骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)液對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護*

林珊珊　朱波　付高勇

(宜賓市第一人民醫(yī)院　1. 康復醫(yī)學科，2. 血管外科，四川 宜賓 644000)

·論著·

骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)液對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護*

林珊珊1朱波2付高勇1

(宜賓市第一人民醫(yī)院1. 康復醫(yī)學科，2. 血管外科，四川 宜賓 644000)

【摘要】目的探討骨髓間充質干細胞(BMSC)條件培養(yǎng)液 (CM)對氧化應激損傷神經(jīng)細胞的保護作用。方法采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁法分離SD大鼠BMSC，采用流式細胞術，成骨、成脂誘導分化鑒定BMSC，提取骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)液。制作過氧化氫損傷PC12細胞模型，實驗分為對照組、H2O2損傷組以及共培養(yǎng)組。MTT檢測BMSC-CM對損傷PC12細胞活性的影響，流式細胞術檢測各組凋亡率的變化，免疫印跡法分別檢測硫氧還蛋白(Trx)、B淋巴細胞瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相關X蛋白(Bax)水平的變化。結果分離提取的BMSC高表達CD29，CD44，不表達CD31，CD45。BMSC-CM能提高H2O2損傷PCI2細胞的活力，使細胞凋亡率下降，Trx和Bcl-2的蛋白量增加，Bax蛋白水平下降。結論BMSC-CM通過提高受損細胞內Trx、Bcl-2水平，降低Bax蛋白水平，一定程度上抑制了過氧化氫致PC12細胞氧化應激和凋亡。

【關鍵詞】骨髓間充質干細胞；條件培養(yǎng)液；過氧化氫；PC12細胞；氧化應激

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是一類慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病的總稱，包括阿爾茨海默病(AD)、小腦萎縮癥、肌萎縮側索硬化癥(ALS)、帕金森氏病(PD)、多發(fā)性硬化(MS)、亨廷頓病(HD)等，此類疾病的病因及其機制目前尚未完全闡明。但近年研究表明，氧化應激損傷在阿爾茨海默病及多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用，可導致神經(jīng)元胞膜的破壞、通透性增加，進而引起Ca2+大量涌入胞內，激活細胞內鈣依賴性激酶、促進自由基的產(chǎn)生，造成生物分子物質氧化損傷，最終導致細胞損傷甚或死亡[1]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NGF、BDNF、bFGF等神經(jīng)營養(yǎng)和保護因子可通過不同的機制起著神經(jīng)保護的作用，減少神經(jīng)細胞的凋亡，促進神經(jīng)組織與細胞損傷修復及功能改善[2-4]。近年研究證實間充質干細胞移植可促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的損傷修復以及功能的改善[5-8]。但骨髓間充質干細胞移植人體后，由于多種不利因素的影響，細胞很快發(fā)生死亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞發(fā)揮治療作用更有可能與其分泌的細胞因子有關[9, 10]。本實驗通過體外培養(yǎng)、純化BMSCs并收集其條件培養(yǎng)液，觀察BMSCs分泌物對過氧化氫誘導的PCI2細胞損傷的保護作用。可為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療提供新的解決方案。

1材料和方法

1.1主要材料PC12細胞由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所提供。2周齡SD大鼠(雌雄不限)，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，F(xiàn)icoll-hypague(天津血液學研究所提供)，馬血清(Gibco公司)，胎牛血清(HyClone公司)， MTT (Sigma公司)，地塞米松、1-甲基-3異丁基-黃嘌呤和吲哚美辛(美國Sigma 公司)，β-甘油磷酸鈉鹽和維生素C (美國Fluka 公司)抗鼠CD29、CD31、CD44、CD45抗體(PharMingen公司)，Bcl-2、Bax抗體、兔抗Trx (美國Cell Signaling公司)、GAPDH小鼠抗大鼠多克隆抗體、兔抗小鼠抗體、羊抗兔抗體(英國Abcam公司) 、凱基AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物)。

1.2BMSCs分離與培養(yǎng)SD大鼠脫臼處死，75%酒精浸泡5min，無菌條件下取出大鼠脛骨和股骨，用含10%血清的 a-MEM 培養(yǎng)基沖洗髓腔，采用密度梯度離心法分離獲取單個核細胞，接種于含 10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液中，接種密度為1×106cells/cm2，將細胞置于5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)，48h后半量換液，4d后全量換液以去除未貼壁細胞，以后每2天換液一次。待細胞克隆團生長至80～90%融合時，用0.05%胰蛋白酶消化后進行傳代培養(yǎng)。

第三代 BMSCs生長融合至 70～80%，PBS洗滌兩遍后用 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置體積分數(shù) 1%O2、5%CO2、94% N2孵箱條件培養(yǎng)，培養(yǎng) 12h 后收上清，2 000 r/min 離心 10 min 棄去細胞碎片，將獲取的 BMSCs 條件培養(yǎng)基-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3骨髓間充質干細胞鑒定收獲大鼠BMSCs，PBS洗滌2次后，每管5×105個細胞，分別加入FITC/PE標記的抗鼠單克隆抗體CD29、CD31、CD44、CD45，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌兩次，將洗滌后的細胞懸于300μL PBS 中，應用流式細胞儀收集數(shù)據(jù)(BD公司FACSCALIBUR型)，WinMDI2.9軟件分析結果。

體外誘導分化實驗時，將細胞按2×104/孔接種于24孔板中，待細胞60～70%融合時，加入成脂誘導培養(yǎng)液(含胎牛血清10%，1-甲基-3異丁基-黃嘌呤0.5μM，地塞米松10-6M，吲哚美辛10-4M，胰島素10ng/ml)和成骨誘導培養(yǎng)液(含胎牛血清10%，地塞米松10-7M，維生素C 50 μM，β甘油磷酸鈉10 mM)，每3天更換一次。約2周后，分別使用油紅O和堿性磷酸酶染色，以鑒定成脂肪細胞和成骨細胞。

1.4PC12細胞培養(yǎng)及H2O2損傷模型的建立PCI2細胞用含有5%胎牛血清、10%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞增殖至80%時進行傳代接種。實驗前將培養(yǎng)液更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，以終止血清對實驗的影響。12h后再次換液，加入含有終濃度為200μmmol/L H2O2的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)0，6h，12h，24h，加入 20 μL MTT，繼續(xù)孵育 4 h，棄去上清，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μL 溶解結晶。用全自動酶標儀檢測波長為490 nm 時的吸光度 A 值。每組均設 6 個副孔，取平均值計算細胞的抑制率。觀察H2O2作用不同時間對PC12細胞活性的影響，建立損傷模型。

1.5BMSC-CM 對H2O2損傷PC12細胞保護作用將正常培養(yǎng)的PC12細胞進行傳代接種，實驗分為正常培養(yǎng)組 (DMEM)、模型組 (DMEM+0.2 mmol/L H2O2)、MSC-CM 組(MSC-CM+0.2 mmol/L H2O2)，每組6個副孔。正常培養(yǎng) 2 d，無血清培養(yǎng) 12 h 后，換各組培養(yǎng)液作用12h，MTT檢測各組細胞活性。收集各組細胞，AnnexinV-PI 凋亡試劑盒說明檢測凋亡率。

1.6免疫印跡分析將各組培養(yǎng)瓶中細胞吸去培養(yǎng)基，用預冷的D-Hank′s液洗3遍，RIPA裂解細胞，提取總蛋白，BCA法測蛋白質濃度，取40μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳。電轉法將蛋白質轉移到NC膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉2h。兔抗Trx，鼠抗Bcl-2抗體、Bax抗體或GAPDH抗體4℃孵育過夜。經(jīng)洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的抗兔或抗小鼠二抗，室溫反應2 h，化學發(fā)光法(ECL)顯示結果，并曝光于膠片上。

2統(tǒng)計學分析

3結果

3.1BMSCs培養(yǎng)與鑒定分離培養(yǎng)的BMSC流式細胞檢測結果顯示高表達CD29，CD44，不表達或低表達CD31，CD45(圖1A)。實驗結果表明，所獲取的BMSC得到高度純化。通過誘導可以分化脂肪細胞(圖1B)成骨細胞(圖1C)。符合國際干細胞協(xié)會關于間充質干細胞的鑒定標準。

圖1BMSC鑒定。圖A：流式細胞術鑒定結果；圖B：BMSC成脂分化；圖C：BMSC成骨分化

Figure 1Identification of BMSCs

3.2H2O2對PC12細胞活性的影響將終濃度為200μmmol/LH2O2作用于PC12細胞0，6，12，24h后，采用MTT法檢測H2O2對細胞活性的影響。結果表明，隨著作用時間的增加，PC12細胞活性逐漸下降，各組細胞活性分別為100.00±1.98%(Con)，89.53±4.67%(6h)，74.26±3.19%(12h)，65.68±4.09%(24h)。培養(yǎng)12h和24h后，H2O2損傷組與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05 vs. Con)，見圖2。

圖2H2O2作用不同時間后對 PC12細胞活性的影響

Figure 2Effects of H2O2on the cell viability of PC12 cells

3.3BMSC-CM對損傷細胞活性的影響MTT結果表明，與對照組相比，H2O2組細胞活性顯著降低(P<0.05)，共培養(yǎng)組細胞活性與H2O2組相比顯著增加，各組細胞活性分別為100.00±1.59%(Con)，73.09±5.13%(H2O2)，87.91±5.29%(H2O2+CM)。實驗結果具有統(tǒng)計學差異(P<0.05 vs. control;P<0.05 vs. H2O2)，見圖3 。

圖3BMSC-CM對H2O2損傷細胞的保護作用

Figure 3Effects of BMSC-CM on cell viability of H2O2-injured PC12 cells

3.4BMSC-CM對PC12細胞凋亡率的影響流式細胞檢測結果表明，與對照組相比，H2O2組細胞凋亡率增加(P<0.05)。BMSC-CM共培養(yǎng)組細胞凋亡率與損傷組相比，差異具有統(tǒng)計學意義，各組細胞凋亡率分別為3.52±1.79%(Con)，30.47±4.38%(H2O2)，19.58±3.81%(H2O2+CM)(P<0.05 vs. Control;P<0.05 vs. H2O2)，見圖4。

圖4BMSC-CM影響PC12細胞凋亡的結果分析

Figure 4Protection of BMSC-CM against apoptosis of PC12 cells

3.5BMSC-CM對Trx、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響免疫印跡結果顯示，與對照組相比，共培養(yǎng)組PCI2細胞內Bcl-2和Trx蛋白兩者均升高，Bax蛋白水平有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖5BMSC-CM對損傷PC12細胞Trx、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

Figure 5Western blot analysis of the effects of BMSC-CM on Trx, Bax and Bcl-2 levels in PC12 cells

4討論

氧化應激在多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有中心調節(jié)作用，是神經(jīng)退行性疾病中引起細胞損傷的一個主要原因。氧化應激可以引起細胞成分的破壞，繼而導致神經(jīng)細胞損傷、凋亡或者壞死[1,11]。H2O2是一類活性氧，可以與胞膜及胞內物質反應生成活性更強的氧自由基，造成細胞損傷，因而，在氧化應激損傷的體外研究中，H2O2被廣泛用作氧化應激的誘導劑[12]。PC12細胞，為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株，由于其具有類似神經(jīng)細胞的特性，而被廣泛應用于體外神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型[13]。

作為一種新興的細胞學治療方法，干細胞移植在基礎與臨床實驗中已證實對組織損傷及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病具有治療作用，但具體機制并未完全清楚。近來研究表明，移植入體內的BMSCs，由于缺血缺氧、PH、炎癥以及凋亡因子等惡劣移植環(huán)境的影響，在短期內即發(fā)生大量死亡，因此，移植細胞多向分化、替代損傷學說受到質疑[9]。現(xiàn)普遍認為BMSCs 的旁分泌作用可能是發(fā)揮損傷修復作用的主要機制[9, 14]。研究發(fā)現(xiàn)間充質干細胞條件培養(yǎng)基中含有多種與神經(jīng)營養(yǎng)、組織修復、血管生成及抗凋亡等作用相關的生物活性物質，具有促進細胞的增殖、分化，抑制細胞的凋亡和壞死，提高細胞生存的作用[15,16]。

我們利用200μmmol/L H2O2作用于PC12細胞不同時間，觀察其對細胞活性的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2作用時間的增加，PC12細胞的活性有所下降，結果說明H2O2誘導PC12細胞的損傷與凋亡。根據(jù)實驗結果，我們選用200μmmol/L H2O2作用12h作為損傷模型組。通過進一步實驗發(fā)現(xiàn)，與損傷組相比，BMSC-CM與H2O2損傷細胞共培養(yǎng)后，可顯著提高損傷細胞的活性，降低細胞凋亡率。提示骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)液可明顯減輕H2O2對PC12細胞的損傷及凋亡誘導作用。

Trx是一類多功能蛋白，缺氧/復氧能誘導其產(chǎn)生，從而保護各類氧化應激損傷的細胞，此外Trx還能促進細胞的生長，抑制其凋亡并調節(jié)各種炎癥反應。Trx對維持體內的氧化還原狀態(tài)有重要的作用，通過結合抑制凋亡信號途徑的多種激酶而起到抗凋亡作用[17]。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的重要調控因子，其家族成員可分為抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-XL，以及促凋亡蛋白如Bax、Bad等[18]。兩類蛋白相互作用發(fā)揮對凋亡的調控作用，二者之間的比率失調，便會影響細胞的活性或凋亡。本研究中，BMSC-CM與H2O2損傷PC12細胞共培養(yǎng)后，Trx和Bcl-2蛋白水平較損傷組增加，而Bax蛋白表達水平較損傷組下降。實驗結果提示，BMSC-CM可能通過上調Trx蛋白發(fā)揮對H2O2誘導的PCI2細胞的抗氧化和抗凋亡作用。而Trx的抗凋亡作用可能與上調Bcl-2蛋白水平有關，有待進一步研究。

5結論

氧化應激是引起神經(jīng)細胞損傷、凋亡或者壞死的重要原因之一。本研究通過將BMSC-CM與H2O2損傷PCI2細胞共培養(yǎng)，一定程度上證實了BMSC-CM通過提高受損細胞內Trx、Bcl-2水平，降低Bax蛋白水平發(fā)揮抗氧化應激和凋亡的作用。為進一步研究BMSC-CM抗氧化及凋亡的作用提供了一定的實驗基礎及理論依據(jù)。

【參考文獻】

[1]阿部康三. 氧化應激與神經(jīng)系統(tǒng)疾病[J]. 日本醫(yī)學介紹, 2006, 12(27): 556-557.

[2]郝飛, 梁戰(zhàn)華, 李愛萍, 等. 骨髓間充質干細胞應用于多發(fā)性硬化的基礎及臨床研究進展[J]. 中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志, 2014, 02(21): 134-137.

[3]羅雪丹, 徐冰, 周進, 等．骨髓間充質干細胞分泌物對淀粉樣β蛋白1～40損傷PC12細胞的神經(jīng)保護作用[J]．中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(40):7937-7941.

[4]潘曉華, 劉國榮, 姜長春. 骨髓間充質干細胞治療缺血性腦血管病的研究進展[J]. 內蒙古醫(yī)學雜志, 2010, 09(42): 1086-1090.

[5]Egashira Y，Sou S，Yukiya S,etal．The conditioned medium of murine and human adipose-derived stem cells exerts neuroprotective effcts against experimental stroke model． Brain Res, 2012; 1461(21): 87-95．

[6]劉靜, 韓冬梅, 丁麗, 等. 臍帶間充質干細胞鞘內注射治療脊髓小腦性共濟失調[J].中國組織工程研究, 2014; 41: 6666-6670.

[7]Cho YJ, Song HS, Bhang S,etal. Therapeutic effects of human adipose stem cell-conditioned medium on stroke[J]. J Neurosci Res, 2012(90):1794-1802.

[8]Zheng W, Honmou O, Miyata K,etal.Therapeutic benefits of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow after global cerebral ischemia[J]. Brain Res, 2010; 1310:8-16.

[9]郭子寬. 間充質干細胞及其臨床應用中的幾個問題[J]. 中國組織工程研究, 2012; 01(16): 1-10.

[10] Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS,etal. Marrow-derived stromal cells express genes encoding abroad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms[J].Circ Res, 2004; 94(5):678-685.

[11] Zhang L, Bahety P, Ee PL. Wnt co-receptor LRP5/6 overexpression confers protection against hydrogen peroxide-induced neurotoxicity and reduces tau phosphorylation in SH-SY5Y cells. Neurochem Int, 2015,87*9):13-21.

[12] 謝振華, 劉長振, 王愛民, 等. 過氧化氫對PC12細胞中硫氧還蛋白和APE/Ref-1基因表達的影響[J]. 中國老年學雜志, 2007, 2(27): 247-249.

[13] Westerink R, Ewing A. The PC12 cell as model for neurosecretion. Acta Physiol (Oxf), 2008,192(2):273-285.

[14] Boomsma RA, Geenen DL. Mesenchymal stem cells secrete multiple cytokines that promote angiogenesis and have contrasting effects on chemotaxis and apoptosis[J]. PLoS ONE, 2012; 7e:35685.

[15] Chen L, Xu Y, Zhao J,etal. Conditioned medium from hypoxic bone marrow-derived mesenchymal stem cells enhances wound healing in mice[J]. PLoS One, 2014,29;9(4):e96161.

[16] Cantinieaux D, Quertainmont R, Blacher S,etal. Conditioned medium from bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves recovery after spinal cord injury in rats: an original strategy to avoid cell transplantation[J]. PLoS One, 2013,27;8(8):e69515.

[17] Masutani H, Ueda S, Yodoi J. The thioredoxin system in retroviral infection and apoptosis[J]. Cell Death Differ, 2005, 12(8): 991-998.

[18] Malla R, Gopinath S, Alapati K,etal. Downregulation of uPAR and Cathepsin B induces apoptosis via regulation of Bcl-2 and Bax and inhibition of the PI3K/Akt pathway in gliomas[J]. PloS one, 2010,29;5(10):e13731.

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells conditioned medium on protection of hydrogen peroxide injured PC12 cells

Lin Shanshan, Zhu Bo, Fu Gaoyong

(DepartmentofRehabilitationMedicine,TheFirstPeople′sHospitalofYibin,Yibin644000，Sichuan,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the impact of bone marrow mesenchymal stem cells conditioned medium (BMSC-CM) on the oxidative stress and apoptosis of PC12 cells induced by hydrogen peroxide. MethodsBMSCs were isolated and purified with density-gradient centrifugation method. The surface markers of BMSCs reacted against different antibodies were collected and detected by flow cytometry. Experiment was divided into three groups including control group, H2O2-injured group and co-culture group. MTT test was used to evaluate the cell viability of PC12 cells and AnnexinV-FITC detecting kits were used to detect the apoptosis of PC12 cells. The expression level of Trx, Bcl-2 and Bax protein in PC12 cells were detected by Western Blot. ResultsBMSCs isolated from rat bone marrow were highly positive for CD29, CD44 and negative for CD31, and CD45. BMSC-CM increased cell viability of H2O2-injured PC12 cells, decreased Annexin-V/PI staining positive cells. The expressions of Trx and Bcl-2 protein were significantly increased, and the Bax protein level was decreased compared with the other two groups. ConclusionBMSC-CM could inhibit the oxidative stress and apoptosis in PC12 cells, which could be related to the up-regulation of Trx and Bcl-2 protein expression and decrease of the level of Bax protein.

【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Conditioned medium; Hydrogen peroxide; PC12 cells; Oxidative stress

基金項目：宜賓市科技計劃項目經(jīng)費資助(2014SF009)

通訊作者：付高勇，E-mail: 527121032@qq.com

【中圖分類號】R 446.8

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.010

(收稿日期：2015-08-04; 編輯： 張文秀)