有機(jī)氣體的去除也有著重要意義。另外，對(duì)甲烷氧化菌的開(kāi)發(fā)利用也取得了一定進(jìn)展，有報(bào)道利用甲烷氧化混合菌合成聚β-羥基丁酸酯（PHB）［77］（一種生物可降解的仿生塑料）、利用混合菌為催化劑實(shí)現(xiàn)丙烯氧化生產(chǎn)環(huán)氧丙烷［78］、去除水體中的污染 物三氯乙烯［79］以及廢水脫氮［80］等。

5.3 產(chǎn)甲烷菌的抑制

與甲烷氧化菌不同，產(chǎn)甲烷菌是一類(lèi)能夠?qū)⒂袡C(jī)或無(wú)機(jī)化合物經(jīng)厭氧消化作用轉(zhuǎn)化成甲烷和二氧化碳的古細(xì)菌，為嚴(yán)格厭氧菌，生存條件較為苛刻，也是垃圾填埋場(chǎng)甲烷氣體的主要生產(chǎn)菌。目前，研究主要通過(guò)添加甲烷抑制劑多為多鹵素化合物，如氯代甲烷、三氯乙炔、溴氯甲烷等抑制產(chǎn)甲烷菌的代謝活性，從而減少甲烷釋放量。Zhao等［81］通過(guò)餐廚垃圾厭氧發(fā)酵過(guò)程中甲烷抑制的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同樣濃度的二氯甲烷、氯仿和四氯化碳，氯仿的抑制作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于二氯甲烷和四氯化碳。當(dāng)濃度都為20 mg/kg時(shí)，氯仿對(duì)甲烷的抑制率可達(dá)到98.1%，而四氯化碳和二氯甲烷的抑制率分別為42.7%和43.2%。雖然，鹵素化合物對(duì)產(chǎn)甲烷菌有較好的抑制作用，但因其本身具有毒性，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，還具有一定局限性。對(duì)填埋場(chǎng)進(jìn)行好氧通風(fēng)也是抑制微生物產(chǎn)甲烷的有效途徑之一，準(zhǔn)好氧填埋是代表性的技術(shù)之一［82］。準(zhǔn)好氧填埋是通過(guò)滲濾液收集管的不滿(mǎn)流設(shè)計(jì)，在填埋場(chǎng)內(nèi)外溫差的作用下使空氣自然通過(guò)滲濾液收集管末端進(jìn)入填埋場(chǎng)，從而使得垃圾內(nèi)部部分區(qū)域處于好氧狀態(tài)，使垃圾降解的速度得到提高，并且減少了甲烷的排放［72］。

6 結(jié)語(yǔ)

甲烷氧化菌在甲烷減排、全球溫室氣體控制及碳、氮、硫等元素的地球生物化學(xué)循環(huán)中都起到了非常重要的作用。垃圾填埋領(lǐng)域的甲烷氧化研究正在受到越來(lái)越 廣泛的關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于甲烷氧化菌的研究主要集中在好氧甲烷氧化菌、氧化機(jī)理、填埋場(chǎng)覆土應(yīng)用等方面，以下幾方面還有待進(jìn)一步的探索。

6.1 垃圾填埋甲烷氧化復(fù)合微生物菌劑研究

微生物菌劑在促進(jìn)有機(jī)物發(fā)酵、除臭、降解污染物等方面具有廣泛的應(yīng)用，但目前還沒(méi)有甲烷氧化菌的復(fù)合微生物菌劑的應(yīng)用。在傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法中，甲烷氧化菌生長(zhǎng)非常緩慢、細(xì)胞密度低、發(fā)酵周期較長(zhǎng)，很難滿(mǎn)足工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)。這就需要對(duì)甲烷氧化菌的培養(yǎng)工藝進(jìn)行更深入的研究，強(qiáng)化氧氣、甲烷傳遞速率，提高甲烷氧化菌的生長(zhǎng)速度和酶活穩(wěn)定性，為開(kāi)發(fā)處理甲烷的微生物菌劑奠定基礎(chǔ)。另外，除臭菌劑主要是靠微生物降解作用去除NH3，即以的形態(tài)被微生物吸收，作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)新陳代謝作用為微生物所分解、利用，最終將其氧化分解為等。而和CH4因具有相似的分子結(jié)構(gòu)，可以競(jìng)爭(zhēng)甲烷氧化菌酶系統(tǒng)相同的位點(diǎn)或降低甲烷氧化酶活性，起到抑制甲烷氧化作用，所以可利用除氨氣的微生物和甲烷氧化菌相結(jié)合，開(kāi)發(fā)同時(shí)處理甲烷與氨氣的復(fù)合微生物菌劑，以解決垃圾填埋場(chǎng)溫室氣體排放和惡臭污染的問(wèn)題。

6.2 甲烷氧化菌的互生關(guān)系研究及其應(yīng)用

目前已有研究表明，甲烷氧化菌同氨氧化菌、填埋土表面植物之間存在某種互生關(guān)系，例如氨氧化菌可以削減以減少其對(duì)甲烷氧化功能的抑制，填埋土表面植物可以為甲烷氧化菌提供必要的好氧環(huán)境。目前常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段和方法，較難分離得到純種甲烷氧化菌，這可能預(yù)示著在土壤生態(tài)系中，甲烷氧化菌與其他生物或環(huán)境之間存在著密切的依存關(guān)系，它們對(duì)甲烷的協(xié)同作用，降解機(jī)理還不是十分清楚。在未來(lái)的研究中，分子技術(shù)、同位素示蹤等新的研究手段，有望進(jìn)一步解析甲烷氧化菌同其他微生物或植物間的互生、共生、拮抗關(guān)系，對(duì)于掌握其耦合作用機(jī)制，提升甲烷協(xié)同氧化能力，具有非常重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

6.3 厭氧型甲烷氧化菌的機(jī)理與應(yīng)用研究

生活垃圾填埋場(chǎng)堆體內(nèi)部主要是厭氧環(huán)境，而厭氧是甲烷產(chǎn)生和釋放的必要條件。目前除了通過(guò)管道通風(fēng)換氣，抑制厭氧發(fā)酵甲烷的產(chǎn)生，同時(shí)促進(jìn)好氧甲烷氧化菌對(duì)甲烷的分解外，則主要通過(guò)好氧型甲烷氧化菌及填埋層覆土材料的選擇與工程優(yōu)化等方面進(jìn)行綜合甲烷減排。厭氧甲烷氧化菌的作用機(jī)理研究剛剛起步，也僅有較少的菌株被篩選出來(lái)。有研究表明，厭氧甲烷氧化古菌可參與到有機(jī)廢水的“反硝化”過(guò)程，為反硝化細(xì)菌還原和提供電子和所需物質(zhì)等，幫助其最終完成反硝化過(guò)程，亦可達(dá)到甲烷減排的目的。因此，厭氧甲烷氧化菌在填埋場(chǎng)的工程應(yīng)用研究同樣具有一定的開(kāi)發(fā)前景。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Methanotrophic Bacteria in Landfills and the Reduction of Methane Emission

As the main source of anthropogenic methane emission，landfills globally produce 35-69 Tg methane per year. The technology of reducing the methane emission in landfills has become a hot topic at present. Methanotrophic bacteria decomposing methane are the important biological collection to reduce atmospheric methane emissions，which is of significance in keeping the balance of the methane concentration in the atmosphere. Starting from the taxonomy and characteristics of methanotrophic bacteria，and the mechanism of its oxidizing methane，we summarized the latest research progress on the methods of studying diversity，factors affecting the activities of methanotrophic bacteria in landfills，and applications of them in the biological reduction of methane emission. Based on the prior researches，the issues in current studies of methanotrophic bacteria are also discussed. We propose comprehensive measures of utilizing the complex microbial agents of methanotrophic bacteria in landfills，providing a new thought in the research and application of reducing methane emission in landfills.

landfill；methane；methanotrophic bacteria；greenhouse gas；biological reduction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.003

2015-07-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41201579，J1103516，31093440，31493010，31493011），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目（TD2012-03）

王曉琳，女，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：yexiayuan@126.com

趙國(guó)柱，男，博士，研究方向：資源與環(huán)境微生物；E-mail：zhaogz@im.ac.cn

WANG Xiao-lin1CAO Ai-xin2ZHOU Chuan-bin2ZHAO Kai-ning1ZHAO Guo-zhu1

（1. College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. State Key Laboratory of Urban and Region Ecology，Research Center for Eco-Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085）