EPHA2通過增強Akt/mTOR信號通路促進SGC-7901細胞的增殖

李國棟，王洋洋，劉玉河，李湘奇泰山醫學院附屬醫院普外科，山東 泰安271000

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EPHA2通過增強Akt/mTOR信號通路促進SGC-7901細胞的增殖

李國棟，王洋洋，劉玉河，李湘奇
泰山醫學院附屬醫院普外科，山東 泰安271000

［摘要］背景與目的：EPHA2能夠促進胃癌細胞中Cyclin D1的表達及胃癌細胞的細胞周期進程，從而增強胃癌細胞的增殖能力，但EPHA2調控胃癌細胞中Cyclin D1的表達及胃癌細胞的細胞周期進程的分子機制依然不明確。Akt/mTOR信號通路能夠通過促進胃癌細胞中Cyclin D1的表達及胃癌細胞的細胞周期進程增強胃癌細胞的增殖能力，且有研究表明EPHA2能夠激活Akt/mTOR信號通路。基于此，該研究探討了Akt/mTOR信號通路在EPHA2促胃癌細胞增殖中的作用。方法：采用蛋白［質］印跡法(Western blot）檢測過表達EPHA2和敲低EPHA2表達對SGC-7901細胞中Akt、mTOR和4EBP1磷酸化的影響。使用Akt抑制劑MK2206和mTOR抑制劑RAD001分別處理轉染空載體病毒的SGC-7901-NC細胞和過表達EPHA2的SGC-7901-EPHA2細胞，分別通過CCK8、流式細胞術和Western blot檢測細胞增殖、細胞周期及周期相關蛋白Cyclin D1的表達。結果：過表達EPHA2增強SGC-7901細胞中Akt、mTOR和4EBP1的磷酸化，敲低EPHA2的表達抑制SGC-7901細胞中Akt、mTOR和4EBP1的磷酸化。MK2206和RAD001處理細胞時，EPHA2過表達對SGC-7901細胞增殖、細胞S期和Cyclin D1表達的促進作用被顯著抑制。結論：EPHA2通過增強Akt/mTOR信號通路促進胃癌細胞SGC-7901的增殖能力，提示我們將來針對EPHA2高表達的胃癌患者或許可以采用Akt抑制劑和mTOR抑制劑予以個體化治療。

［關鍵詞］EPHA2；Akt/mTOR信號通路；胃癌；SGC-7901細胞

Correspondence to: LI Xiangqi E-mail: lxqaaa@aliyun.com

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內，胃癌的發病率在所有惡性腫瘤中位于第四位，致死率位于第三位［1］。我國胃癌發病率遠高于歐、美國家，占到全球新增病例的40%以上［2］。EPHA2是受體酪氨酸激酶EPH家族成員，其在膠質母細胞瘤、卵巢癌和膽管癌等多種腫瘤中高表達，且與腫瘤的惡性進展密切相關［3］。有研究發現，EPHA2 在77.3%胃癌患者的胃癌組織中高表達［4］，進一步的研究發現，敲低EPHA2的表達能夠抑制胃癌細胞的增殖和遷移［5］。最近的研究表明，EPHA2是通過增強Wnt/β-catenin信號通路促進上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)，進而促進胃癌細胞遷移［6］，且發現EPHA2能夠促進胃癌細胞中Cyclin D1的表達及胃癌細胞的細胞周期進程，從而增強胃癌細胞的增殖能力，但EPHA2調控胃癌細胞中Cyclin D1的表達及胃癌細胞的細胞周期進程的分子機制依然不明確。有研究發現，Akt/mTOR信號通路能夠通過促進胃癌細胞中Cyclin D1的表達及胃癌細胞的細胞周期增強胃癌細胞的增殖能力［7］，且有研究表明EPHA2能夠激活Akt/ mTOR信號通路［8］。基于此，本研究探討了Akt/mTOR信號通路在EPHA2促胃癌細胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

胃癌細胞株SGC-7901由本研究室保存。過表達EPHA2的慢病毒和攜帶EPHA2 shRNA的慢病毒為上海吉凱基因化學技術有限公司產品。Akt抑制劑MK2206和mTOR抑制劑RAD001為美國Selleck公司產品。EPAH2、Akt、pAkt-473、pAkt-308、mTOR、p-mTOR-2448、4EBP1、p4EBP1-65和Cyclin D1抗體均為美國Cell Signaling Technology公司產品。Tubulin抗體為美國Santa Cruz公司產品。

1.2 SGC-7901-EPHA2和SGC-7901-shEPHA2穩定細胞株的建立

SGC-7901細胞以5×105個/孔的密度接種到60 mm細胞培養皿中，24 h后，分別使用攜帶EPHA2基因的重組慢病毒顆粒（LV-EPHA2）和攜帶EPHA2 shRNA的重組慢病毒顆粒（LV-shEPHA2)及相應的空載體對照病毒(SGC-7901-NC、SGC-7901-shNC)感染SGC-7901細胞，48 h后加嘌呤霉素篩選，持續篩選至不再有細胞死亡為止。

1.3 蛋白［質］印跡法（Western blot）檢測

蛋白質提取后使用BSA法進行定量，取等量的蛋白質加入5×SDS后進行沸水浴5~10 min，上樣進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后進行半干轉膜，轉完后將膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后加入相應的一抗4 ℃溫育過夜，1×TBST洗膜3次后加入偶聯辣根過氧化物酶的二抗室溫溫育1 h，1×TBST洗膜3次后化學發光法顯色。采用Image J軟件對條帶進行灰度分析，對蛋白質表達水平進行相對定量分析。

1.4 CCK8 實驗

在96孔板中分別接種SGC-7901-NC和SGC-7901-EPHA2細胞，每孔2 000個細胞，24 h后分別用DMSO、MK2206（0.1 μmol/L）和RAD001（20 nmol/L）處理48 h。每孔加入15 μL CCK8溶液，37 ℃溫育1 h后，使用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（D）值。每個時間點平行做3個孔，實驗重復3次。數據用表示。

1.5 細胞周期檢測

SGC-7901-NC和SGC-7901-EPHA2細胞分別用DMSO、MK2206（0.1 μmol/L）和RAD001（20 nmol/L）處理48 h后收集細胞，PBS清洗2次后加入預冷的75%乙醇-20 ℃固定過夜。固定后的細胞用冰冷的PBS洗滌2次，加入100 μg/mL的RNA酶于37 ℃溫育30 min后加入50 μg/mL的PI室溫避光反應15 min，用流式細胞儀檢測。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 EPHA2基因過表達及沉默表達胃癌細胞株的建立

為了研究EPHA2促進胃癌細胞增殖的機制，我們首先通過慢病毒感染及嘌呤霉素篩選的方法建立了EPHA2基因持續過表達和沉默表達的胃癌細胞株。我們用攜帶EPHA2基因的重組慢病毒顆粒（LV-EPHA2）轉染SGC-7901細胞建立了過表達EPHA2的胃癌細胞株SGC-7901-EPHA2。Western blot檢測結果如圖1A。與未轉染的SGC-7901細胞相比，轉染空載體病毒的SGC-7901-NC細胞中EPHA2的表達沒有顯著變化，而轉染LV-EPHA2病毒的SGC-7901-EPHA2細胞中EPHA2的表達顯著升高。我們使用攜帶EPHA2 shRNA的重組慢病毒顆粒（LV-shEPHA2）感染SGC-7901細胞建立了EPHA2基因沉默表達的胃癌細胞株SGC-7901-shEPHA2。Western blot檢測結果如圖1B。與未轉染的SGC-7901細胞相比，轉染空載體病毒的SGC-7901-shNC細胞中EPHA2的表達沒有變化，而轉染LV-shEPHA2病毒的SGC-7901-shEPHA2細胞中EPHA2的表達顯著降低。

圖1　EPHA2過表達及沉默表達胃癌細胞株的建立Fig.1 Generation of SGC-7901 cell lines stably overexpressing EPHA2 or silencing EPHA2

2.2 EPHA2增強SGC-7901細胞中Akt/mTOR信號通路

Western blot檢測結果如圖2。EPHA2過表達能夠顯著促進Akt分子的磷酸化，同時顯著促進了mTOR分子及其下游分子4EBP1的磷酸化，說明過表達EPHA2能夠增強SGC-7901細胞中Akt/mTOR信號通路；而敲低EPHA2能夠顯著抑制Akt分子的磷酸化，同時顯著抑制了mTOR分子及其下游分子4EBP1的磷酸化，說明敲低EPHA2的表達能夠抑制SGC-7901細胞中Akt/ mTOR信號通路。

圖2　EPHA2增強SGC-7901細胞中Akt和mTOR的磷酸化Fig.2 EPHA2 promoted the phosphorylation of Akt and mTOR in SGC-7901 cells

2.3 EPHA2通過增強Akt/mTOR信號通路促進SGC-7901細胞的增殖

CCK-8檢測結果如圖3。在DMSO對照組中，EPHA2過表達顯著促進了SGC-7901的增殖(1.55±0.09 vs 1.00±0.04，P=0.001 6)；當用Akt抑制劑MK2206和mTOR抑制劑RAD001分別處理細胞時，EPHA2對SGC-7901細胞的增殖促進作用被顯著抑制(MK2206：0.65±0.03 vs 0.66±0.03，P=0.638 4；RAD001：0.76±0.04 vs 0.77±0.05，P=0.782 8)。這說明EPHA2通過增強Akt/mTOR信號通路促進了SGC-7901細胞的增殖。

圖3　MK2206和RAD001對SGC-7901-NC和SGC-7901-EPHA2細胞增殖的影響Fig.3 Effect of MK2206 and RAD001 on the proliferation of SGC-7901-NC and SGC-7901-EPHA2 cells

2.4 EPHA2通過增強Akt/mTOR信號通路促進SGC-7901細胞周期進程

細胞周期檢測結果如圖4。在DMSO對照組中，EPHA2過表達顯著促進了SGC-7901細胞中S期的比例［(28.51±1.07)% vs (37.41±1.31)%， P=0.001 7］；而當用MK2206和RAD001分別處理細胞時，EPHA2對SGC-7901 S期的促進作用卻被顯著抑制［(MK2206：(18.64±1.28)% vs (19.53±1.74)%，P=0.593 1；RAD001：(22.18±1.46)% vs (23.38±1.51)%，P=0.464 6］。這說明EPHA2能夠通過增強Akt/mTOR信號通路促進SGC-7901細胞周期進程。

2.5 EPHA2通過增強Akt/mTOR信號通路促進SGC-7901細胞中Cyclin D1的表達

Western blot檢測結果如圖5A。在DMSO對照組中，EPHA2過表達顯著促進了SGC-7901細胞中Cyclin D1的表達(1.00±0.07 vs 1.81±0.12，P=0.001 1)，而當用MK2206處理細胞時，EPHA2對SGC-7901中Cyclin D1的表達的促進作用被顯著抑制(0.51±0.08 vs 0.42±0.15，P=0.425 9)。在DMSO對照組中，EPHA2過表達顯著促進了SGC-7901細胞中Cyclin D1的表達(1.00±0.08 vs 1.73±0.11，P=0.001 7)；而當用RAD001處理細胞時，EPHA2對SGC-7901 中Cyclin D1的表達的促進作用卻被顯著抑制(0.55±0.08 vs 0.57±0.10，P=0.939 8，圖5B)。這說明EPHA2能夠通過增強Akt/mTOR信號通路促進SGC-7901細胞中Cyclin D1的表達，進而促進SGC-7901的細胞周期進程。

圖5　MK2206和RAD001對SGC-7901-NC和SGC-7901-EPHA2細胞中Cyclin D1蛋白表達的影響Fig.5 Effect of MK2206 and RAD001 on the expression of Cyclin D1 in SGC-7901-NC and SGC-7901-EPHA2 cells

3 討 論

EPHA2在胃癌細胞的增殖和遷移過程中發揮著重要的作用。有研究發現，EPHA2通過增強wnt/β-catenin信號通路促進EMT進而促進胃癌細胞遷移［6］，但是EPHA2促進胃癌細胞增殖的分子機制尚不明確。有研究發現，在胃癌組織中EGFR、PI3K和PTEN的突變均能使Akt 和mTOR的磷酸化程度增高［9］，且進一步的研究發現Akt和mTOR的磷酸化程度與胃癌的惡性程度呈正相關，而與患者的生存期呈負相關［10］，表明Akt/mTOR信號通路在胃癌的惡性進展中發揮著重要的作用。有研究發現，Akt/ mTOR信號通路能夠通過多種機制促進胃癌細胞的增殖：mTOR激酶通過磷酸化4EBP1增強胃癌細胞中的帽依賴性翻譯進而促進Cyclin D1蛋白的翻譯和細胞周期進程，從而增強胃癌細胞的增殖能力［11］；Akt/mTOR信號通路能夠促進HIF-1α的表達進而增強胃癌細胞中VEGF信號通路轉導從而促進胃癌細胞的增殖［12-13］。

為了探索Akt/mTOR信號通路在EPHA2促進胃癌細胞增殖中的作用，我們建立了穩定過表達EPHA2的胃癌細胞株SGC-7901-EPHA2和穩定敲低EPHA2表達的胃癌細胞株SGC-7901-shEPHA2，然后進行Western blot檢測。結果發現，過表達EPHA2能夠顯著促進Akt、mTOR 和4EBP1的磷酸化，敲低EPHA2能夠顯著抑制Akt、mTOR和4EBP1的磷酸化，說明EPHA2增強SGC-7901細胞中Akt/mTOR信號通路。隨后，我們使用MK2206和RAD001處理細胞，阻斷Akt/mTOR信號通路。發現EPHA2對SGC-7901細胞增殖和細胞周期的促進作用被顯著抑制，說明EPHA2通過增強Akt/mTOR信號通路促進SGC-7901細胞的增殖和細胞周期進程。CyclinD1在腫瘤細胞周期調控中發揮著重要的作用［14］，且其表達受Akt/mTOR信號通路調控，我們發現了抑制Akt/mTOR信號通路能夠拮抗EPHA2對SGC-7901中Cyclin D1表達的促進作用，說明EPHA2能夠通過增強Akt/mTOR信號通路促進SGC-7901細胞中Cyclin D1的表達，進而促進SGC-7901的細胞周期進程。

EPHA2通過增強Akt/mTOR信號通路促進腫瘤惡性進展已經在多種腫瘤中報道。在膽管癌中，過表達EPHA2增強Akt/mTOR信號通路，進而促進CHO-CK細胞的體外增殖能力和體內成瘤能力［15］；在乳腺癌中，磷酸化的EPHA2能夠通過PI3K激活Akt參與曲妥珠單抗耐藥［16］；在宮頸癌中，EPHA2以RhoG依賴的方式激活Akt促進HeLa細胞的存活［17］。此外，Akt也可以反向通過調控EPHA2的磷酸化促進腫瘤細胞的惡性增殖。研究表明，Akt通過增強EPHA2第897位絲氨酸的磷酸化促進膠質瘤細胞和前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力［18］。

總之，本研究結果顯示，EPHA2通過增強Akt/mTOR信號通路促進胃癌細胞的增殖，提示我們將來針對EPHA2高表達的胃癌患者可以采用Akt抑制劑和mTOR抑制劑予以個體化治療。

［參 考 文 獻］

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EPHA2 promotes SGC-7901 cell proliferation through enhancing Akt/mTOR signaling pathway

LI Guodong， WANG Yangyang， LIU Yuhe， LI Xiangqi （Department of General Surgery， Affiliated Hospital of Taishan Medical University， Taian 271000， Shandong Province， China）

［Key words］EPHA2； Akt/mTOR signaling pathway； Gastric cancer； SGC-7901 cell

［Abstract］Background and purpose: EPHA2 has been reported to enhance the proliferation of gastric cancer cells through promoting CyclinD1 expression and cell cycle progression.However， the underlying mechanism that EPHA2 promotes CyclinD1 expression and cell cycle progression is still poorly understood.Akt/mTOR signaling pathway has been reported to enhance the proliferation of gastric cancer cells by promoting CyclinD1 expression and cell cycle progression， and some studies have shown that EPHA2 can activate Akt/mTOR signaling pathway.Based on this， this study investigated whether EPHA2 promoted gastric cancer SGC-7901 cell proliferation through enhancing Akt/mTOR signaling pathway.Methods: Western blot was used to determine the effect of EPHA2 overexpression or knockdown on the phosphorylation of Akt and mTOR in SGC-7901 cells.SGC-7901-NC infected with control lentivirus and SGC-7901-EPHA2 cells with EPHA2 overexpression were treated with DMSO， MK2206 （an Akt inhibitor） and RAD001 （a mTOR inhibitor） for different time periods， respectively.Cell proliferation was detected using the CCK8 assay.Cell cycle was detected using flow cytometry， and the expression of CyclinD1 was determined by Western blot.Results: Overexpression of EPHA2 enhanced Akt/mTOR signaling pathway in SGC-7901 cells， and silencing EPHA2 in SGC-7901 cells inhibited Akt/mTOR signaling pathway.MK2206 and RAD001 antagonized the promoting effect of EPHA2 on the proliferation， S-phase and CyclinD1 expression of SGC-7901 cells， respectively.Conclusion: EPHA2 promotes SGC-7901 cell proliferation through enhancing Akt/mTOR signaling pathway.Akt inhibitor or mTOR inhibi-tor could be an effective treatment strategy for gastric cancer patients overexpressing EPHA2.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.02.002

中圖分類號：R735.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639(2016)02-0128-06

基金項目：山東省自然科學基金（ZR2013HM038）。

通信作者：李湘奇 E-mail：lxqaaa@aliyun.com

收稿日期：（2015-09-08 修回日期：2015-12-10）