發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)草莓毛狀根的研究

朱秀蕾， 李 萍

(安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝系，安徽安慶 246003)

發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)草莓毛狀根的研究

朱秀蕾， 李 萍

(安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝系，安徽安慶 246003)

摘要[目的]建立高效的發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)草莓生根再生體系。[方法]以適合安徽省栽培的草莓優(yōu)良品種豐香為試材，利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601侵染植物細胞，觀察發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)草莓離體葉片產(chǎn)生毛狀根的效果。[結(jié)果]發(fā)根農(nóng)桿菌R1601培養(yǎng)成功；Carb有效除菌濃度為500 mg/L；當發(fā)根農(nóng)桿菌R1601的菌液OD600=0.6時，草莓葉片毛狀根的誘導(dǎo)率最高，而高于或低于該密度，誘導(dǎo)率均呈下降趨勢。[結(jié)論]建立了發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)草莓毛狀根再生體系，為草莓利用發(fā)根農(nóng)桿菌進行抗除草劑bar基因轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞發(fā)根農(nóng)桿菌R1601；草莓；毛狀根

草莓(FragariaananassaDuch)為薔薇科草莓屬(Fragaria)多年生草本植物，又名紅莓、洋莓、地莓等，原產(chǎn)歐洲。其外觀呈心形，鮮美紅嫩，果肉多汁，酸甜可口，且有特殊的濃郁水果芳香，被譽為“水果皇后”。 近年來，我國草莓生產(chǎn)發(fā)展迅速，陸續(xù)培養(yǎng)出一批新品種，栽培面積迅速擴大。發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)是根瘤菌科(Rhizobiacea)農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的一種革蘭陰性細菌，它能夠感染大多數(shù)雙子葉植物、少數(shù)單子葉植物以及個別裸子植物[1-2]。其攜帶的Ri質(zhì)粒能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生大量毛狀根，發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物所產(chǎn)生的毛狀根具有生長速度快、激素自主性和遺傳穩(wěn)定等特點，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物細胞產(chǎn)生毛狀根是20世紀80年代發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的植物基因工程技術(shù)，已成為植物轉(zhuǎn)基因研究的重要途徑[3-6]。筆者將發(fā)根農(nóng)桿菌R1601涂布至附加不同Carb濃度的培養(yǎng)基上，從而確定毛狀根除菌用抗生素濃度，并通過共培養(yǎng)法研究農(nóng)桿菌侵染草莓葉片產(chǎn)生毛狀根的菌液濃度，旨在為進一步介導(dǎo)轉(zhuǎn)化抗草丁瞵草莓奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料。以安徽省長豐縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心組培室提供的草莓品種豐香葉片為試材。

1.1.2菌種。發(fā)根農(nóng)桿菌R1601購自武漢大學(xué)生命科學(xué)院中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.3抗生素。羧芐青霉素(Carb)購自長沙歐邁生物科技有限公司，用無菌去離子水配成濃度為100 mg/mL的母液，0.22 μm濾膜抽濾滅菌后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4培養(yǎng)基。①基本培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基，其固體培養(yǎng)基用8 g/L瓊脂固化，高溫高壓滅菌后備用。②發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，pH 6.8±0.2；液體培養(yǎng)基供振蕩培養(yǎng)發(fā)根農(nóng)桿菌用，固體培養(yǎng)基則附加瓊脂20 g/L，高壓滅菌15～20 min。

1.2試驗方法

1.2.1發(fā)根農(nóng)桿菌復(fù)蘇及其培養(yǎng)。

1.2.1.1安瓿管開封。安瓿管用浸過75%乙醇的脫脂棉擦凈，用酒精燈火焰加熱其頂部，滴少量無菌水至加熱頂端使之破裂，用銼刀或鑷子敲下已破裂的安瓿管頂端。

1.2.1.2菌株復(fù)蘇培養(yǎng)。用滅過菌的毛細管吸取0.2 mL無菌水，滴入安瓿管中，輕輕振蕩，使凍干粉溶解。吸取全部菌體，滴入液體或斜面培養(yǎng)基，并在25 ℃下復(fù)蘇培養(yǎng)，長出新菌落后，挑取單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，4 000 r/min離心8 min，收集沉淀菌體，置于發(fā)根農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中，活化2～3次，再用MS培養(yǎng)液懸浮并稀釋至OD600分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0。

1.2.1.3毛狀根除菌用抗生素濃度的確定。將Carb添加至發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)基中(在培養(yǎng)基滅菌后冷卻至40 ℃以下加入抗菌素)，使之在培養(yǎng)基中的濃度分別為0、100、300、500、700、1 000 mg/L，將農(nóng)桿菌涂布至以上培養(yǎng)基中，25 ℃暗處培養(yǎng)3 d,3 d后觀察各平板菌落生長情況。

1.2.2草莓葉片毛狀根誘導(dǎo)方法的確定。

1.2.2.1共培養(yǎng)法。將豐香草莓的無菌試管苗轉(zhuǎn)接至MS培養(yǎng)基上，25 ℃下暗處預(yù)培養(yǎng)2 d。將試管苗葉片剪成葉塊，接種于無菌培養(yǎng)皿中，將活化好的菌液倒入培養(yǎng)皿中，共培養(yǎng)20 min，取出，用無菌濾紙吸干多余的菌液，放回原培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)入含Carb 500 mg/L的MS培養(yǎng)基中，25 ℃暗培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根。

1.2.2.2直接接種法。用無菌微量進樣器吸取活化好的菌液，對豐香草莓無菌葉片進行注射接種，在25 ℃下暗培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根。

1.2.2.3評價指標。14 d后觀察試驗結(jié)果，每組試驗重復(fù)5次，取其平均值[5]。毛狀根誘導(dǎo)率=產(chǎn)生毛狀根外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%。

1.2.3不同OD600菌液濃度對草莓葉片毛狀根誘導(dǎo)率的影響。利用共培養(yǎng)法將活化好的不同OD600菌液倒入培養(yǎng)皿中，共培養(yǎng)20 min取出，用無菌濾紙吸干多余的菌液，放回原培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)入含Carb 500 mg/L的MS培養(yǎng)基中，25 ℃暗培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根，評價指標同“1.2.2.3”。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)根農(nóng)桿菌的復(fù)蘇及培養(yǎng)通過對發(fā)根農(nóng)桿菌R1601進行復(fù)蘇增殖培養(yǎng)，發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)成功(圖1)。

2.2毛狀根除菌用抗生素濃度的確定從圖2可以看出，30 d后在100、300 mg/L Carb平板上有菌落生長，隨著Carb濃度的增大菌落逐漸減少，當Carb濃度達500 mg/L時完全抑制了菌落的生長，表明Carb最低抑制發(fā)根農(nóng)桿菌的濃度為500 mg/L。

圖1　發(fā)根農(nóng)桿菌R1601Fig. 1　Agrobacterium rhizogene R1601

圖2　不同Carb濃度對草莓葉片毛狀誘導(dǎo)的影響Fig. 2　Effects of different Carb concentration on the induction rate of hairy roots from F.ananassa leaves

2.3不同誘導(dǎo)方法對草莓葉片毛狀根誘導(dǎo)率的影響用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601感染草莓無菌葉片，通過對共培養(yǎng)法和直接接種法進行比較，結(jié)果表明，共培養(yǎng)法的誘導(dǎo)率較高，為10%，且出現(xiàn)分枝較多的根；直接接種法誘導(dǎo)率為0(表1)。同時共培養(yǎng)法最為常用，且效果較好，因此，該試驗采用共培養(yǎng)法獲得草莓毛狀根。

2.4不同OD600菌液濃度對草莓毛狀根誘導(dǎo)率的影響由圖3可知，當菌液OD600=0.6時，毛狀根誘導(dǎo)率最高達16%，而高于或低于該密度，轉(zhuǎn)化率均呈下降趨勢。

3討論

該試驗采用一種簡便易行的草莓毛狀根誘導(dǎo)方法，成功獲得了草莓的毛狀根，為草莓轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。不同植物種類對發(fā)根農(nóng)桿菌的敏感性有差異，而該差異可通過優(yōu)化各種處理因素而減小。利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化草莓，通過毛狀根的誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)獲得再生植株。毛狀根再生植株在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)根系發(fā)達，節(jié)根分節(jié)較多，側(cè)根發(fā)達，

表1不同誘導(dǎo)方法對草莓葉片毛狀根誘導(dǎo)率的影響

Table 1Effects of induction method on the induction rate of hairy roots fromF.ananassaleaves

誘導(dǎo)方法Inductionmethod外植體數(shù)Explantsnumber誘導(dǎo)率Inductionrate∥%生根情況Rootingsituation直接接種法Directinoculationmethod300無根,接種處褐化嚴重,逐漸死亡共培養(yǎng)法Co-cul-turemethod3010出現(xiàn)分枝較多的根

生長迅速。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根的影響因素很多，其中菌液濃度是轉(zhuǎn)化過程中常被調(diào)整的因素，菌液濃度過高，發(fā)根農(nóng)桿菌生長過快，不易被抗生素殺死，易導(dǎo)致外植體受到傷害、發(fā)生褐化甚至死亡；菌液濃度過低，又無法感染外植體。另外，培養(yǎng)基中添加合適濃度的抗生素能有效抑制農(nóng)桿菌的生長，從而有效地除菌，抗生素濃度又不能太高，以免對植物細胞產(chǎn)生較大的毒害作用而影響細胞的正常生長。

圖3　不同OD600菌液濃度對草莓葉片毛狀根誘導(dǎo)率的影響Fig. 3　Effects of OD600 values of Agrobacterium rhizogene R1601 solution on the induction rate of hairy roots from F. ananassa leaves

參考文獻

[1] 趙爽，潘少麗．毛狀根培養(yǎng)技術(shù)在中草藥中的應(yīng)用[J]．時珍國醫(yī)國藥，2011，22(6)：1483-1484．

[2] 張來，羅正偉，張顯強，等．發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的特征及其應(yīng)用[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(15)：8183-8185．

[3] 魏源文，張向軍，陳麗娟.草莓葉片再生體系的建立[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004(1)：17-18.

[4] 陳偉莉，牟旭鵬，劉冬影．毛狀根在植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)方面應(yīng)用的研究進展[J]．黑河學(xué)院學(xué)報，2010，11(4)：122-126．

[5] 馮珂．丹參毛狀根培養(yǎng)體系建立及誘導(dǎo)子的作用研究[D]．楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010．

[6] 王學(xué)勇．丹參毛狀根基因誘導(dǎo)表達分析及其有效成分生物合成基因的克隆研究[D]．北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2007．

Induction of Hairy Roots ofFragariaananassaDuch byAgrobacteriumrhizogene

ZHU Xiu-lei, LI Ping

(Department of Landscape Gardening, Anqing Vocational and Technical College, Anqing, Anhui 246003)

Abstract[Objective] To establish high-efficient root regeneration system of Fragaria ananassa Duch by Agrobacterium rhizogene. [Method] With cultivar Toyonoka suitably cultivated in Anhui Province as the research material, plant cell was infected by A. rhizogene R1601. Grwoth of Agrobacterium-induced hairy roots from F. ananassa leaves were observed. [Result] A. rhizogene R1601 was successfully cultivated. The effective sterilization concentration of Carb was 500 mg/L. When the OD600of A. rhizogene R1601 was 0.6, the induced frequency of hairy roots was the highest. Otherwise, the induction rate all reduced. [Conclusion] Ahigh-efficient root regeneration system of F. ananassa by A. rhizogene is established, which lays foundation for the researches on bar gene transformation in F. ananassa by using A. rhizogene.

Key wordsAgrobacterium rhizogene R1601; Fragaria ananassa Duch; Hairy roots

作者簡介朱秀蕾(1980- )，女，安徽安慶人，講師，碩士，從事組織培養(yǎng)方面的研究。

收稿日期2016-04-11

中圖分類號S 668.4

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)12-121-02