產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選及胞外多糖結(jié)構(gòu)分析

李彬 陳向楠 張建法 王世明

（南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，南京 210094）

產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選及胞外多糖結(jié)構(gòu)分析

李彬 陳向楠 張建法 王世明

（南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，南京 210094）

篩選產(chǎn)胞外多糖菌株，探究胞外多糖流變學(xué)特性，并分析其結(jié)構(gòu)。從土壤中篩選產(chǎn)胞外多糖菌株，通過形態(tài)特征觀察及16S rDNA序列鑒定菌株。使用黏度計(jì)測定不同條件下胞外多糖溶液黏度變化，研究其流變學(xué)特性。通過乙醇沉淀、Sevag法和透析分離純化多糖，再利用氣相色譜、紅外光譜和核磁共振等手段分析多糖結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，篩選到一株產(chǎn)胞外多糖菌株，鑒定為腸桿菌WL113（Enterobacter sp.WL113）。所產(chǎn)胞外多糖黏度隨質(zhì)量濃度升高呈指數(shù)增大，濃度為10 g/L時(shí)黏度比1 g/L時(shí)提高約33倍；該多糖對溫度敏感，100℃時(shí)黏度比25℃時(shí)降低了89.8%；但此多糖在酸性、中性和弱堿性條件下黏度相對穩(wěn)定，對Na+、K+、Mg2+和Ca2+等金屬鹽離子耐受性能良好。結(jié)構(gòu)分析表明，該多糖主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖組成，摩爾比阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖=1.63∶3.16∶2.38，含有α型和β型吡喃糖，存在糖醛酸。

胞外多糖；流變學(xué)特性；腸桿菌；結(jié)構(gòu)分析

微生物多糖主要指某些細(xì)菌、真菌和藻類等微生物在代謝過程中產(chǎn)生的多糖。按照微生物分泌多糖的部位可將其分為胞壁多糖、胞內(nèi)多糖和胞外多糖三大類，其中胞外多糖具有產(chǎn)生量大、易與菌體分離、可通過發(fā)酵實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是研究和應(yīng)用較多的一類微生物多糖［1］。隨著對微生物胞外多糖研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其具有許多生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗腫瘤、抗氧化及絮凝等，如Takeuchi等［2］報(bào)道Xanthomonas campestri產(chǎn)生的黃原膠具有一定的抗腫瘤活性，Zhao等［3］報(bào)道Pseudomonas fluorescen PGM37產(chǎn)生的胞外多糖具有較好的吸水保濕和抗氧化性能，Lian等［4］研究表明Bacillus mucilaginosus胞外多糖能夠捕捉水中的重金屬離子，可作為生物絮凝劑，在凈化工業(yè)廢水等領(lǐng)域發(fā)揮作用。因此，微生物胞外多糖在新藥研發(fā)、保健食品開發(fā)及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域應(yīng)用前景較好。

本研究擬從土壤樣品中篩選出產(chǎn)胞外多糖的菌株，并對其產(chǎn)生的胞外多糖的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等作初步的分析研究，旨在為該胞外多糖日后的進(jìn)一步研究開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 采自江西省上饒市玉山縣三清山山腳。

1.1.2 試 劑 PCR所 用 的Taq Master Mix購 自Vazyme公司；DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；高速離心機(jī)，美國Sigma公司；NDJ-8S旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，上海平軒科學(xué)儀器有限公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司；凝膠圖像分析儀，上海培清科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；氣相色譜儀，美國Agilent科技公司；傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀、AV-500核磁共振儀，德國Bruker公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 蔗糖20 g/L，KNO33.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，MgCl20.2 g/L，CaCl20.07 g/L，F(xiàn)eCl20.0125 g/L，MnSO40.003 g/L，ZnCl20.0075 g/L，pH 7.0。此培養(yǎng)基加入2%的瓊脂即可配成相應(yīng)固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選及純化

1.2.1.1 菌株篩選 將土樣分為10組，各組稱取1 g土樣加入到裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在200 r/min，30℃條件下培養(yǎng)2 d后，從各組錐形瓶中各取1 mL培養(yǎng)基再次接入培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)2 d再富集一次。再從各組各取1 mL富集后培養(yǎng)基加入到9 mL無菌水中，混勻制成菌懸液，采用10倍梯度稀釋，取 10-6-10-4稀釋度的菌懸液涂于固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。

1.2.1.2 菌株純化 涂布好的培養(yǎng)皿培養(yǎng)2 d，待長出菌落后，根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取單菌落在培養(yǎng)皿上劃線，并重復(fù)3次，直到培養(yǎng)皿上長出的菌落為單一形態(tài)的菌落。挑選無色透明、有黏性的菌落編號后，分別接種至液體培養(yǎng)基中，200 r/min，30℃條件下培養(yǎng)2-4 d后發(fā)酵液變粘，并使用苯酚硫酸法［5］鑒定胞外產(chǎn)物。

1.2.2 菌株鑒定 采用基因組DNA提取試劑盒提取待測菌種的基因組DNA，利用細(xì)菌16S rDNA通 用 引 物2F：5'-CATGCAAGTCGAGCG-3'；2R：5'-GGTGTGACGGGCGGT-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序：94℃預(yù)變性 1 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用DNA凝膠回收試劑盒回收后在上海桑尼生物科技有限公司測序，對測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST序列比對，確定待測菌株的屬種。

1.2.3 胞外多糖提取及純化 向發(fā)酵2 d的培養(yǎng)基中加入1倍體積去離子水稀釋，8 000 r/min，離心15 min收集上清，去除菌體沉淀。向上清液中加入2倍體積95%乙醇，混勻后8 000 r/min，離心15 min棄上清，收集沉淀，即為粗多糖。粗多糖干燥后復(fù)溶于水配制成1%溶液，用Sevag法［6］去蛋白，加入Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）和多糖溶液以1∶1比例混勻，劇烈震蕩10 min，8 000 r/min，離心10 min，取上清液，反復(fù)多次至兩相界面無白色黏稠狀沉淀，使用酶標(biāo)儀在280 nm下檢測去蛋白效果。將多糖溶液在去離子水中透析24 h，然后加入2倍體積95%乙醇，混勻后8 000 r/min，離心15 min收集沉淀，在真空干燥箱中45℃干燥，得到純化多糖。

1.2.4 胞外多糖流變學(xué)特性測定 稱取適量干燥的胞外多糖，溶于去離子水中，配制成1%的多糖溶液，分別測定質(zhì)量濃度（1、2、4、6、8、10 g/L）、不 同 溫 度（25、30、40、50、60、70、80、90和100℃）、pH（2、4、6、7、8、10和12）、無機(jī)鹽（NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和FeCl3）對其黏度的影響。實(shí)驗(yàn)中采用NDJ-8S旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)于室溫，2號轉(zhuǎn)子，6 r/min條件下測定黏度，待讀數(shù)穩(wěn)定讀出黏度值。

1.2.5 胞外多糖結(jié)構(gòu)分析

1.2.5.1 氣相色譜分析［7］（1）稱取10 mg干燥的D-葡萄糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖于試管中，各加入10 mg鹽酸羥胺和0.6 mL吡啶，90℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后加入0.5 mL乙酸酐，在90℃水浴下繼續(xù)反應(yīng)30 min進(jìn)行乙酰化，然后將反應(yīng)產(chǎn)物放入80℃真空干燥箱中干燥后用1 mL氯仿溶解作氣相色譜分析。（2）稱取20 mg干燥純化多糖，加入2 mol/L的三氟乙酸（TFA）10 mL，110℃水解6 h，然后將水解產(chǎn)物放入80℃真空干燥箱中干燥后加入2 mL甲醇蒸干，并重復(fù)3-4次，以除去三氟乙酸，然后按照上述標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化方法將水解產(chǎn)物衍生化，80℃真空干燥后用1 mL氯仿溶解作氣相色譜分析。（3）色譜條件：色譜柱：DB-5型石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID），溫度280℃；進(jìn)樣口溫度：250℃，流速1 mL/min；升溫程序：150℃保持2 min，每分鐘升溫8℃至250℃，保持6 min；進(jìn)樣量：2 μL。

1.2.5.2 紅外光譜分析 取2 mg干燥的純化多糖與100 mg溴化鉀混合研磨壓片后，在4 000-400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析。

1.2.5.3 核磁共振分析［8］稱取200 mg純化多糖配制成為20 mg/mL的溶液，用0.5 mol/L H2SO4將其pH調(diào)至2.0，100℃加熱水解24 h。水解液冷卻后加入適量BaCO3粉末至無氣泡產(chǎn)生，12 000 r/min，離心15 min，取上清液在去離子水中透析24 h，再放入凍干機(jī)中過夜干燥。稱取10 mg干燥后水解多糖，溶于0.5 mL D2O中作1H譜分析；稱取30 mg干燥后水解多糖，溶于0.5 mL D2O中作13C譜分析；反應(yīng)溫度30℃。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)如圖1-A所示，菌落呈圓形，半透明，邊緣光滑，表面有光澤，黏稠；圖1-B為光學(xué)顯微鏡下菌體形態(tài)，菌體呈桿狀，末端鈍圓；16S rDNA測序結(jié)果顯示，其片段大小為1 431 bp，該序列提交至GenBank，登錄號為KT285023，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對，菌株與數(shù)據(jù)庫中腸桿菌屬Enterobacter sp. 638（NC009436）最相近，相似度達(dá)98%，結(jié)合菌株菌落形態(tài)特征，該菌鑒定為腸桿菌，命名為Enterobacter WL113。通過苯酚硫酸法鑒定菌株產(chǎn)生的胞外黏性物質(zhì)屬于多糖。

圖1 菌株菌落特征及光學(xué)顯微鏡下菌株形態(tài)

2.2 胞外多糖流變學(xué)特性研究

2.2.1 濃度對胞外多糖黏度的影響 研究不同質(zhì)量濃度胞外多糖溶液黏度的變化。如圖2-A所示，隨著多糖濃度的提高，溶液黏度逐漸增大。1 g/L的多糖溶液黏度為92 mPa·S，而10 g/L的溶液黏度為3 072 mPa·S，黏度提高了約33倍。

2.2.2 溫度對胞外多糖黏度的影響 研究胞外多糖溶液在25-100℃水浴20 min后黏度的變化情況。由圖2-B可以看出，隨著溫度的升高，多糖溶液黏度逐漸下降，25℃時(shí)黏度為2 857 mPa·S，100℃時(shí)降為292 mPa·S，降低了89.8%，表明該多糖對溫度變化較為敏感，熱穩(wěn)定性較差。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，100℃水浴20 min后，當(dāng)溫度降回25℃時(shí)多糖黏度能夠基本恢復(fù)，但加熱1.5 h后黏度不能恢復(fù)，表明長時(shí)間高溫加熱可能會破壞多糖結(jié)構(gòu)。

2.2.3 pH對胞外多糖黏度的影響 研究胞外多糖溶液在pH為2-12時(shí)黏度的變化情況。如圖2-C所示，多糖在pH值為2-8的范圍內(nèi)黏度變化相對穩(wěn)定，在中性條件下黏度最高，pH值為10及以上時(shí)黏度急劇降低，且調(diào)回中性后黏度不恢復(fù)，表明其在酸性至弱堿性范圍內(nèi)有較好的酸堿耐受能力，而強(qiáng)堿環(huán)境可能會破壞多糖分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致黏度降低。

2.2.4 無機(jī)鹽對胞外多糖黏度的影響 探究NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和FeCl3濃度分別為1%、2%、4%、6%、8%、10%和12%時(shí)對多糖黏度的影響。如圖2-D所示，隨著Na+、K+、Mg2+和Ca2+濃度的增加，多糖黏度呈波浪形變化，但總體上均大于未添加無機(jī)鹽時(shí)的黏度。實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的Fe3+加入到多糖溶液中后均會促進(jìn)多糖絮凝，產(chǎn)生沉淀。總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該多糖對Na+、Mg2+等金屬鹽離子的耐受性能良好。

圖2 胞外多糖流變學(xué)特性

2.3 胞外多糖結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 氣相色譜分析 標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相譜圖如圖3-A所示，6種單糖的出峰順序?yàn)椋?#鼠李糖，2#阿拉伯糖，3#木糖，4#甘露糖，5#葡萄糖，6#半乳糖。圖3-B為胞外多糖的氣相譜圖，對比圖3-A可知，胞外多糖主要單糖組成為：7#阿拉伯糖，8#甘露糖，9#葡萄糖，根據(jù)峰面積計(jì)算摩爾比為：阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖=1.63∶3.16∶2.38。

2.3.2 紅外光譜分析 胞外多糖的紅外光譜如圖4所示，此多糖具有典型的多糖特征吸收峰（3 335、 2 924、1 402、777 cm-1）［9］。3 335 cm-1的寬峰是O-H伸縮振動；2 924 cm-1處的弱峰是C-H伸縮振動；1 722 cm-1處的吸收峰由羧基C=O伸縮振動引起，說明多糖分子中可能存在糖醛酸；1 625 cm-1處為酰胺C=O吸收峰，表明該多糖為糖蛋白綴合物［10］；1 400-1 200 cm-1處的吸收峰是由于C-H變角振動；1 020和972 cm-1處的吸收峰是由糖分子中兩種C-O伸縮振動引起，一種是吡喃糖環(huán)內(nèi)醚鍵C-O-C，另一種是羥基吸收峰；883和844 cm-1處分別是吡喃糖β型和α型C-H變角振動的吸收峰，表明該多糖存在β型和α型吡喃糖苷［11］；777 cm-1處為吡喃糖環(huán)的對稱伸縮振動。

圖3 胞外多糖氣相色譜分析

2.3.3 核磁共振圖譜分析 圖5-A為胞外多糖1H NMR譜，δ5.0-5.4 ppm范圍內(nèi)信號表明多糖存在α構(gòu)型，而δ4.4-4.9 ppm范圍內(nèi)信號表明存在β構(gòu)型，δ1.0-1.5 ppm范圍內(nèi)信號可能為與C-O鍵相連的甲基質(zhì)子峰。圖5-B為胞外多糖13C NMR譜，低場區(qū)域103 ppm附近化學(xué)位移表明含有β型吡喃糖，高場區(qū)域99 ppm附近化學(xué)位移表明含有α型吡喃糖；δ76-80 ppm處信號表明有發(fā)生取代的C-2、C-3、C-4，76 ppm附近為被取代的C-4，δ70-76 ppm處表明有未取代的C-2、C-3、C-4，69 ppm附近信號表明有發(fā)生取代的C-6，60 ppm附近信號表明存在游離的C-6［12］；175 ppm處的峰是典型的糖醛酸信號峰［13］，與紅外光譜結(jié)果一致；15.5 ppm處信號表明存在C-6脫氧糖的甲基［14］。

圖4 胞外多糖紅外光譜圖

圖5 胞外多糖核磁共振圖譜分析

3 討論

在研究胞外多糖流變學(xué)特性時(shí)，增加多糖濃度及添加Na+、Mg2+等金屬鹽離子均會使溶液黏度不同程度地增加，可能是因?yàn)槎嗵琴|(zhì)量濃度的增加加強(qiáng)了多糖鏈間的相互作用［15］，而加入金屬離子后會改變多糖的電荷特性，也導(dǎo)致多糖分子間相互作用加強(qiáng)［16］，從而使黏度增大。而長時(shí)間高溫加熱及強(qiáng)堿均可能會破壞多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致黏度降低且不能恢復(fù)，F(xiàn)eCl3作為一種絮凝劑會沉淀多糖。因此，若應(yīng)用該多糖則需注意環(huán)境條件。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對微生物胞外多糖的研究有很多成果。徐春蘭等［17］篩選得到產(chǎn)胞外多糖的腸桿菌屬菌株Ente robacter Cloacae Z0206，并研究表明該菌株所產(chǎn)富硒多糖有較好的抗氧化活性，對DPPH自由基和羥自由基具有較好的清除作用。Jin等［18］研究表明Enterobacter Cloacae Z0206所產(chǎn)的胞外多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，摩爾比為6.860∶1.180∶0.455，Lu等［19］進(jìn)一步研究表明該多糖能增強(qiáng)免疫功能，顯示出該多糖具有良好的應(yīng)用前景。本研究所篩菌株培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵周期短，胞外多糖產(chǎn)量較高，水溶性良好，并分析了Enterobacter sp. WL113所產(chǎn)胞外多糖的流變學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，多糖活性方面還未涉及，接下來可對胞外多糖的保濕性能、抗氧化能力及絮凝特性等方面進(jìn)行探究，分析其應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從土壤中篩選出一株產(chǎn)胞外多糖的腸桿菌WL113（ Enterobacter sp. WL113）。通過對該菌所產(chǎn)胞外多糖的流變學(xué)分析表明，胞外多糖溶液黏度隨質(zhì)量濃度升高而 增大，濃度為10 g/L時(shí)黏度比1 g/L時(shí)提高約33倍；對溫度敏感，100℃時(shí)黏度比25℃時(shí)降低了89.8%，隨著溫度升高，黏度下降明顯；在酸性、中性和弱堿性條件下黏度相對穩(wěn)定；對Na+、K+、Mg2+和Ca2+等金屬鹽離子耐受性能良好。分離純化多糖后，通過氣相色譜、紅外和核磁共振對多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，表明該多糖主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖組成，摩爾比阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖=1.63∶3.16∶2.38，含有α型和β型吡喃糖，存在糖醛酸。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening of Exopolysaccharide-producing Strains and Structural Analysis of the Exopolysaccharides

LI Bin CHEN Xiang-nan ZHANG Jian-fa WANG Shi-ming
（School of Environmental and Biological Engineering，Nanjing University of Science and Technology，Nanjing 210094）

This study aims to screen and identify strains producing exopolysaccharides（EPSs），to study the rheological properties of EPSs，and to analyze the structure of EPSs. The strains producing EPSs were screened from soil，and were identified based on their morphology and 16S rDNA gene sequencing. The viscosity changes of EPSs in different conditions were determined by viscometer to study its rheological properties. Then，GC，IR and NMR were used to analyze the structure of EPSs isolated and purified by ethanol precipitation，Sevag method and dialysis. As a result，a strain producing EPSs was identified as Enterobacter sp. WL113. The viscosity of the EPSs exponentially increased with the concentration of EPSs，i.e.，viscosity increased about 33 times when concentration of EPSs from 1 g/L to 10 g/L. The EPSs were sensitive to temperature，and viscosity decreased 89.8% when temperature from 25 ℃ to 100 ℃. The viscosity of EPSs remained relatively stable under the condition of acid，neutral and weak alkaline. The EPSs also well tolerated with metal ions such as Na+、K+、Mg2+and Ca2+. The analysis of EPSs by GC，IR，and NMR indicated that the EPSs consisted of arabinose，mannose and glucose in a molar ratio of 1.63：3.16：2.38，also containing α-pyranose，β-pyranose and uronic acid.

exopolysaccharide；rheological properties；Enterobacter；structural analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.022

2015-07-28

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（30920130121013）

李彬，男，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物；E-mail：1106548478@qq.com

王世明，男，博士，研究方向：應(yīng)用微生物；E-mail：bioeng@mail.njust.edu.cn