泥鰍角蛋白18（K18）基因的克隆與表達分析

吳衛君劉士力李倩王雨辰練青平胡廷尖賈永義蔣文枰李喜蓮

（1. 浙江省淡水水產研究所 農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室&浙江省淡水水產遺傳育種重點實驗室，湖州 313001；2. 浙江省慶元縣水利局水產技術推廣站，慶元 323800；3. 上海海洋大學，上海 201306）

泥鰍角蛋白18（K18）基因的克隆與表達分析

吳衛君1，2劉士力1，3李倩1王雨辰1練青平1胡廷尖1賈永義1蔣文枰1李喜蓮1

（1. 浙江省淡水水產研究所 農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室&浙江省淡水水產遺傳育種重點實驗室，湖州 313001；2. 浙江省慶元縣水利局水產技術推廣站，慶元 323800；3. 上海海洋大學，上海 201306）

角蛋白18（K18）是角蛋白的一種，為中間纖維蛋白，是細胞骨架的組成部分。為了解泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）K18序列特征及其在不同組織中的表達，研究采用3'-和5'-RACE法克隆K18基因cDNA全長序列，并運用實時熒光定量PCR技術探討其在不同組織中的表達。結果表明，泥鰍K18基因cDNA全長序列1 694 bp，其中包含開放閱讀框1 299 bp，編碼432個氨基酸，其序列具有Ⅰ型角蛋白序列DGKVVS，以及非常相似序列DNA（R/K）LAADDF。相似度分析顯示，泥鰍K18與大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）的相似度最高為98%，與其它物種K18也存在不同程度的相似度。系統進化分析表明，泥鰍與其他物種的K18系統發育同源，且同陸生脊椎動物和硬骨魚類同源，并與大鱗副泥鰍的關系最為密切。通過定量分析，K18基因在泥鰍腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等8種組織都有表達，其中，腸表達最高，心臟最低。統計學分析表明，K18基因的表達在不同組織間存在顯著性差異。

角蛋白18（K18）；cDNA克隆；泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）；定量表達

角蛋白是一種細胞骨架蛋白，屬于中間纖維蛋白（intermediate filament proteins，IF蛋白），并進一步組裝成中間纖維（intermediate filament，IF）。中間纖維（IF）、微絲、微管等是細胞骨架的主要成份［1，2］，對維持細胞的一定形態，保持細胞的適應穩定性起著至關重要的作用［1，3］。IF蛋白構成了一個龐大的多基因家族，目前，已經確定在人體中包含60多個不同基因［4］，70多種家族成員［4，5］。在幾乎所有細胞骨架體系中1/3是中間纖維（IF），而最突出的是角蛋白［6］，約占IF的75%［5，7］，是IF蛋白中迄今最復雜的一組蛋白［8，9］。角蛋白不僅是上皮細胞骨架的組成部分，而且還充當分化標記蛋白［8］，確定上皮細胞類型以及代謝終端分化和胚胎發育過程中分化的狀態；也有助于確定上皮腫瘤的來源，某些情況下，是良性和惡性上皮腫瘤的預后標志物。為此，角蛋白在分化標記、疾病預防、臨床等方面具有重要意義［10］。角蛋白18（keratin 18，K18）是角蛋白的一種，目前，劉紅山等［11］研究了K18的免疫特異性，Knudson等［12］研究了角蛋白的同位素分析，席慶［13］、魏飛力等［14］研究了K18單克隆抗體的制備鑒定及應用，朱匯等［15］已研究了角蛋白基因啟動子，崔新潔等［16］則運用K18等抗體的表達研究上皮細胞的培養或鑒定。此外，迄今為止，斑馬魚（Danio rerio）、鯊魚（Scyliorhinus stellaris）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、金魚（Carassius auratus）、稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）等多種魚類K18基因cDNA已被成功克隆［3，8，17，18］，但有關泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）K18基因的研究尚未見報道。

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），俗稱：真泥鰍、本地泥鰍等，隸屬鯉形目（Cypriniformes）、鰍科（Cobitidae）、泥鰍屬（Misgurnus），其適應性強、分布廣、數量多、雜食性，同時，營養豐富、肉質細嫩、味道鮮美，具較高的藥用價值，是重要的小型經濟淡水魚類。目前，泥鰍的研究基本集中在繁殖、育苗、養殖、生長、餌料、發育等領域［19，20］，有關分子生物學的研究較少。該研究采用3'-和5'-RACE法，克隆泥鰍K18基因cDNA全長序列，并對其序列特征進行分析，同時運用實時熒光定量PCR（RTQ-PCR）技術研究其在不同組織中的表達，旨在了解K18基因序列特征及其表達，為泥鰍的分子生物學研究提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 所用健康泥鰍，采自浙江省淡水水產研究所的綜合實驗基地，取泥鰍的腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等組織，迅速放入液氮冷凍，隨后保存于-80℃備用。

1.1.2 主 要 試 劑 TRIzol?Reagent購 自 美 國Invitrogen公司。RACE試劑盒購自Clontech公司。DEPC購自上海生工生物技術有限公司。M-MLV RT-ase cDNA反轉錄試劑盒、10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus）、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、Ex Taq（5 U/μL）、DNA回收試劑盒、pMD18-T載體試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉錄合成cDNA 按照TRIzol?Reagent一步法提取各組織總RNA，用核酸蛋白測定儀檢測總RNA的濃度和質量，同時用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。之后，取各組織總RNA 500 ng按照M-MLV RTase cDNA反轉錄試劑盒說明，反轉錄合成cDNA，保存于-20℃備用。

1.2.2 泥鰍K18基因部分cDNA序列擴增 根據斑馬魚（GenBank登錄號：NM_178437.2），虹鱒（GenBank登錄號：NM_001124724.1），和稀有鮈鯽（上海海洋大學蔡生力教授提供）K18基因序列，設計兼并引物cDNA-F和cDNA-R（表1，圖1），進行PCR擴增泥鰍K18部分cDNA序列，模板為總RNA濃度和質量檢測最高的卵巢cDNA。反應體系50 μL，PCR程序：95 ℃預變性3 min進入循環；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共30個循環；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃結束程序。PCR產物按照DNA回收試劑盒純化回收。之后，按照pMD18-T載體試劑盒說明，連接pMD18-T載體，再轉化入DH5α感受態細胞，經培養，PCR檢測后篩選陽性克隆，送上海桑尼生物技術有限公司測序。測序所得序列由NCBI的BLAST比對檢驗，以初步確定是否為K18基因部分cDNA序列。

表1 引物序列

1.2.3 泥鰍K18基因3'-和5'-RACE技術克隆 根據已確定得到K18基因部分cDNA序列設計RACE引物GSP-K18-5'和GSP-K18-3'（表1，圖1），按照RACE試劑盒說明，反轉錄合成總RNA濃度和質量檢測最高的卵巢cDNA，作為模板，分別進行3'-和5'-RACE擴增。反應體系25 μL，擴增程序：94℃30 s，72℃ 3 min，共5個循環；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，共5個循環；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，共30個循環。擴增產物經電泳分離檢測，按照1.2.2方法，進行回收純化，連接載體，轉化感受態細胞，篩選陽性克隆，送上海桑尼生物科技有限公司測序。

圖1 引物在序列中的位置

1.2.4 泥鰍K18序列分析 根據測序結果進行拼接得到泥鰍K18基因的cDNA全長序列，應用ORF Finder 程 序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/ gorf/），確定開放閱讀框，翻譯氨基酸序列，并進行NCBI的BLAST比對（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）。預測氨基酸的物理參數用ExPASy在線Protparam 程序（http://web.expasy.org/protparam/），預測二硫鍵用Scratch程 序（http://www.ics.uci.edu/~baldig/scratch/ index.html），分析跨膜結構為TMHMM程序（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），預測信號肽用SignalP程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），預測蛋白質二級結構用bioinf程序（http://bioinf. cs.ucl.ac.uk）分析結合Predictprotein程序（https：//www. predictprotein.org/），分析蛋白質結構域用SMART程序（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析結合NCBI的Conserved Domains（CD-Search）程序（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/cdd/），預測蛋白質三級結構用SWISS-MODEL程 序（http://www.swissmodel.expasy. org/）［21-23］。 用ClustalX 和DNAMAN軟 件 對 經BLAST比對的泥鰍K18與其他物種角蛋白氨基酸序列（表2）進行多重序列比對分析。然后用MEGA軟件，采取鄰位相接法（neighbor-joining，NJ），以Bootstrap重復1000次計算各分枝的置信度，構建泥鰍K18與其他物種角蛋白（表2）的NJ系統進化樹。

1.2.5 泥鰍K18基因組織差異表達檢測 根據上述已克隆的泥鰍K18基因cDNA全長序列，設計定量PCR特異性引物K18-F和K18-R（表1，圖1）。以泥鰍β-actin基因為內參，設計內參引物β-actin-F和β-actin-R（表1）。用于校正。以各組織合成的cDNA為模板，按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明，進行RTQ-PCR檢測K18基因組織差異，PCR程序：95℃ 4 min進入循環；95℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，共40個循環；72℃延伸8 min。采用2-△△Ct方法計算每個樣品組織目的基因的相對表達量。

1.2.6 統計分析 運用軟件SPSS對泥鰍K18基因相對表達量的計算結果，以單因素方差分析法（one-wayANOVA）的多重比較等分析各組織基因表達的差異顯著性。統計學上以P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

表2 泥鰍與其他物種角蛋白氨基酸序列及其相似度比對

2 結果

2.1 泥鰍K18基因的cDNA全長序列

克隆得到泥鰍K18基因cDNA全長序列1 694 bp，其中，包含5'-非翻譯區（5'-untranslated region，5'-UTR）81 bp和3'-非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）314 bp，開放閱讀框1 299 bp。3'-UTR有1個多聚腺苷酸加尾信號位點（AATAAA）和1個多聚A尾巴（poly A tail）（圖2）。所得泥鰍K18基因cDNA全長序列提交于NCBI的GenBank中，登錄號為JQ269652.1。

2.2 泥鰍K18基因氨基酸序列分析

泥鰍K18基因cDNA全長序列開放閱讀框共編碼432個氨基酸，該K18氨基酸序列具有角蛋白特征，N-端含重復的甘氨酸（G）；C-端富含絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）和纈氨酸（V）（圖2）。另外，還具有I型角蛋白共有序列DGKVVS，以及I型角蛋白非常相似的序列DNA（R/K）LAADDF（圖3）。通過預測，蛋白質分子式：C2088H3447N613O692S16，相對分子質量為48.7239 kD，理論等電點為5.42。其中，亮氨酸（L）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）的含量較高，分別為10.6%、10.0%、8.8%，色氨酸（W）的含量最少為0.2%。同時，66個負電荷氨基酸殘基（Asp + Glu），57個正電荷氨基酸殘基（Arg + Lys）。脂肪族氨基酸指數為87.13。泥鰍K18基因氨基酸預測無二硫鍵，也無跨膜結構及信號肽。所得泥鰍K18基因氨基酸序列提交于NCBI的GenBank中，登錄號為AFD54864.1。

圖2 泥鰍K18基因cDNA全長序列及其推導的氨基酸序列

通過結構域分析（圖2）表明，泥鰍K18的結構域含：3個卷曲螺旋區域（82 aa-125 aa、189 aa-233 aa、286 aa-391 aa）和1個保守的IF蛋白結構域（84 aa-395 aa）。通過蛋白質二級結構預測，結果（圖4）表明，泥鰍K18的二級結構含：13個（α-）螺旋、7個（β-）折疊股及20個其他無規則卷曲，分別占二級結構的32.5%、17.5%及50.0%。并通過SWISS-MODEL程序，構建了K18的蛋白三級結構（圖5）。

通過NCBI經BLAST蛋白質相似度比對分析，泥鰍K18基因氨基酸序列與大鱗副泥鰍的相似度最高為98%，與斑馬魚、金魚、虹鱒、白斑狗魚（Esoxlucius）的K18相似度也較高，分別為90%、84%、77%、76%，此外同其他一些物種角蛋白基因氨基酸序列也存在不同程度的相似度（表2）。

圖3 泥鰍與其他物種I型角蛋白基因氨基酸序列比對

2.3 泥鰍K18基因的系統進化分析

利用軟件ClustalX多重序列比對和軟件MEGA構建NJ系統進化樹。結果（圖6）表明，不同物種及不同類型的角蛋白，分別獨立占據系統進化樹的不同分枝。其中，角蛋白K1、K3、K5、K8與其他類型角蛋白（K10、K11、K13、K17、K18、K20、K42、K97）獨立占據一個大分枝，同時，K18又獨立占據一個分枝，并分為兩個分枝：一枝為人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、褐家鼠（Rattus norvegicus）等脊椎動物；另一枝為魚類，包括該研究所得泥鰍K18，表明泥鰍與其他物種的K18系統發育同源，進一步證實此基因屬于K18類型家族。此外，泥鰍K18與在分類地位上也同屬鰍科的大鱗副泥鰍聚在一起，系統發育關系最為密切。

圖4 泥鰍K18氨基酸序列及預測的蛋白質二級結構

圖5 SWISS-MODEL程序預測的泥鰍K18的蛋白質三級結構

2.4 泥鰍K18基因在各組織中的表達分析

以β-actin為內參，用RTQ-PCR檢測泥鰍K18基因在腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等8種組織的表達情況，結果（圖7）表明，K18基因在泥鰍8種不同組織中都有表達，但表達量存在明顯的組織差異性，其中，在腸表達最高，心臟最低，在胃、肝臟、精巢、脾臟等組織也有較高表達，腸的相對表達量是心臟的22.4倍。通過統計學分析表明，K18基因的表達在不同組織間存在顯著性差異，其中，腸同其他組織間的差異極顯著（P<0.01）；心臟除與卵巢外，同其他組織存在顯著性差異（P<0.05），并與腸、胃、肝臟、脾臟的差異極顯著（P<0.01）。

3 討論

3.1 泥鰍K18基因的序列特征

IF蛋白可分為：Ⅰ型（角蛋白）；Ⅱ型（角蛋白）；Ⅲ型（包含波形蛋白、外周蛋白、結蛋白等）；Ⅳ型（包含α-介連蛋白、神經纖維蛋白等）；Ⅴ型（核纖層蛋白）；Ⅵ型（聯絲蛋白、平行蛋白、微管卷曲蛋白等）等類型［8］。通過研究，首次克隆得到泥鰍K18基因cDNA全長序列，經NCBI的BLAST分析為K18基因cDNA序列，屬于IF蛋白。預測的分子量為48.7239 kD，在40 kD-64 kD范圍內，理論等電點為5.42，在4-6范圍內，符合Ⅰ型角蛋白（酸性角蛋白）特征，這與Infante等［5］的觀點一致。同時，泥鰍K18基因氨基酸帶66個負電荷氨基酸殘基（Asp + Glu），多于57個正電荷氨基酸殘基（Arg + Lys），也呈現酸性角蛋白。另外，研究所得泥鰍K18基因氨基酸序列中，N-端也發現了所有角蛋白共有特征，如富含重復的甘氨酸（G）。C-端富含絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）和纈氨酸（V），這同在其他角蛋白中也發現類似的氨基酸［24］。在C-端中還發現了其他 許多IF蛋白的I型角蛋白序列DGKVVS，以及許多I型角蛋白非常相似的序列DNA（R/K）LAADDF［24］。但研究也發現，個別物種在這兩個序列存在一些差異：大黃魚（Larimichthys crocea）K17的I型角蛋白序列卻為DGRVVS，I型角蛋白非常相似的序列卻為DNARLAAEDF；大黃魚K20的I型角蛋白非常相似的序列卻為DNAQLAADDF，這可能是由于物種在進化過程中發生了一定的突變，尚待研究。該研究還對K18的蛋白質結構域、二級結構、三級結構進行了預測分析，但目前對這方面研究較少，其結構與功能等關系及機理也尚待研究。

圖6 泥鰍與其他物種角蛋白的系統進化樹

圖7 K18基因在泥鰍不同組織中的表達水平

3.2 泥鰍K18基因的系統進化

按照表達不同，角蛋白又可細分為若干表達類型：E型、S型、H型、IRS型、ET型等［6，10］。K18屬于S型角蛋白，存在于目前研究的所有脊椎動物中［3］，且迄今為止，在已知的E型和S型系統發育分析中，這對經典的角蛋白被認為是所有脊椎動物類中唯一的角蛋白［25］。在人類中，經典的S型角蛋白K8和K18同陸生脊椎動物和硬骨魚類有真正的同源基因［5，18］。研究也發現，通過系統進化分析，泥鰍與其他物種的K18在進化樹中占據一個分枝，在這K18分枝中又分為兩枝：一分枝為人、牛、褐家鼠等陸生脊椎動物；另一分枝為泥鰍、大鱗副泥鰍、斑馬魚等硬骨魚類，進一步表明K18的系統發育同源，且同陸生脊椎動物和硬骨魚類同源。此外，在進化樹中，K8也獨立占據一個分枝，并也分為兩枝：一分枝為人、牛等陸生脊椎動物；另一分枝為大西洋鮭（Salmo salar）、斑馬魚、金魚等硬骨魚類，也表明K8同陸生脊椎動物和硬骨魚類同源。通過NCBI經BLAST蛋白質相似度分析，泥鰍K18基因氨基酸序列與大鱗副泥鰍具有98%的相似度，與斑馬魚、金魚、虹鱒、白斑狗魚等的K18相似度也較高，表明K18在進化中相對比較保守。

3.3 泥鰍K18基因的組織差異表達

IF蛋白顯示組織特異性［26］，K18是在皮膚內主要表達于汗腺和頂泌腺分泌細胞的一種廣泛分布的角蛋白［10］。在人類和小鼠的肝臟來源的細胞中，K18是唯一表達的角蛋白。該研究也發現，K18基因在泥鰍所檢測的8種組織中均有表達，但腸表達最高，心臟最低，在胃、肝臟、精巢、脾臟等組織也有較高表達，表明K18基因表達水平存在明顯的組織差異。K18是細胞的結構蛋白，是細胞的重要組成部分［1］，在各組織器官細胞中廣泛存在，該研究中K18基因在泥鰍腸、胃、肝臟、脾臟等上皮組織中有較高表達，進一步表明角蛋白通常表達于上皮組織，這與Schaffeld等［3，6］的觀點一致。此外，有研究表明，角蛋白的表達不限定于上皮組織［2，24］，還被發現在幾種卵母細胞和精子中［2］。同時，角蛋白還存在于多種間質細胞和組織中［18］。Druger等［2，24］研究表明，角蛋白還在金魚等視神經中表達，S型角蛋白在硬骨魚中還表達在間質細胞中，這可能有助于抵御滲透壓，并在視神經中可能再生這種抵御滲透壓能力［5，6］。研究結果也顯示，K18既在上皮組織表達外，還在肌肉、精巢、卵巢等組織表達。另外，心臟也有小部分表達，這可能是由于覆蓋于心臟腔面的上皮所致，但由于心臟的獨特結構和功能，心臟腔面的上皮僅是心臟的一小部分，為此，通常表達于簡單上皮的S型角蛋白——K18在心臟中表達較低。總而言之，K18基因的表達顯示組織特異性，其組織表達的差異及機理有待進一步研究。K18基因的組織表達存在差異性，在各組織器官細胞中廣泛存在，體現了K18在細胞骨架中承擔重要作用，同時，揭示了泥鰍K18的蛋白質二級結構、結構域以及三級結構等特征，并為了解泥鰍細胞骨架結構系統的研究奠定了一定基礎。

4 結論

研究首次克隆得到泥鰍K18基因cDNA全長序列1 694 bp，其中，包含開放閱讀框1 299 bp，編碼432個氨基酸，其序列與大鱗副泥鰍的相似度最高為98%，與其它物種K18也存在不同程度的相似度，并與其他物種的K18系統發育同源。通過定量統計分析，K18基因在泥鰍腸、肌肉、心臟、胃、肝臟、精巢、卵巢、脾臟等8種組織都有表達，其中，腸表達最高，心臟最低，且不同組織間存在顯著性差異。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Keratin 18 Gene in Loach（Misgurnus anguillicaudatus）

Keratin 18（K18），one of the keratin，is the intermediate filament proteins and an integral part of the cytoskeleton. In order to understand the sequence characteristics and expression of K18，cDNA full-length sequence of K18 gene was cloned from loach（Misgurnus anguillicaudatus）using RACE，and its expression in different tissues was explored using real-time quantitative PCR. The results showed that the cDNA full-length of cloned K18 gene was 1 694 bp，containing a 1 299 bp open reading frame encoding 432 amino acids. There were the sequence DGKVVS，and the very similar sequence DNA（R/K）LAADDF of type I keratin. Identity analysis revealed that loach had the highest identity up to 98% with large-scale loach（Paramisgurnus dabryanus）in K18，and there were various levels of identity with other species. Phylogenetic analysis demonstrated that the K18 gene of loach was in phylogenetic homology with other species，and in true orthologs with terrestrial vertebrates（tetrapods）and teleosts，moreover，closest with large-scale loach. K18 gene was expressed in the 8 tissues of intestine，muscle，heart，stomach，liver，testis，ovary，spleen，the highest in the intestine，and the lowest in the heart. Statistical analysis showed that the differences of expression among different tissues were significant.

keratin 18（K18）；cDNA clone；loach（Misgurnus anguillicaudatus）；quantitative expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.015

2015-08-03

浙江省重大科技專項（2013C02009），浙江省設施水產養殖科技創新團隊項目（2011R50029），浙江省公益技術研究項目（2010C32033，2012C22059）

吳衛君，男，碩士，工程師，研究方向：水產技術推廣、水產種質資源保護、分子生物學等研發工作；E-mail：zjwuweijun@163.com

胡廷尖，男，教授級高工，研究方向：水產苗種繁育；E-mail：zjscmz@163.com

WU Wei-jun1，2LIU Shi-li1，3LI Qian1WANG Yu-chen1LIAN Qing-ping1HU Ting-jian1JIA Yong-yi1JIANG Wen-ping1LI Xi-lian1

（1. Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Agriculture Ministry Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture & Key Laboratory of Freshwater Aquatic Animal Genetic and Breeding of Zhejiang Province，Huzhou 313001；2. Extension Station of Fisheries Technology，Water Resources Bureau of Qingyuan County，Zhejiang Province，Qingyuan 323800；3. Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）