保加利亞乳桿菌增殖培養基的優化研究

王月囡

（鞍山師范學院化學與生命科學學院，遼寧鞍山　114007）

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保加利亞乳桿菌增殖培養基的優化研究

王月囡

（鞍山師范學院化學與生命科學學院，遼寧鞍山114007）

摘要：通過研究保加利亞乳桿菌在優化MRS培養基和增殖培養基的增菌效果，進一步采用正交試驗優化篩選保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480的增殖培養基。試驗結果表明，在MRS培養基中添加0.6%果糖、0.4%蛋白胨、0.08%ZnSO4時，保加利亞乳桿菌菌體數為4.05×108CFU/mL；在優化MRS液體培養基中添加7.5%番茄汁、2.5%平菇汁、1.0%綠豆芽汁、4.0%啤酒時，保加利亞乳桿菌菌體數達到最高為7.82×108CFU/mL，較優化前的1.16×108CFU/mL提高了6.74倍，終點pH值為4.03。

關鍵詞：保加利亞乳桿菌；促生長物質；增殖培養基

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）是一種乳酸菌類益生菌，是人體腸道中的重要微生物［1-2］。乳酸菌能賦予食品柔和的酸味和香氣，改進食品的品質和營養，還具有維持微生態環境、抗突變、抗腫瘤、降血脂和提高免疫力等重要功能［3］，因此一直是食品界、醫藥界和微生態學界關注的熱點。

近年來，隨著人民生活水平的提高和健康意識的增強，我國發酵乳制品工業迅猛發展［4］。牛乳是國際公認幾乎全價的理想食品，酸奶以其獨特的風味和特有的保健功能越來越受到人們的喜愛，酸奶產量正以每年25%的速度遞增［5］，這對酸奶發酵劑的品質、特性、種類提出了新的要求。目前，一些企業已開始使用國外進口的凍干酸奶發酵劑，但凍干菌種價格昂貴，國產凍干菌活菌含量較低。要提高凍干菌活菌數，必須提高凍干菌懸液的質量分數，培養基中生長因子的選擇添加是其基礎和關鍵［6-7］。因此，根據我國國情和資源優勢，積極尋求來源廣泛、經濟易得的廉價原料，優化篩選適合乳酸菌大量生長的增殖培養基，是實現我國大規模工業化生產濃縮型乳酸菌發酵劑的重要研究課題之一。

本研究以保加利亞乳桿菌為研究對象，根據乳酸菌生長增殖的營養物質需要，對其發酵培養基成分中的氮源、碳源、無機鹽及增殖因子進行選擇，并運用正交分析方法對各成分的配比進行優化，得到最佳培養基，為保加利亞乳桿菌活菌制劑產品的開發奠定基礎。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）L.b- 1.1480，購于中科院微生物研究所。

1.1.2培養基

活化培養基采用10%脫脂乳，種子和傳代培養基采用MRS液體培養基。

酪蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖5 g，乙酸鈉5 g，吐溫80 1 g，檸檬酸氫二胺2 g，磷酸氫二鉀0.2 g，七水硫酸鎂0.2 g，一水硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.2～6.4，于121℃條件下滅菌20 min；計數培養基：在MRS液體培養基的基礎上添加1.8%瓊脂。

1.1.3生長因子的制備

（1）番茄汁的制備［8］。將新鮮番茄洗凈，用組織搗碎機搗碎榨汁，加1倍的水浸泡洗滌1次，經過濾，將2次濾液混合，置于冰箱備用。

（2）平菇汁的制備［9］。取鮮平菇200 g，切碎后加400 mL蒸餾水煮沸5 min，移入組織搗碎機搗碎，用3層紗布過濾，濾液即為平菇汁，備用。

（3）綠豆芽汁的制備［8］。將新鮮綠豆芽去根后洗凈，加等量水煮沸30 min，用組織搗碎機搗碎，過濾后離心10 min，分裝于瓶中，置于冰箱中備用。

（4）啤酒。啤酒放氣后置于冰箱中備用。

1.1.4主要儀器設備

PB- 10型數字酸度計，DHP- 120型恒溫培養箱，PHX- 150H型智能生化培養箱，T6新世紀型普析紫外分光光度計，YXQ- LS- 30SII型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，CJ- 1S型潔凈工作臺，PL2002型電子天平。

1.2試驗方法

1.2.1斜面種子活化

取斜面貯藏菌株接種于新鮮斜面，于37℃條件下培養。

1.2.2種子培養

取1～2環活化的斜面種子接入裝有100 mL基礎培養基的250 mL三角瓶中，于37℃條件下靜置培養24 h。

1.2.3增殖培養

以1%的接種量將種子液接入裝有100 mL增殖培養基的250 mL三角瓶中，于37℃條件下培養16 h。

1.2.4乳酸菌活菌計數

取1 mL增殖培養液加入到9 mL無菌生理鹽水中，依次做10倍系列稀釋，選取3個適當的稀釋倍數，吸取1 mL稀釋液注入無菌培養皿中，傾注法加入15 mL左右的計數培養基混勻，每個稀釋度做3個平行培養皿。待培養基凝固后，于30℃條件下倒置培養24 h。選取菌落數在30～300 CFU/mL的培養皿進行菌落計數。

1.2.5菌體質量分數（OD600）測定

采用紫外分光光度計測定，波長600 nm，增殖培養液稀釋至合適倍數，以相應增殖培養基為空白。

1.2.6pH值的測定

采用PB- 10型數字酸度計直接檢測。

1.2.7生長曲線的測定

菌種經活化擴培后，按1%接種量接種于優化的增菌培養基中，于37℃條件下培養，每2 h進行1次活菌計數，同時測定發酵液的pH值及OD600值，以便更準確地掌握其生長情況。

以培養時間為橫坐標、相應的活菌數為縱坐標，繪制生長曲線，同時測定增菌培養基中pH值的變化。

1.3不同碳源、氮源、無機鹽的選擇

依據基礎培養基，分別添加0.5%蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖作為碳源；添加1%蛋白胨、氯化銨、硫酸銨作為氮源；分別添加0.1%硫酸鋅作為無機鹽，其他組分均相同。在培養基中接入保加利亞乳桿菌，于37℃條件下靜置培養16 h，平板計數測定菌體質量分數，比較其對保加利亞乳桿菌生長的影響。

1.4增殖因子對保加利亞乳桿菌的影響

在基礎培養基中分別加入增殖因子（番茄汁、平菇汁、綠豆芽汁、啤酒），并依次按1%，2.5%，4.0%，5.5%，7.0%進行添加，培養16 h后測定培養液pH值、OD600值和活菌總數。

2　結果與分析

2.1保加利亞乳桿菌生長曲線的確定

了解L.b- 1.1480在MRS優化培養基和增殖培養基中的生長過程，從而掌握發酵最適收獲期，并進行生長曲線測定。以2%的接種量，于37℃條件下恒溫培養箱中培養，間隔2 h測定菌液的OD600值及pH值，間隔4 h測定菌液的活菌數，可得結果繪制生長曲線和pH值變化曲線。

保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480菌株在MRS優化培養基和增殖培養基中OD600值的變化曲線見圖1，保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480在MRS優化培養基和增殖培養基中的生長曲線見圖2。

圖1　保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480菌株在MRS優化培養基和增殖培養基中OD600值的變化曲線

由圖1和圖2可知，在MRS優化培養基和增殖培養基中，保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480延遲期較短，迅速進入對數生長期，菌體生長速率和酸度上升速率同時加快，培養至16 h，基質OD600值和活菌數均達到最高，活菌數分別為1.16×108CFU/mL和7.46×108CFU/mL，之后進入穩定生長期，OD600值和活菌數趨于平穩。因此，L.b- 1.1480的最適收獲期應為16 h。

圖2　保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480在MRS優化培養基和增殖培養基中的生長曲線

2.2添加不同的生長因子對L.b- 1.1480的影響

MRS培養基中添加不同生長因子對保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長的影響見表1。

表1　MRS培養基中添加不同生長因子對保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長的影響

由表1可知，果糖、蛋白胨、硫酸鋅對保加利亞乳桿菌的增菌效果最佳，根據進一步試驗確定果糖、蛋白胨、硫酸鋅的最佳添加量。

MRS培養基中添加不同質量分數的生長因子對L.b- 1.1480生長的影響見表2。

表2　MRS培養基中添加不同質量分數的生長因子對L.b- 1.1480生長的影響

由表2可知，L.b- 1.1480在以0.5%～0.6%果糖質量分數為碳源、0.4%～0.6%的蛋白胨為氮源、0.08% ～0.10%的硫酸鋅為無機鹽時生長較好，更好地被L.b- 1.1480利用，因此確定L.b- 1.1480最佳碳源為0.5%～0.6%果糖，最佳氮源為0.4%～0.6%的蛋白胨，最佳無機鹽為0.08%～0.10%的硫酸鋅。

2.3增殖因子最佳質量分數的確定

不同增殖因子對保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長的影響見表3。

表3　不同增殖因子對保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長的影響

由表3可知，番茄汁、平菇汁、綠豆芽汁和啤酒對L.b- 1.1480的生長均具有促進作用。平菇汁的促生長作用較為明顯，活菌數達5.30×108CFU/mL，較對照組MRS培養基活菌數提高了3.31倍，而加入其余3種生長因子的活菌數，也較對照組活菌數分別提高了3.04倍和2.96倍。根據進一步試驗，確定平菇汁、綠豆芽汁、番茄汁和啤酒的最佳添加量。

2.4增殖因子保加利亞乳桿菌生長L.b- 1.1480的影響

2.4.1番茄汁的添加量

不同質量分數的番茄汁對保加利亞乳桿菌L.b-1.1480生長的影響見表4。

表4　不同質量分數的番茄汁對保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長的影響

由表4可知，當加入番茄汁的質量分數為7.5%時，OD600值最大，平板計數測得的活菌數為5.18× 108CFU/mL。

2.4.2平菇汁添加量

不同質量分數的平菇汁對保加利亞乳桿菌L.b-1.1480生長的影響見表5。

表5　不同質量分數的平菇汁對保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長的影響

由表5可知，當加入平菇汁的質量分數為5.0%時，吸光度最大，平板計數測得的活菌數為5.35×108CFU/mL。

2.4.3綠豆芽汁的添加量

不同質量分數的綠豆芽汁對保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長的影響見表6。

表6　不同質量分數的綠豆芽汁對保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長的影響

由表6可知，當加入綠豆芽汁的質量分數為2.5%時，吸光度最大，平板計數測得的活菌數為5.70×108CFU/mL。

2.4.4啤酒的添加量

不同質量分數的啤酒對保加利亞乳桿菌L.b-1.1480生長的影響見表7。

表7　不同質量分數的啤酒對保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480生長的影響

由表7可知，當加入啤酒的質量分數為2.5%時，吸光度最大，平板計數測得的活菌數為5.81× 108CFU/mL。

2.4.5增殖培養基的正交優化

根據單因素試驗結果，以在改良MRS液體培養基中添加番茄汁（A）、平菇汁（B）、綠豆芽汁（C）、啤酒（D）為4個因素，每個因素3個水平為A（%）：1（5），2（7.5），3（10）；B（%）：1（2.5），2（5），3（7.5）；C（%）：1（1），2（2.5），3（4）；D（%）：1（1），2（2.5），3（4），采用L9（34）正交試驗設計配制9種培養基，優化L.b- 1.1480增殖培養基。將活化后的L.b- 1.1480按1%的接種量加入上述生長培養基，于37℃左右條件下的培養箱中培養24 h。

保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480增殖培養基正交試驗設計及數據處理見表8。

由表8極差R大小可知，影響菌液活菌數的主要因素主次順序為A＞C＞B＞D，即番茄汁添加量的增菌效果最顯著，其余因素的影響大小依次為綠豆芽汁、平菇汁和啤酒的添加量。通過對表8的直觀分析，可得出增殖因子的最優組合為A2B1C1D3。因此，確定增殖因子的最佳組合為7.5%番茄汁+ 2.5%平菇汁+ 1.0%綠豆芽汁+ 4.0%啤酒，以此作為增殖因子的添加量。

表8　保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480增殖培養基正交試驗設計及數據處理

3　結論

本試驗確定了保加利亞乳桿菌L.b- 1.1480 MRS優化培養基的主要營養組分為蔗糖、蛋白胨和ZnSO4，添加量分別為0.6%蔗糖，0.4%蛋白胨和0.08%ZnSO4。同時考察了增殖因子對保加利亞乳桿菌生長的影響，影響菌液活菌數的主要因素主次順序為A＞C＞B＞D，即番茄汁、綠豆芽汁、平菇汁和啤酒的添加量，L.b- 1.1480最佳增殖因子為7.5%番茄汁、2.5%平菇汁、1.0%綠豆芽汁和4.0%啤酒。同時，測定其最佳培養時間分別為16 h，保加利亞乳桿菌活菌數達到7.82×108CFU/mL，是基礎培養基的6.74倍，培養液的終點pH值為4.03，基本達到了保加利亞乳桿菌高密度培養的要求，為保加利亞乳桿菌產品的進一步開發提供了理論和實踐依據。

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Research on the Enhance of Lactobacillus bulgaricus Enrichment Culture Medium

WANG Yuenan
（School of Chemistry and Life Science，Anshan Normal University，Anshan，Liaoning 114007，China）

Abstract：Studies on the growth of Lactobacillus bulgaricus cultured in improving MRS and enrichment culture medium. Furthermore，the optimum enrichment medium of L.b- 1.1480 are screened by orthogonality test. The results show when adding fructose 0.6%，peptone 0.4%，ZnSO40.08%，the cell density of L.b- 1.1480 is 4.05×108CFU/mL. When adding tomato juice 7.5%，mushroom juice 2.5%，mungbean sprout juice 1.0%，beer 4.0%in improving MRS，the cell density of L.b- 1. 1480 is 6.74 times increased from 1.16×108CFU/mL to 7.82×108CFU/mL，and the destination pH is 4.03.

Key words：Lactobacillus bulgaricus；growth- stimulated substance；enrichment culture medium

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.05.003

文章編號：1671- 9646（2016）05a- 0007- 04

收稿日期：2016- 04- 22

作者簡介：王月囡（1981—），女，碩士，助教，研究方向為食品科學與食品生物技術。