菌株0206產PHA的發酵條件優化

朱九濱, 李爽芹, 梁寶東, 李湘利

(濟寧學院生命科學與工程系，山東曲阜 273155)

菌株0206產PHA的發酵條件優化

朱九濱, 李爽芹, 梁寶東, 李湘利

(濟寧學院生命科學與工程系，山東曲阜 273155)

摘要[目的]優化菌株0206產PHA株的發酵條件。[方法]以菌株0206為試驗菌株，對碳源、氮源、培養基pH和培養時間進行了單因素試驗和正交試驗。[結果]從活性污泥中分離篩選到高產PHA的菌株0206，通過生理生化鑒定，菌株0206為芽孢桿菌屬，菌株0206產PHA最優發酵條件為葡萄糖10 g/L，硫酸銨10 g/L，氯化鈉2 g/L，培養基pH 7.0，培養時間48 h。[結論]優化了菌株0206產PHA的發酵條件，為PHA的發酵提供參考。

關鍵詞PHA；生理生化鑒定；發酵條件優化

聚羥基脂肪酸酯(PHA)作為一種新穎的生物材料,其生物組織相容性和可降解性已得到人們的認可,具有良好的應用前景[1]。PHA因具有優越的理化性質,近年來在電學、光學、生物醫學等高技術領域中得到廣泛應用[2-3]。

PHA在生物體內作為碳源和能源的貯藏物而存在[4]。微生物發酵法生產PHA在國內外都有大量研究,但在生產過程中仍存在一系列問題,尤其是生產能力低和生產成本過高[5],這制約了生物發酵生產PHA工業的擴大和PHA的應用。筆者以從活性污泥中篩選出來的產PHA菌株0206為試驗菌株,通過優化發酵條件,比較不同發酵條件下的活菌數,旨在為PHA的發酵提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株。菌株0206：濟寧學院生命科學實驗中心分離獲得。

1.1.2培養基。牛肉膏蛋白胨培養基[6]：牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，NaCl 2 g，水1 000 mL，pH 7.5。生理生化鑒定培養基：蛋白胨水培養基、明膠液化試驗培養基、石蕊牛奶試驗培養基、葡萄糖利用試驗培養基、甲基紅試驗培養基、過氧化氫酶試驗培養基。

1.2菌株0206的生理生化鑒定對篩選出的菌株按照《伯杰細菌鑒定手冊》[7]進行菌落形態和生理生化特征鑒定。

1.3菌株0206產PHA的發酵條件優化

1.3.1單因素試驗

1.3.1.1碳源對菌株0206產PHA的影響。分別用葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉(接入量為10 g/L)代替牛肉膏蛋白胨培養基中的碳源，接入1 mL搖瓶培養的高產PHA菌株的菌液，搖瓶培養36 h后，吸取1 mL菌液加入裝有9 mL無菌水的試管中，以此為10-1稀釋菌懸液，用旋渦振蕩器混勻。按上述操作順序，分別制成10-2～10-7梯度稀釋菌懸液。取0.1 mL適當稀釋的菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基上，培養48h后，對培養基中的菌落數進行統計，做3個平行，計算原培養液中的活菌總數，并結合熒光顯微鏡觀察菌株的熒光強度，以確定不同碳源對菌株產PHA的影響，從而確定最佳碳源。

在確定最佳碳源的基礎上，用同樣的方法研究碳源濃度對菌株0206生長和產PHA的影響，從而確定該碳源的最適濃度。

1.3.1.2氮源對菌株0206產PHA的影響。牛肉膏蛋白胨培養基在確定碳源及其濃度的基礎上，分別用酵母粉、精氨酸、NH4Cl、尿素、硫酸銨(接入量10 g/L)代替優化碳源后培養基中的氮源，按“1.3.1.1”的方法確定最佳氮源及其最適濃度。

1.3.1.3培養基pH對菌株0206產PHA的影響。牛肉膏蛋白胨培養基在確定最佳碳源、氮源的基礎上，調節不同初始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)進行發酵試驗，按“1.3.1.1”的方法確定培養基的最佳初始pH。

1.3.1.4培養時間對菌株0206產PHA的影響。以最佳碳源、氮源代替牛肉膏蛋白胨培養基中的碳源和氮源，調節最佳初始pH，接入1 mL搖瓶培養的高產PHA菌株的菌液，搖瓶培養24、30、36、42、48、54、60 h后，按“1.3.1.1”的方法測試不同培養時期菌株0206的生長狀況和產PHA情況。

1.3.2正交試驗。根據單因素試驗結果，選擇碳源、氮源、培養基pH及培養時間為影響因素，設計4因素3水平L9(34)的正交試驗。按表1進行正交試驗，每組試驗做3個平行，以活菌數為評價指標，確定產PHA菌株的最佳發酵條件。

表1　正交試驗設計因素水平

2結果與分析

2.1形態特征和生理生化鑒定

2.1.1形態特征。高產PHA菌株0206在牛肉膏蛋白胨固體培養基上的菌落形態見圖1。該菌的菌落形態特征：菌落較小，呈圓形，中間凸起，邊緣光滑，不透明，黃色，表面較干燥，易于挑取。

圖1　菌株0206菌落形態Fig.1　Colony morphology of strain 0206

2.1.2生理生化鑒定。按照菌落特征和生理生化鑒定結果，參照《伯杰細菌鑒定手冊》，并對其進行芽孢染色，將菌株0206初步鑒定為芽胞桿菌屬(BacillusCohn)(表2)。

表2植株0206生理生化鑒定結果

Table2Physiologicalandbiochemicalidentificationresultsofstrain0206

鑒定項目Identificationitems鑒定結果Identificationresults鑒定項目Identificationitems鑒定結果Identificationresults明膠液化Gelatinliguefaction液化吲哚試驗Indoletest+石蕊牛奶Litmusmilk胨化葡萄糖利用Glucoseutilization產酸甲基紅試驗Methylredtest-革蘭氏染色紫色(+)過氧化氫酶Catalase+

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

Note:“+”indicatespositive,“-”indicatesnegative.

2.2菌株0206產PHA的發酵條件優化

2.2.1單因素試驗

2.2.1.1碳源對菌株0206產PHA的影響。由圖2可知，不同碳源對菌株0206的影響不同，葡萄糖的平均活菌數最大。在確定菌株最佳碳源(葡萄糖)的基礎上，測定葡萄糖的初始濃度對菌株0206的影響，結果見圖3。由圖3可知，隨著葡萄糖濃度的增加，活菌數呈增加趨勢，當葡萄糖濃度在6～10g/L時，活菌數呈增加趨勢，當葡萄糖濃度在10～14g/L時，活菌數呈減少趨勢，結合在熒光顯微鏡下觀察的熒光強度，確定最佳碳源濃度為10g/L。

圖2　不同碳源對菌株0206菌落數的影響Fig.2　Effects of different carbon sources on colony number of strain 0206

圖3　葡萄糖濃度對菌株0206菌落數的影響Fig.3　Effects of glucose concentration on colony number of strain 0206

圖4　不同氮源對菌株0206菌落數的影響Fig.4　Effects of different Nifrogen sources on colony number of strain 0206

2.2.1.2氮源對菌株0206產PHA的影響。由圖4可知，不同氮源對菌株0206的影響不同，其中，有機氮源酵母粉和無機氮源硫酸銨的平均活菌數較多，且差別不大，但在熒光顯微鏡下硫酸銨對菌株0206的熒光強度比酵母粉對菌株0206的熒光強度較強，綜合考慮，選擇無機氮源硫酸銨為最佳氮源。在確定最佳氮源(硫酸銨)的基礎上，測定硫酸銨的初始濃度對菌株0206的影響，結果見圖5。由圖5可知，隨著硫酸銨濃度的增加，活菌數呈增加趨勢，當硫酸銨濃度在6～10g/L時，活菌數呈增加趨勢，當硫酸銨濃度在10～14g/L時活菌數呈下降趨勢，結合在熒光顯微鏡下觀察的熒光強度，確定最佳氮源濃度為10g/L。

圖5　硫酸銨濃度對菌株0206菌落數的影響Fig.5　Effects of ammonium sulphate concentration on colony number of strain 0206

2.2.1.3培養基pH對菌株0206產PHA的影響。由圖6可知，不同培養基初始pH對菌株0206的影響不同，當pH為6.0～7.0時，活菌數呈上升趨勢，當pH為7.0～8.0時，活菌數呈下降趨勢，結合在熒光顯微鏡下觀察的熒光強度，確定最佳初始pH為7.0。

圖6　培養基初始pH對0206菌株菌落數的影響Fig.6　Effects of culture medium initial pH on colony number of strain 0206

2.2.1.4培養時間對菌株0206產PHA的影響。由圖7可知，隨著培養時間的增加，活菌數呈增加趨勢，當培養時間在24～48h時，活菌數呈增加趨勢，熒光強度增加，當培養時間在48～60h時，活菌數呈下降趨勢，熒光強度減弱，故PHA的積累與菌體生長呈明顯的正相關，故確定最佳培養時間為48h。

圖7　培養時間對菌株0206菌落數的影響Fig.7　Effects of incubation time on colony number of strain 0206

2.2.2正交試驗。由表3可知，對菌株0206生長的影響由大到小依次為A、D、B、C，即葡萄糖添加量影響最大，培養時間次之，培養基pH影響最小。方差分析表明，4個因素中，葡萄糖對菌株影響較顯著，培養基pH的影響較小。菌株0206發酵條件的最優組合為A2B2C2D2。經驗證試驗，在該條件下平均活菌數為2.59×109CFU/mL，較9組試驗最高組所得的菌落數(2.45×109CFU/mL)高，故確定最優發酵條件為葡萄糖10g/L，硫酸銨10g/L，氯化鈉2g/L培養基pH為7.0，培養時間為48h。

表3　正交試驗結果

3結論與討論

該研究通過形態特征及生理生化鑒定可以得出，產PHA菌株0206為芽孢桿菌屬，對碳源、氮源、培養基初始pH和培養時間分別進行單因素和正交試驗分析，結果顯示菌株0206產PHA最佳發酵條件為葡萄糖10g/L，硫酸銨10g/L，氯化鈉2g/L,培養基pH7.0，培養時間48h。

該研究是基于實驗室搖瓶培養的條件下完成的，鑒于大規模發酵的工藝條件與搖瓶有較大差別，經搖瓶篩選出來的高產突變株未必在發酵罐內也高產，因此，關于PHA高產菌株的生產試驗還有待于進一步研究。該試驗雖只對一株菌進行了研究，但仍可為其他產PHA菌株的培養提供參考。

參考文獻

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[2] 李懋，王朝云,呂江南,等.可生物降解材料聚羥基脂肪酸酯(PHA)的合成與應用概述[J].環境科學與管理, 2009,34(12)：144-148.

[3] 金大勇,顧國維,楊海真.生物降解塑料聚羥基烷酸(PHA)的研究進展[J].氨基酸和生物資源,2004,26(3):30-32.

[4] 王琴,陳銀廣.活性污泥合成聚羥基烷酸(PHAs)的研究進展[J].環境科學與技術,2007,30(5)：112-114.

[5] RAY S,PRAJAPATI V,PATEL K.Optimization and characterization of PHA from isolate Pannonibacter phragmitetus ERC8 using glycerol waste[J].International journal of biological macromolecules,2016,86:741-749.

[6] BUCHANAN R E,GIBBONS N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].中國科學院微生物研究所,譯.北京:科學出版社,1984.

[7] 趙斌,何紹江.微生物學實驗[M].北京:科學出版社,2010.

Optimization of Fermentation Conditions of PHA-producing Strain 0206

ZHU Jiu-bin, LI Shuang-qin, LIANG Bao-dong et al

(Life Science and Engineering Department of Jining University, Qufu, Shandong 273155)

Abstract[Objective] The aim was to study fermentation conditions of PHA-producing strain. [Method] With strain 0206 as test material, fermentation conditions about carbon, nitrogen, pH value and the culture time were analyzed by single factor experiment and orthogonal experiment. [Result] High PHA-producing strain 0206, which was isolated from activated sludge filter, was identified as Bacillus cohn through the physiological-biochemical identification. After optimization, fermentation conditions were: 10 g/L glucose, 10 g/L ammonium sulfate, 2 g/L NaCl, medium pH 7.0, incubation time for 48 hours. [Conclusion] The study provides reference for fermentation of PHA.

Key wordsPHA; Physiological-biochemical identification; Fermentation condition optimization

基金項目濟寧學院青年科研基金項目(2012QNKJ08)。

作者簡介朱九濱(1980- ),男,山東濱州人,講師,碩士,從事微生物學教學和研究。

收稿日期2016-04-06

中圖分類號Q 93

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)12-123-03