節律基因Clock對膠質瘤C6細胞增殖的影響*

楊振華　李小雪　王正榮　楊淑紅　江舟　成姝婷　劉延友　汪宇輝　肖靜

(四川大學華西基礎醫學與法醫學院·衛生部時間生物學重點實驗室， 四川 成都 610041)

·論著·

節律基因Clock對膠質瘤C6細胞增殖的影響*

楊振華李小雪王正榮楊淑紅江舟成姝婷劉延友汪宇輝肖靜

(四川大學華西基礎醫學與法醫學院·衛生部時間生物學重點實驗室， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探討節律基因Clock對膠質瘤C6細胞增殖的影響及其機制。方法通過小片段干擾 RNA(small interfering，siRNA)特異性沉默C6細胞Clock基因的表達。 采用 CCK-8試劑盒檢測C6細胞的增殖情況，并利用流式細胞儀檢測Clock基因沉默后C6細胞的細胞周期分布，通過熒光定量Q-PCR檢測β-catenin和Tcf1 mRNA的表達水平。結果與空白對照組和陰性對照組相比，SiClock轉染組C6細胞增殖活力明顯降低，S期細胞所占比例明顯下降，同時β-catenin和Tcf1 mRNA的表達也明顯降低(均P<0.05)。結論干擾節律基因Clock表達，能夠抑制膠質瘤細胞的生長。其機制可能是通過Wnt/β-catenin信號通路調節其作用。

【關鍵詞】節律基因；Clock；C6；增殖

近日節律是一種基本的生命活動現象。從單細胞生物到哺乳動物都存在這一活動現象[1]。近日節律基因不僅在節律的產生中發揮重要作用，而且還參與其他機體生理和病理過程[2]。早期對夜班工人的研究表明，節律紊亂與腫瘤的發生密切相關。如肺癌[3]、膠質瘤[4]、皮膚癌[5]、前列腺癌[6]和胃癌[7]等。有很多基因調控人類的晝夜節律，如：Clock、Bmal1、Period1(PER1)、Period2(PER2)、Period3(PER3)、Cryptochrome1 (CRY1)、Cryptochrome2 (CRY2)、Caseinkinase1e(CK1e)和Timeles(TIM)等[8]。Clock基因是節律調控通路中最核心的調控元件[9]，在腫瘤的生長中發揮重要作用。Miller等人研究表明，Clock突變后能明顯抑制細胞生長和增殖[10]。最近有研究表明，E2-Erα通路誘導Clock基因表達促進乳腺癌細胞的增殖[11]。

Wnt/β-catenin信號通路是一條在生物進化中極為保守的通路，它調節轉錄輔助因子β-catenin的穩定性并依賴β-catenin基因的表達[12]。該通路由Wnt家族分泌蛋白(Wnt)、特異性受體卷曲蛋白(Frizzled，Friz)、原癌基因β連環蛋白(β-catenin，β-cat)、TCF(T cell factor)/LEF(lymphoid enhancer factor)家族轉錄調節因子和其他組分組成。β-catenin和TCF/LEF是Wnt/β-catenin信號通路重要的調節因子。有文獻表明，Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的生長發育密切相關[13-15]。本實驗擬通過小片段干擾 RNA(small interfering，siRNA)特異性沉默膠質瘤C6細胞Clock基因的表達，以此探討Clock基因的沉默效應對腫瘤細胞增殖的影響，并對其機制作進一步研究，為腫瘤的基因治療提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 C6細胞為本實驗室保存。

1.1.2主要試劑DMEM培養基、Opti-MEMI培養液、胎牛血清(美國，HyClone)，LipofectamineTM2000細胞轉染試劑、Trizol 試劑(美國，Inxitrogen)，青霉素、鏈霉素混合液、0.25% 胰酶混合液(美國，Hyclone)，細胞培養皿(美國，Corning)，DMSO、DEPC(美國，Sigma)，2×All in oneTM Q-PCR Mix(美國，Invitrogen)，HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(北京，康為世紀)，SiClock(廣州，銳博生物)，其它試劑為國產分析純。

1.1.3主要儀器倒置生物顯微鏡TE 2000-U(日本，Nikon)，CO2恒溫細胞孵箱(日本，SANYO)，熒光PCR儀(美國，Bio-Rad)，低溫離心機(德國，Eppendorf)，微量移液器(德國，Eppendorf)，流式細胞儀(美國，BD)，超凈細胞工作臺、超純水儀、電子天平等均為國產。

1.1.4引物序列引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見表1。

表1　引物序列

1.2方法

1.2.1細胞培養C6細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養，5%CO2濃度，37℃培養箱培養。

1.2.2細胞轉染在6孔板培養的 C6細胞密度長到60%左右時用LipofectamineTM 2000細胞轉染試劑把SiClock轉染到細胞中。將轉染后的細胞放置在37℃的 CO2孵箱中孵育24小時后，提取RNA。細胞分組為SiClock組(SC)、陰性對照組(NC)和空白對照組(CT)，每組都設3個復孔。

1.2.3CCK-8測試在96孔板培養的 C6細胞。細胞轉染24～72h后(從24小時開始檢測，間隔12小 時)，加入CCK-8試劑，10μl/孔，設6復孔，37℃的 CO2孵箱中孵育4小時，用酶標儀在450nm處測定吸光度。

1.2.4RNA提取與cDNA的合成用胰酶消化細胞，離心收集細胞，加Trizol試劑冰上裂解細胞，提取RNA。用Nanodrop檢測RNA的濃度和純度。分別取2μg RNA，逆轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。

1.2.5熒光定量PCR使用2×All in oneTM Q-PCR Mix擴增目的基因。Q-PCR程序：95℃，10min；95℃，10s，60℃，20s，72℃，20s，39個循環；95℃，10s；65～95℃,5s。

1.2.6流式細胞術檢測細胞周期將轉染后36小時的各組細胞制成單細胞懸液，2000rpm、5分鐘離心收集細胞。PBS洗滌后，75 % 乙醇-20 ℃固定過夜。用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

2結果

2.1Clock基因mRNA的表達利用RNAi干擾C6細胞Clock基因的表達。提取SiClock轉染組(SC)、陰性對照組(NC)和空白對照組(CT)C6細胞總RNA，逆轉錄為cDNA。利用熒光定量PCR檢測各組C6細胞Clock的表達量。結果顯示，SC組Clock基因mRNA的相對表值為0.62±0.18，NC組、CT組Clock基因mRNA的相對表達值為1.60±0.28和1.87±0.34，見圖1。與NC組和CT組相比，SC組C6細胞Clock基因mRNA的表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1C6細胞Clock基因mRNA的表達水平

Figure 1The mRNA expression level of Clock gene in C6 cells

2.2CCK-8測試結果使用CCK-8試劑盒檢測Clock基因沉默后C6細胞的增殖活力，結果見表2、圖2。與NC組和CT組相比，SC組C6細胞的增殖受到明顯抑制，組間差異有統計學意義(P<0.05)。

表2　C6細胞活性測定

注：與CT組和NC組相比，①P<0.05

2.3流式細胞術檢測細胞周期變化結果使用流式細胞儀檢測各組細胞周期分布。結果顯示，處于S期C6細胞在總體中占的比例，SC組為(21.36±1.44)%，NC組為(26.25±1.36)%，CT組為(27.67±1.03)%，見圖3。與NC組和CT組相比，SC組S期細胞所占比例明顯降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

圖2CCK-8法測定C6細胞活性

Figure 2Cell viability of C6 cell at different time

圖3流式細胞術檢測C6細胞周期

Figure 3Flow cytometric analysis of cell cycle in C6 cells

注：a. CT組，b. NC組，c. SC組

2.4β-catenin基因mRNA的表達利用RNAi干擾C6細胞Clock基因的表達。探討Clock基因沉默后對β-catenin基因表達的影響。利用熒光定量PCR檢測各組C6細胞β-catenin的表達量。結果顯示，SC組β-catenin基因mRNA的相對表達值為0.68±0.18，NC組、CT組β-catenin基因mRNA的相對表達值為0.98±0.22和1.10±0.16，見圖4。與NC組和CT組相比，SC組C6細胞β-catenin基因mRNA的表達顯著降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

2.5Tcf1基因mRNA的表達利用RNAi干擾C6細胞Clock基因的表達。探討Clock基因沉默后對Tcf1基因表達的影響。利用熒光定量PCR檢測各組C6細胞Tcf1的表達量。結果顯示，SC組Tcf1基因mRNA的相對表達值為0.44±0.03，NC組CT組Tcf1基因mRNA的相對表達值為0.95±0.15和1.02±0.09，見圖5。與NC組和CT組相比，SC組C6細胞Tcf1基因mRNA的表達顯著降低，差異均有統計學意義(均P<0.001)。

圖4C6細胞β-catenin mRNA的表達

Figure 4The mRNA expression level ofβ-cateningene in C6 cells

圖5C6細胞Tcf1 mRNA的表達

Figure 5The mRNA expression level ofTcf1 gene in C6 cells

3討論

近日節律調控機體各個系統的功能，對機體各個系統之間、機體與環境之間的和諧穩定起著重要作用，其產生機制是一系列近日鐘基因的轉錄和轉錄后調控所產生的分子振蕩。當外界因素擾亂了機體正常的近日節律，可能引發機體一系列的疾病，甚至導致癌癥的發生。大量的研究表明，近日節律紊亂和癌癥發生密切相關[16]。近日鐘基因可以調控原癌基因和抑癌基因以及轉錄因子的表達，直接或者間接的調節細胞增殖和凋亡，在腫瘤的發生和發展方面起著重要的作用[17]。Clock基因是近日節律的核心基因，參與調節機體多種生理生化活動，包括癌細胞的增殖過程[11]。大量研究發現，膠質瘤的生長與近日節律密切相關[4, 18,19]。陳曉魏等[20]人研究表明，Clock基因在高級別腦膠質瘤組織中呈現高表達，其表達強度與腦膠質瘤的惡性程度呈正相關。本實驗利用siRNAClock基因后，利用CCK-8檢測細胞的活性，利用流式細胞儀檢測細胞周期分布，發現沉默Clock基因會顯著性地抑制C6細胞的活性，降低了S期細胞所占比例，說明Clock基因參與C6細胞的增殖過程。

Wnt/β-catenin信號通路調節機體的各種生理活動，包括細胞增殖、分化、遷移和分裂，在生物進化中極為保守[21]。研究發現，Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤的生長發育中也發揮著重要作用[22,23]。β-catenin和TCF/LEF是Wnt/β-catenin信號通路最重要的調節因子。β-catenin由Ctnnb1基因產生，是Armadillo蛋白家族成員的一個亞型，主要功能是介導細胞間黏附。 β-catenin在核內的聚集及功能的激活與腫瘤的發生密切相關。GSK-3β以及CK1A可以使 -catenin 的絲氨酸/蘇氨酸位點磷酸化，導致β-catenin降解復合物被泛素連接酶識別并泛素化，最終被蛋白酶體降解，從而使細胞內β-catenin含量保持在較低水平，維持細胞的正常生長。當β-catenin在細胞質中濃度不斷增加時，就會轉入細胞核，與TCF/LEF結合，啟動下游基因如原癌基因cyclinD1的轉錄，使細胞過度增殖，導致腫瘤發生。本研究發現，Clock基因沉默會顯著降低C6細胞的活性，抑制細胞增殖。RT-qPCR檢測β-catenin和Tcf1的表達水平，發現Clock基因沉默組表達水平顯著降低，提示Clock基因可能通過調節Wnt/β-catenin通路中β-catenin和Tcf1的表達來調節C6細胞增殖。Clock基因參與調控C6細胞增殖的具體分子機制還需要進一步研究。

4結論

本實驗研究發現，干擾Clock基因表達，會使β-catenin和Tcf1的表達水平降低，并且會抑制C6細胞的增殖，推測Clock基因可能通過Wnt/β-catenin信號通路參與調控細胞的增殖過程。揭示近日節律系統參與調控癌細胞增殖過程，為腫瘤的預防和治療提供了一個新的研究思路和理論基礎。

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Proliferation effect of circadian gene Clock on glioma cells

YANG Zhenhua, LI Xiaoxue, WANG Zhengrong, et al

(KeyLaboratoryofChronobiology,MinistryofHealth(SichuanUniversity),WestChinaSchoolofPreclinicalandForensicMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of circadian gene Clock on glioma C6 cells and its mechanism. Methods The expression level of Clock gene in C6 cells were specifically knocked down by RNA interference. The effect of C6 cells on cell growth and proliferation was demonstrated with CCK-8 assay. The cell distribution in cell cycle was detected by flow cytometry. The expression of β-catenin and Tcf1 were detected by Q-PCR. ResultsCompared with the blank control group and the negative control group, the cells transfected with SiClock had the lower rate of cellular proliferative capacity. Meanwhile, the proportion of S phase cells decreased obviously. The mRNA expression of β-catenin and Tcf1 were significantly reduced. ConclusionClock gene knocked down inhibited the proliferation of glioma cell,which mechanism might involve the Wnt/β-catenin signaling pathway.

【Key words】Circadian genes; Clock; C6; proliferation

基金項目：國家自然科學基金(31371180)，國家自然科學青年基金(31500935)

通訊作者：王正榮，教授，本刊常務編委，主要從事時間生物學研究，Email：wangzhengrong@126.com

【中圖分類號】R-33;R 739.41

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.003

(收稿日期：2016-01-19； 編輯： 母存培)