西藏羊八井高溫地熱田中度嗜熱放線菌多樣性及生物活性

尹明遠，張格杰，何建清*，燕 飛

(1.西藏大學農牧學院，西藏林芝 860000；2.浙江省農業科學院病毒學與生物技術研究所，浙江杭州 310021)

西藏羊八井高溫地熱田中度嗜熱放線菌多樣性及生物活性

尹明遠1，張格杰1，何建清1*，燕 飛2

(1.西藏大學農牧學院，西藏林芝 860000；2.浙江省農業科學院病毒學與生物技術研究所，浙江杭州 310021)

摘要[目的]探明羊八井地熱田放線菌的數量、種類組成、拮抗活性和酶活性。[方法]采用稀釋平板法對羊八井地熱田底泥和水樣放線菌進行分離，通過形態特征、培養特征和 16S rRNA 基因系統發育分析的方法研究樣品中度嗜熱放線菌的多樣性，并對分離到的放線菌進行抑菌、酶活性及溫度耐受試驗。[結果]從羊八井溫泉底泥和水樣中分離到21株中度嗜熱放線菌，分布于放線菌門放線菌綱3個亞目3個科3個屬，即鏈霉菌屬(Streptomyces)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)和小單孢菌屬(Micromonospora)。21株中度嗜熱放線菌中，14.2%的菌株具有纖維素酶活性，52.3%的菌株具有過氧化氫酶活性，28.6%的菌株具有硝酸鹽還原活性，33.3%的菌株可產生硫化氫，只有1株菌對大腸桿菌(E.coil)有抑菌活性，21株中度嗜熱放線菌最適生長溫度為45～55 ℃，超過65 ℃都不能生長。[結論]羊八井地熱田放線菌多樣性較豐富，產酶特性良好，為開發利用地熱環境放線菌資源奠定了基礎。

關鍵詞嗜熱放線菌；16S rRNA；生物活性；多樣性

世界上存在各種各樣適合嗜熱放線菌棲息的生境，如火山、地熱、堆肥、溫泉等。國內外陸續報道了溫泉里分離的嗜熱放線菌可產生一些具有重要價值的熱穩定的酶，如脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、DNA聚合酶等，并已廣泛應用在工業、農業、醫藥和生物技術行業[1-4]。目前，在以下屬中發現較多的高溫放線菌菌株：高溫單孢菌屬(Thermomonospora)[5-6]、糖單孢菌屬(Saccharomonospora)[7]、高溫雙岐菌屬(Thermobifida)[8]、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)[8]、鏈霉菌屬(Streptomyces)[9]、假諾卡氏菌屬(Pseudonocarcardia)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、小單孢菌屬(Micromonospora)、高溫多孢菌屬(Thermopolyspora)等。

羊八井地熱位于我國西藏自治區拉薩市西北約90 km的當雄縣羊八井鎮西側，地理坐標為30°～31° N、90°～91°E，海拔高度在4 290～4 500 m。羊八井分布有規模宏大的噴泉與間歇噴泉、溫泉、熱泉、沸泉、熱水湖等，溫度保持在47 ℃左右，是研究嗜熱放線菌的理想之地。隨著人們對嗜熱放線菌關注度的日益增加，許多學者對國內不同高溫環境的放線菌的資源進行了研究，但對羊八井地熱田放線菌的研究鮮見報道。鑒于此，筆者研究了羊八井地熱田嗜熱放線菌的資源種類、拮抗活性及其酶的應用潛力，旨在為開發高溫環境放線菌資源提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試樣品。從西藏羊八井采集了10份溫泉底泥和5份溫泉水樣(表1)，并保存于無菌塑料袋和無菌瓶中。

1.1.2培養基。分離培養基采用高氏一號瓊脂培養基、精氨酸甘油瓊脂培養基、察氏培養基[10]，為抑制細菌和真菌的生長，在培養基中均加入質量濃度為70 mg/L的重鉻酸鉀。

表1　羊八井地熱田環境數據

1.1.3主要試劑與儀器。脫脂奶粉、酵母膏、蛋白胨、淀粉等試劑均為國產分析純；DNA Polymerase、dNTPs、DNA marker DL-2000、pMD18-T vector 購自TaKaRa公司；PCR儀為東勝公司產品；膠回收試劑盒購自Qiagen公司。

1.1.4病原菌。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、小麥赤霉菌(Fusariumgraminearum)、番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)、南瓜枯萎菌(Fusariumoxysporum)、粉紅聚端孢(Trichotheciumroseum)、小麥根腐菌(Bipolarissorokiniana)菌株由西藏大學農牧學院真菌實驗室保存并提供。

1.2方法

1.2.1樣品預處理與菌株分離。用無菌袋盛取地熱田底泥樣品，置于室內風干，充分研磨，過篩，稱量10 g，轉移至盛有90.0 mL無菌水的三角瓶中，置于45 ℃恒溫振蕩箱中120 r/min振蕩，使蘊藏在樣品中的微生物充分釋放，用移液槍分別取1.0 mL樣品至盛有9.0 mL無菌水的試管中，稀釋至1×10-2，取0.2 mL涂布于分離培養基上，于45 ℃恒溫培養箱中倒置培養7～14 d。

取一定體積的水樣通過0.22 μm無菌濾膜富集，取下濾膜放在平板上，用1.0 mL無菌水將濾膜上的沉積洗掉，采用傾注平板法將適當溫度的培養基倒入相應平板，搖勻冷卻后于45 ℃恒溫培養箱中倒置培養7～21 d。根據菌落形態、大小、顏色初步分離篩選，利用高氏培養基純化并保藏。

1.2.2嗜熱放線菌鑒定。經純化后的嗜熱放線菌，采用插片法適時取片，用番紅染色在光學顯微鏡下觀察和初步鑒定[11]。同時按照參考文獻[12]的方法提取總DNA，用細菌16S rRNA通用引物PA5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’和PB 5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’進行PCR擴增，PCR產物直接送浙江杭州擎科梓熙生物技術有限公司測序，經ClustalX軟件[13]進行序列比對，利用MEGA4軟件[14]中的Neighbour-Joining法[15]構建系統進化樹，設置的重復抽樣次數為1 000次。

1.2.3酶活測定。淀粉酶水解、硝酸鹽還原、纖維素分解、明膠利用、氧化酶、硫化氫、過氧化氫酶活性篩選均參照文獻[16]的方法進行。

1.2.4拮抗活性測定。采用生長速率法測定供試嗜熱放線菌發酵液的皿內抑菌作用，選用的細菌為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，植物病原真菌為小麥赤霉菌、番茄灰霉菌、南瓜枯萎菌、粉紅聚端孢和小麥根腐菌。

1.2.5生長溫度測定。以高氏培養基為基礎培養基檢測不同試驗菌株在30～75 ℃下的生長情況。

2結果與分析

2.1羊八井地熱田底泥放線菌數量分布 3種培養基對不同樣品中的放線菌出菌率明顯不同。由表2可知，精氨酸甘油瓊脂培養基分離的放線菌數量最大，菌落形態較豐富，高氏一號瓊脂培養基和蔗糖察氏培養基分離的放線菌數量相對較少，種類單一。因此，精氨酸甘油瓊脂培養基的分離效果最好，分離的放線菌種類及數量均最多。

2.2中度嗜熱放線菌的多樣性從羊八井地熱田采集10份底泥和5份水樣，采用稀釋平板法分離出21株嗜熱放線菌，其中底泥19株，水樣2株，測定其16S rRNA序列。由圖1可知，分離菌株分布于放線菌綱3個亞目3個科3個屬，即鏈霉菌屬、擬諾卡氏菌屬和小單孢菌屬。其中，鏈霉菌屬為羊八井地熱田底泥中的優勢放線菌，占分離菌株數的89.50%，其次是擬諾卡氏菌屬，占分離菌株數的10.50%；水樣中全部為小單孢菌屬。

表2樣區土壤嗜熱放線菌數量

Table 2The quantity of thermophilic actinomycetes in sample plot soil×103個/g

樣區號PlotNo.高氏一號瓊脂培養基GaoshiNo.1agarculturemedium蔗糖察氏培養基Sucroseculturemedium精氨酸甘油瓊脂培養基Arginineglycerinagarculturemedium14.293.428.4211.5136.717.534.5133.0225.3412.5121.228.954.576.836.7612.5283.818.4713.5152.110.0828.0181.74.594.5226.48.4103.4159.478.0

注：高氏一號瓊脂培養基含鏈霉菌屬(4)；蔗糖察氏培養基含鏈霉菌屬(3)、小單孢菌屬(1)；精氨酸甘油瓊脂培養基含鏈霉菌屬(10)、小單孢菌屬(1)、擬諾卡氏菌屬(2)。

Note：Gaoshi No.1 arar culture medium containsStreptomyces；Sucrose culture medium containsStreptomyces，Micromonospora；Arginine glycerin agar culture medium containsStreptomyces，Micromonospora，Nocardiopsis.

2.3酶活及拮抗活性測定結果由表3可知，21株嗜熱放線菌中，14.2%的菌株具有纖維素酶活性，52.3%的菌株具有過氧化氫酶活性，28.6%的菌株可把硝酸鹽還原，33.3%的菌株可產生硫化氫，其中菌株R5、R10、R20具有高活性的纖維素酶活性，說明羊八井地熱田放線菌具有較強的酶活性。拮抗測定結果顯示，只有1株菌對大腸桿菌有拮抗活性，說明羊八井地熱田放線菌產拮抗活性能力較弱。

2.4分離菌株的生長溫度21株嗜熱放線菌在30～60 ℃下都可生長，65～75 ℃下均不能生長，45～55 ℃下生長狀況最好，因此，最適生長溫度范圍為45～55 ℃。

3結論與討論

該研究從羊八井地熱田中分離得到21株放線菌，分布于放線菌綱3亞目3科3屬，即鏈霉菌屬、擬諾卡氏菌屬和小單孢菌屬，表明羊八井地熱田放線菌數量少，種類較單一，這可能與分離培養基的種類及樣品的分析量較少有關，或者羊八井地熱田的微生物以細菌為主[17]。該研究進一步發現羊八井地熱田放線菌中以鏈霉菌為優勢菌種，這與Thawai[18]對泰國溫泉放線菌的多樣性研究結果一致，Thawai在泰國某溫泉分離到鏈霉菌屬和小單孢菌屬，與Song等[19]對中國云南騰沖、俄羅斯堪察加半島和美國內華達溫泉放線菌多樣性研究結果不一致，分析原因是由很多因素造成，如溫度、光照、氧氣、pH、水的理化性質、地理位置等生態因子[20]。主要原因可能是由于羊八井溫泉與其他溫泉溫度具有一定差異，而溫度是影響放線菌多樣性的重要因素[19，21-22]。該研究分離的21個菌株具有纖維素酶、過氧化氫酶、硝酸鹽還原、硫化氫產生的比率分別為14.2%、52.3%、28.6%、33.3%，其中菌株R5、R10、R20具有較高的纖維素酶活性，后續工作將對這3株菌產生的纖維素分解酶進一步研究和利用，個別菌株可產生2種酶。綜上所述，西藏羊八井高溫地熱田是獲得酶的潛在資源。分離的21株菌中只有1株菌對大腸桿菌有抑菌活性，對其他5種植物病原真菌和金黃色葡萄球菌無抑菌活性，這可能與供試菌株數量較小有關，曹艷茹等[23]發現具有合成抗生素相關基因的菌株只有在適當的發酵條件下才會表現出相應的抗性，而該研究中21株供試菌的發酵條件可能由于不適合從而導致拮抗活性較低。

圖1　基于16S rRNA 序列的西藏羊八井地熱田放線菌系統發育樹Fig.1　Phylogenetic tree of tested strains based on 16S rRNA sequence

菌株號StrainNo.纖維素酶Cellulase淀粉酶Amylase硝酸鹽還原Nitratereduction明膠液化Gelatinliquefaction硫化氫產生H2Sproduction過氧化氫酶CatalaseR1--+--+R2----++R3--+---R4--+---R5+++----+R7----++R8----++R9------R10+++-----R11------R12----++R13------R14--+--+R15------R16-----+R17----+-R18----++R19--+-++R20+++----+R21--+---

注：“-” 表示無酶活性；“+”表示有活性；“+++”為濾紙條降解≥2/3。

Note：“-”.negative.“+”.positive.“+++” Degradation of the filter paper≥2/3.

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Biological Activity and Diversity of Moderately Thermophilic Actinomyccetes from Geothermal Field in the Yangbajing of Tibet

YIN Ming-yuan, ZHANG Ge-jie, HE Jian-qing*et al

(College of Agriculture and Animal Husbandry, Tibet University, Linzhi, Tibet 860000)

Abstract[Objective] The aim was to explore the quantity, composition, antagonistic activity and enzyme activity of actinomyccetes from geothermal field in Yangbajing. [Method] Thermophilic actinomycetes were isolated via plate dilution from the sediment and water of Yangbajing geothermal field in Tibet Province. Based on the morphology, cultural characteristics and 16S rRNA sequence, diversity of thermophilic actinomycetes were studied, antibacterial activity, enzyme activity and temperature tolerance tests were conducted on isolates. [Result] The results showed that 21 isolates were identified and found to distribute into 3 genus: Streptomyce, Micromonospora and Nocardiopsis. Among those,14.2% produced cellulase, 52.3% produced catalase, 33.3% produced H2S and 28.6% could reduce nitrate, and 1 strain had antibacterial activity against Escherichia coil. The optimal growth temperature range for strains was 45-55 ℃ and temperature over 65 ℃ totally blocked the growth. [Conclusion] The discovery of diverse thermophilic actinobacteria from Yangbajing geothermal field indicates a potential source for enzymes.This study lays a foundation for the exploration and utilization of thermophilic actinobacteria resource.

Key wordsThermophilic actinomycetes; 16S rRNA; Biological activity; Diversity

基金項目國家自然科學基金項目(31260005)。

作者簡介尹明遠(1991- )，男，內蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向：極端環境放線菌。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導師，從事放線菌和生物防治研究。

收稿日期2016-02-24

中圖分類號Q 938

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)12-001-04