大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種NPY基因的DNA和cDNA克隆及序列分析

劉浩白俊杰李勝杰

（1.中國水產科學研究院珠江水產研究所 農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣州 510380；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種NPY基因的DNA和cDNA克隆及序列分析

劉浩1，2白俊杰1李勝杰1

（1.中國水產科學研究院珠江水產研究所 農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣州 510380；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

神經肽Y（Neuropeptide Y，NPY）在機體的攝食活動中發揮重要作用，是哺乳動物最重要的一種內源性促食欲因子。為了解大口黑鱸（Micropterus salmoide）NPY基因的結構及進一步研究該基因在大口黑鱸中的功能作用，采用RT-PCR和RACE技術，克隆了大口黑鱸北方亞種（M. salmoides salmoides）和佛羅里達亞種（M. salmoides floridanus）NPY基因cDNA序列，結果表明兩亞種NPY cDNA均包括一個編碼99個氨基酸的ORF框和長度為52 bp的5'非編碼區（5'-UTR）；采用PCR和基因組步移技術獲得了長度分別為3 561 bp和3 565 bp的大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種NPY基因DNA序列。序列分析結果表明，大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種NPY基因由4個外顯子和3個內含子組成。經MATINSPECTOR軟件預測，在北方亞種和佛羅里達亞種啟動子序列分布有TATA框、CAAT框、CCAAT-Box、GATA-Box等基本轉錄調控元件。實驗在大口黑鱸兩亞種NPY DNA序列間發現了6個單個位點堿基差異，與大口黑鱸北方亞種相比佛羅里達亞種啟動子區域出現一個4個堿基的插入。不同物種間NPY基因的序列同源性分析表明大口黑鱸與鱖魚和石斑魚的NPY基因核苷酸同源性最高，達90%和88%，氨基酸同源性分別為93%和95%。

大口黑鱸；亞種；食欲；NPY基因

神經肽Y（neuropeptide Y，NPY）是一種含36個氨基酸的單鏈多肽，通過不同的受體將信號傳入細胞內發揮生物作用，對脊椎動物的攝食起到重要的促進作用［1］。1982年，Tatemoto等首先從豬腦中提取一種多肽，結構與YY肽（PYY）、胰多肽（YY）相似，具有發卡樣的三維結構，所以命名為神經肽Y。研究發現NPY在進化過程中非常保守，人、大鼠、小鼠以及家雞NPY氨基酸序列完全一樣，魚類神經肽Y與哺乳動物神經肽Y也具有較高的同源性［2］。

NPY是已發現最強有力的攝食刺激因子，饑餓時下丘腦弓狀核神經原合成NPY增多，傳遞給室旁核，作用于飽食中樞，進而刺激進食［3-5］。NPY在魚類攝食中的研究已有相關報道，例如，金魚腦室注射NPY可增加攝食量［6］；禁食后的金魚下丘腦有大量的NPY mRNA表達［7］。研究表明，食物缺乏將會使金魚、銀大麻哈魚和印第安大馬哈魚下丘腦中NPY的mRNA表達含量增加，復投餌后產生相反的影響［6-9］。目前，已有草魚、鱖魚、歐洲狼鱸、斑馬魚［10］、鯉魚、斑點叉尾鮰［11］、虹鱒［12］、褐牙鲆［13］及斜帶石斑魚［14］等的NPY cDNA序列或者NPY基因組序列被克隆。

本研究報道了大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種NPY基因cDNA的克隆與序列分析，克隆得到兩亞種NPY基因的全DNA序列；并采用生物信息學方法對其啟動子上的作用元件進行分析，同時對大口黑鱸兩亞種NPY基因的差異進行分析，旨在為進一步研究大口黑鱸的NPY基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用大口黑鱸佛羅里達亞種和北方亞種成魚體重約400 g，取自珠江水產研究所肇慶高要養殖基地；Trizol RNA提取試劑盒、RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、膠回收試劑盒和pMD19-T vectors system 購自TaKaRa公司；RACE試劑盒和Genome Walker Universal Kit購自Clontech公司；DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 腦組織總RNA的提取 按照TaKaRa公司Trizol試劑盒提供的方法分別提取大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種腦組織總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測其質量和濃度。

1.2.2 基因組DNA的提取 取大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種背部肌肉30 mg，按照天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒的方法進行。

1.2.3 大口黑鱸兩亞種NPY基因cDNA序列的擴增和克隆 參照GenBank中已登錄的大黃魚（Larimichthys crocea）、歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）、翹嘴鱖（Siniperca chuatsi ）、 花 鱸（Lateolabrax japonicus）、褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）等魚的NPY基因的cDNA序列，在同源保守區內設計上游引物p1：5'-AGGGATACCCAGTGAAACCG-3'，上游引物p2：5'-AGAGCTGCTGCTGAAGGA-3'和一個下游引物p3：5'-TCTTGACTGTGGAAGCGTGT-3'；引物委托廣州吉格生物科技有限公司合成，大口黑鱸兩亞種NPY基因的cDNA和基 因組克隆均使用相同的引物進行相關擴增。反轉錄過程按照TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒上的步驟進行，反應結束后采用p1和上述試劑盒中提供的下游引物M13 Primer M4：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'進行PCR擴增。反應體系為：Primer Star Mix：10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應程序為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；72℃延伸10 min。反應結束后，用引物p1和p3進行巢式擴增得到開放閱讀框（ORF）序列，然后用p2和反轉錄試劑盒中的oligo dT Adaptor primer進行3'RACE，PCR反應程序同上。PCR產物經膠回收純化后與pMD19-T載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆送上海英駿公司測序；使用Vector NTI 10.3軟件將上述序列進行拼接得到ORF框和3'非編碼區。

1.2.4 NPY基因內含子的擴增和克隆 根據已獲得的大口黑鱸NPY基因的cDNA序列，參照近源物種NPY基因內含子的位置設計3對引物：F1：5'-GCATTGTTATTTTACGGGTTTGTT-3'，R1：5'-AGAGGTAGTCGCCTACTCTGTCTT-3'；F2：5'-GGCGCCCTAACGGAGGGATACCC-3'，R2：5'-CCTTCAGCAGCAGCTCTGAGACC-3'；F3：5'-ATGGAAAGAGGTCTAGTCCTGAG-3'，R3：5'-CAATTATACAATACAATCAACATGC-3'。分別以大口黑鱸兩亞種基因組DNA為模板進行PCR擴增獲取內含子序列；PCR體系同1.2.3中反應體系，反應程序為：94℃ 2 min；94℃ 35 s，57℃ 30 s，72℃32 s，共32個循環；72℃延伸10 min。擴增產物經回收后與pMD19-T載體連接并轉化到感受態大腸桿菌DH5α，培養后挑選陽性克隆測序。

1.2.5 NPY基因5'側翼調控區序列的擴增和克隆 根據Genome Walker Universal Kit試劑盒的操作步驟，分別使用EcoR V酶切大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種基因組DNA后，與試劑盒中的接頭連接建庫。為了擴增5'側翼調控區序列，按要求進行兩次遞減PCR，第一次PCR的引物為AP1（試劑盒提供）：5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'和NPYGSP1：5'-TAGTACTTGGCTAGCTCGTCCGC-3'，先進行4個循環94℃ 15 s，72℃ 2 min，再進行30個循環，94℃ 25 s，65℃ 3 min，最后進行一個循環65℃ 10 min。取PCR產物稀釋50倍后作為模板，以AP2（試劑盒提供）：5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'和NPYGSP2：5'- CAGGAACCCCAGAGTCCCCAGCC-3'為引物進行巢式擴增，反應程序同1.2.4，PCR擴增產物膠回收純化后經連接轉化，再挑選陽性克隆菌株送生物公司測序。

1.2.6 生物信息學分析 將上述獲得的序列用Vector NTI軟件進行比對拼接，得到大口黑鱸兩亞種NPY基因的DNA序列，序列同源性分析采用NCBI數據庫BLAST程序。使用Matlnspector在線軟件對啟動子上的調控元件進行預測。使用MEGA 5.0軟件采用NJ法構建NPY的系統進化樹。

2 結果

2.1 腦組織總RNA的提取

將從大口黑鱸兩亞種腦部中提取的總RNA進行電泳檢測，結果（圖1）顯示28S、18S rRNA條帶完整，濃度比約為2∶1，說明提取的總RNA完整性較好，符合RT-PCR和RACE-PCR擴增要求。

圖1 大口黑鱸腦部總RNA

2.2 NPY基因cDNA的克隆和序列分析

將擴增獲得核心序列與3'端非編碼區片段經Vector NTI軟件比對拼接后，分析得到大口黑鱸兩亞種NPY的cDNA序列，結果（圖2）表明兩亞種NPY cDNA均包括ORF框和長52 bp的5'非編碼區（5'-UTR）以及一個3'非編碼區（3'-UTR）；分析發現大口黑鱸兩亞種NPY基因ORF框序列完全相同，長300 bp，編碼99個氨基酸，即prepro-NPY。經在線軟件預測，NPY前體包括28個氨基酸組成的信號肽、36個氨基酸組成的成熟 NPY以及 32個氨基酸組成的由 Gly-Lys-Arg指示的 NPY C 端肽。cDNA序列中沒發現加尾信號（AATAAA），但在距3'-UTR末端13 bp處發現一段序列ATTAAA。

2.3 大口黑鱸NPY基因cDNA與其他物種的同源性比較和系統進化分析

NPY基因的保守性較高，大口黑鱸NPY cDNA與GenBank中其他動物的NPY cDNA相比，Blast結果（表1）顯示與鱖魚和石斑魚NPY基因cDNA核苷酸同源性最高，達90%和88%，氨基酸同源性分別為93%和95%，與其他魚類NPY基因cDNA的同源性為77%-87%，氨基酸的同源性為63%-96%，與兩棲類非洲爪蟾的核苷酸同源性為76%，氨基酸同源性為58%，與哺乳動物（人、鼠、豬、雞、 綿羊、家牛、獼猴）核苷酸同源性達72%-79%，氨基酸同源性為63%-66%。

根據大口黑鱸NPY基因的ORF框序列推測的氨基酸序列與其他物種NPY基因編碼的氨基酸序列，利用Mega5.0軟件以NJ法構建氨基酸進化樹。結果（圖3）顯示，這20個不同物種分成兩個大的分支，一支為魚類；另一支為哺乳動物和兩棲動物。大口黑鱸在魚類分支中，與同為鱸形目的青鳉魚和花鱸緊密結合為一個分支，進化樹顯示與歐洲狼鱸的親緣關系也較近，這與傳統分類學的觀點相符。

圖2 大口黑鱸NPY基因cDNA序列及氨基酸序列

表1 大口黑鱸NPY基因與其他動物NPY基因同源性比較

2.4 大口黑鱸兩亞種NPY基因的序列分析及差異比較

根據所獲得的大口黑鱸NPY基因的cDNA序列設計引物擴增NPY基因的內含子，拼接得到大口黑鱸兩亞種NPY基因的DNA序列（GenBank登錄號分別為KR914669和KR914670），結果（圖4）顯示大口黑鱸兩亞種NPY基因包括4個外顯子和3個內含子。內含子均以GT開始，以AG結束，符合內含子組成的GT-AG法則，其內含子位置與鱖魚、花鱸等非常相似。與其他脊椎動物一樣，大口黑鱸NPY基因的第2個內含子較長，第3個內含子較短（圖5）。大口黑鱸第1個外顯子為一個5'非編碼區（5'-

UTR）。第2個外顯子編碼一個完整的信號肽和大部分的NPY主體。第3個外顯子包含指示NPY C端肽的G-K-R氨基酸和C-末端將在加工階段被剪切的氨基酸殘基。第4個外顯子包擴編碼6個屬于C側翼肽段的氨基酸殘基的片段以及3'非編碼區（3'-UTR）。大口黑鱸兩亞種NPY基因的各外顯子和內含子雖然長度相等，但測序結果表明兩亞種NPY序列間存在一定的差異，北方亞種NPY基因第一個內含子的69 bp處為堿基G，第2內含子的325 bp處為堿基G，3'非編碼區85 bp處為堿基A，而佛羅里達亞種NPY基因對應位置堿基分別為C、A和C。

2.5 大口黑鱸兩亞種NPY基因5'側翼調控區的分析根據特異引物NPYGSP1和NPYGSP2，采用Genome Walker技術擴增了大口黑鱸兩亞種NPY基因5'側翼調控區，測序結果顯示獲得北方亞種5'端片段1 394 bp，獲得佛羅里達亞種5'端片段1 398 bp，其中佛羅里達亞種在距啟動子上游814 bp處為堿基T，距啟動子上游711 bp處為堿基C，距啟動子上游184 bp處為堿基T，而北方亞種對應位置堿基分別為C、T和A；另外，南方亞種距啟動子上游174 bp處其后有一GTTT的片段，而北方亞種對應位置則缺失該片段（圖6）。

圖3 依據不同動物NPY氨基酸序列構建的進化樹

圖4 大口黑鱸NPY基因結構示意圖

克隆得到的兩亞種NPY基因的啟動子經在線軟件分析，結果（圖5）表明存在的基礎轉錄調控原件有TATA框、AP-1（肌動蛋白）、CCAAT框、GATA框（GATA結合蛋白）、CCAAT蛋白增強因子、八聚體結合因子-1（Oct-1）。另外，在大口黑鱸5'側翼調控區還發現了cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding，CREB），兩個與瘦素基因有關元件（STAT binding site）及5個糖皮質激素受體轉錄元件（GRE）。

3 討論

本研究首次報道了大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種NPY的DNA序列，實驗獲得3 561 bp大口黑鱸北方亞種NPY基因的DNA序列和3 565 bp佛羅里達亞種NPY基因的DNA序列；同時克隆獲得了大口黑鱸兩亞種NPY基因的cDNA序列。序列分析表明兩cDNA所編碼氨基酸完全一樣，這與NPY基因的結構在進化中的高度保守性相符；此外，Blomqvist等［15］研究表明，金魚與大鼠的蛋白質序列有3個氨基酸不同，電鰻與大鼠的蛋白質序列有5個氨基酸不同，人與鯊魚亦只有3個氨基酸不同；因此本實驗結果中大口黑鱸兩亞種NPY編碼氨基酸序列完全一致符合該基因氨基酸序列組成特性。與其他物種NPY基因的結構相同，大口黑鱸NPY基因也含有4個外顯子以及3個內含子，且起始密碼子在外顯子2上。

圖5 大口黑鱸北方亞種NPY基因序列

NPY與Y肽（PYY）、胰多肽（PY）序列最大的差別在于它們成熟肽中的第14個氨基酸殘基。研究表明除鱒魚的NPY成熟肽中第14個是蘇氨酸殘基外，其余都是丙氨酸殘基；而PYY和YY一般都是脯氨酸殘基［16，17］；本實驗結果顯示大口黑鱸兩亞種NPY成熟肽中第14個為丙氨酸殘基。另外，大口黑鱸兩亞種NPY基因第2個內含子（1 166 bp）與第3個內含子（78 bp）長度之比為14，鱖魚NPY基因的該比值也為14，石斑魚、青鳉魚、大黃魚、斑馬宮麗魚等其他鱸形目的魚該比值也均在4.5-11之間，而在斑馬魚和脊椎動物的NPY基因第2個內含子與第3個內含子長度之比一般小于4［12］，提示了大口黑鱸NPY基因的結構與鱖魚最為接近，這同它們都是鱸形目魚類相符，同時也說明了大口黑鱸NPY的結構與斑馬魚或人類的不同。

圖6 大口黑鱸兩亞種NPY基因啟動子序列差異比較

瘦素是一種肽類激素，作為一種飽食信號，可抑制下丘腦弓狀核中NPY基因的表達［18，19］，從而引起食欲減退；在大鼠NPY序列中，發現了兩個與瘦素基因有關序列（STAT binding site-like element），研究證實這兩個結合位點樣組件對小鼠NPY基因調控瘦素的翻譯與表達、以及神經中樞的調控例如食物的吸收具有關鍵作用［20，21］。我們在大口黑鱸兩亞種NPY基因的5'側翼調控區找到了3個瘦素起始結合位點STAT，說明瘦素基因可能在轉錄水平上調節大口黑鱸NPY基因的表達。研究表明，在虹鱒的視前區［22］，皮質醇對CRF及NPY mRNA的表達起調節作用，而CRF mRNA的表達也受到促糖皮質激素受體的調節［23］；我們在大口黑鱸NPY的5'側翼找到5個糖皮質激素受體轉錄元件GRE，說明通過GRE，糖皮質激素可直接介導NPY的轉錄，揭示了糖皮質激素對NPY mRNA的表達起調節作用。本實驗在大口黑鱸兩亞種5'側翼調控區發現了3個瘦素表達相關元件及5個糖皮質激素受體轉錄元件，進一步證明了通過瘦素及皮質醇對下丘腦NPY基因的調控可介導魚類的食欲。

本實驗結果表明大口黑鱸兩亞種NPY基因序列間存在一定的差異。差異位點處均不直接編碼氨基酸，但有可能通過調控基因的前期轉錄而影響其在兩亞種中的表達量。北方亞種啟動子1 224 bp處存在一個八聚體結合因子，而佛羅里達亞種該處由于多出一個GTTT的片段，形成了一段叉頭蛋白區域，叉頭蛋白在胚胎發育、細胞周期調控、糖類和脂類代謝、生物老化和免疫調節等多種生物學過程中發揮作用［24］，因此推測大口黑鱸兩亞種間NPY基因啟動子的該位置突變可能影響到兩亞種對于人工飼料的攝食以及利用；大口黑鱸佛羅里達亞種相對于北方亞種更易受外界環境影響，表現出攝食行為較為謹慎，易受驚嚇等，推測可能是由于兩亞種序列上的部分差異對NPY基因表達量的影響所致。另外，兩亞種間NPY基因啟動子上長度為4 bp的插入缺失部分經擴大群體驗證發現只存在于種間，種內不具多態性，因此該片段的插入缺失具有作為鑒別大口黑鱸兩亞種的分子標記的潛在價值。

4 結論

本研究采用RT-PCR和RACE技術，克隆了大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種NPY基因的cDNA序列；并在此基礎上，結合基因組步移技術獲得了長度分別為3 561 bp和3 565 bp的大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種NPY基因的DNA序列。序列分析表明大口黑鱸兩亞種NPY基因都有4個外顯子和3個內含子，兩亞種NPY 的DNA序列間存在6處單個堿基差異，與大口黑鱸北方亞種相比佛羅里達亞種啟動子區域出現了一段長4 bp的插入。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Analysis of DNA and cDNA Sequence in NPY Gene of Northe rn and Florida Subspecies of Largemouth Bass

LIU Hao1，2BAI Jun-jie1LI Sheng-jie1
（1. Pearl River Fisheries Research Institute，CAFS/Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510380；2. College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Neuropeptide Y（NPY）plays an important role in the activity of body feeding，and is the most potent endogenic orexigenic factor in mammals. In order to understand the structure and the function of NPY gene in the largemouth bass（Micropterus salmoide），the NPY’s cDNA of northern and Florida subspecies of largemouth bass were cloned by RT-PCR and RACE techniques. The result revealed that the NPY’s cDNA in two subspecies all contained an ORF encoding 99 amino acids and 5′-UTR of 52 bp. Using PCR and genomewalker technology，a 3 561 bp and a 3 565 bp DNA sequence of of NPY gene were acquired from northern and Florida subspecies of largemouth bass respectively. Sequence analysis indicated that gene from both subspecies contained 4 exons and 3 introns. By bioinformatics analysis with MATINSPECTOR，the basic transcriptional regulatory elements such as TATA Box，CAAT Box，CCAAT Box，and GATA Box were found in the promoters of both subspecies. Six single-site base differences between the two genomic NPY DNA sequences of 2 subspecies were discovered，4-base insert segments were identified in promoter sequence of Florida subspecies compared with the northern one. The homology of NPY genes with other species was also compared，the largemouth bass shared the highest nu cleotide homology with mandarin fish and grouper，reached 90% and 88% respectively，and the amino acid homology were 93% and 95%.

largemouth bass；subspecies；appetite；NPY gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.013

2015-07-28

國家科技支撐計劃（2012BAD26B03），國家自然科學基金項目（31201985），“948”計劃重點項目（2011-G12）

劉浩，男，碩士研究生，研究方向：水生生物遺傳育種；E-mail：liuhaoshuichan@163.com

白俊杰，男，研究員，研究方向：水產生物技術與魚類遺傳育種；E-mail：jjbai@163.net