弗氏鏈霉菌tylF基因的克隆及其生物信息學分析

閆明亮

(中國人民解放軍海軍工程大學電氣工程學院，湖北武漢 430000)

弗氏鏈霉菌tylF基因的克隆及其生物信息學分析

閆明亮

(中國人民解放軍海軍工程大學電氣工程學院，湖北武漢 430000)

摘要[目的]研究弗氏鏈霉菌tylF基因的克隆及其生物信息學分析。[方法]利用RT-PCR技術、巢式PCR技術和RACE技術從弗氏鏈霉菌B-62169菌株中克隆獲得tylF基因的全長cDNA序列，并對其生物信息學進行分析。[結果]經Vector NTI 11.0軟件拼接獲得tylF基因全長cDNA序列長度為1 245 bp，并帶有19 bp長的Poly(A)尾巴，包含927 bp的開放讀碼框(ORF)，編碼一個含309個氨基酸殘基的蛋白質。生物信息學分析結果表明，tylF基因編碼的酶是大菌素-O-甲基轉移酶，參與分子功能中甲基轉移酶活性和生物學途徑中甲基化過程。對tylF基因全長cDNA序列進行蛋白質結構域分析，證實該基因編碼TylF蛋白，并具有223個氨基酸蛋白結構域。[結論]該研究為闡明泰樂菌素生物合成過程中甲基化反應機理，更進一步研究大環內酯類抗生素生物合成代謝途徑提供生物信息學數據支持。

關鍵詞tylF；泰樂菌素；弗氏鏈霉菌；基因克隆

鏈霉菌(Streptomyces)屬于放線菌目鏈霉菌科原核生物，是一類具有絲狀分枝細胞的革蘭氏陽性細菌[1]。泰樂菌素[2](Tylosin)，又名泰樂星，是一類16元大環內酯類畜禽專用抗生素，其產生菌[2]有弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、龜裂鏈霉菌(Streptomyces romosus)和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，其中弗氏鏈霉菌是泰樂菌素的主要產生菌，同時也是工業化生產泰樂菌素的工程菌株。泰樂菌素是一種畜禽專用抗生素，其主要用于飼料添加劑和動物治療如豬氣喘病、雞慢性呼吸道病、動物消化道疾病、地方性動物支氣管炎等，能明顯促進禽畜生長、提高飼料利用率[3]等，具有廣闊的市場前景。

tylF基因編碼的大菌素-O-甲基轉移酶，催化泰樂菌素C3位羥基的甲基化反應[4]。泰樂菌素C3位羥基的甲基化反應是泰樂菌素生物合成的最后一步，也是限速反應[5]。目前關于弗氏鏈霉菌tylF基因克隆的研究較少，弗氏鏈霉菌研究主要集中于工程菌株的構建和發酵生產方面，2012年范亮等[6]利用基因重組技術，構建了具有雙拷貝tylF基因的泰樂菌素基因工程菌株，結果比相同條件下未轉化菌種生產泰樂菌素的能力提高了32.7%。但這些研究并未獲得tylF基因全長cDNA序列，只是根據NCBI上的序列設計引物進行后續試驗。筆者通過對tylF基因全長序列克隆及其生物信息學分析，不僅可以從分子角度進一步闡明泰樂菌素的生物合成過程，還可以更進一步研究大環內酯抗生素生物合成過程的未知代謝機理，明晰抗生素生物合成代謝途徑中的未知假定。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種和試劑。弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiaeB-62169)購于北京微生物菌種保藏中心。RNA提取試劑盒購自美國Bio-Rad公司，RACE克隆試劑盒購自美國Bio-Rad公司，pMD18-T載體、RT-PCR以及大腸桿菌E.coliDH5α等相關試劑購自大連寶生物公司。

1.1.2培養基。大腸桿菌的培養基為LB培養基，弗氏鏈霉菌的固體培養基為AS-2(Yeasteztract)培養基，弗氏鏈霉菌的液體培養基為TSB(Tryptonesoyabroth)培養基。

1.2方法

1.2.1弗氏鏈霉菌總RNA的提取。將弗氏鏈霉菌在AS-2平板上活化培養，再從AS-2平板上挑取單菌落接種至含有25mLTSB培養基的250mL三角瓶中，在培養溫度37 ℃、搖床220r/min下振蕩培養10～12h后，將三角瓶靜止放置10min，然后在12 000r/min下離心10min收集菌體細胞。按照RNA提取試劑盒說明書提取弗氏鏈霉菌總RNA，電泳檢測RNA質量，并將其保存，為下一步反轉錄備用。

1.2.2tylF基因的克隆。

1.2.2.1cDNA第一條鏈合成。參考Bio-Rad公司RevertAidTMfirststrandcDNASynthesisKit反轉錄試劑說明書進行cDNA第一條鏈的合成，在42 ℃下反應1h，反應結束后在70 ℃下處理5min使逆轉錄酶失活，-20 ℃保存備用。

1.2.2.2RT-PCR反應體系。根據GenBank中tylF基因的氨基酸保守序列設計該基因簡并引物PF和PR，引物序列見表1。PCR反應體系25.0μL：2.0μL模板cDNA，2.5μL10×TaqDNAPolymerasBuffer，0.9μL10mmol/LdNTPs，1.0μL引物F1，1.0μl引物R1，0.3μLTaqDNAPolymeras，ddH2O補齊至25.0μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5min；94 ℃變性40s，59 ℃退火60s，72 ℃延伸60s，30個循環；72 ℃延伸10min。

表1　弗氏鏈霉菌tylF基因克隆的引物

1.2.2.33′-RACE克隆。按照RACE克隆試劑盒(美國Bio-Rad公司)說明書進行RACE克隆。利用試劑盒合成3′-ReadycDNA并根據RT-PCR獲得的已知序列設計2條反向嵌套PCR引物PF1、PR2(表1)。正向引物為試劑盒中所帶UMP。用引物UMP和PF1配對3′-ReadycDNA進行第1輪PCR；并取第一輪PCR產物1.0μL為模板，用引物UMP和PR2配對進行第2輪PCR。

1.2.2.45′-RACE克隆。按照RACE克隆試劑盒(美國Bio-Rad公司)說明書進行RACE克隆。利用試劑盒合成5′-ReadycDNA并根據RT-PCR獲得的已知序列設計2條反向嵌套PCR引物PF3、PR4(表1)。正向引物為試劑盒中所帶UMP。用引物UMP和PF3配對5′-ReadycDNA進行第1輪PCR；并取第一輪PCR產物1.0μL為模板，用引物UMP和PR4配對進行第2輪PCR。

1.2.2.5全長cDNA的擴增。將3′-RACE和5′-RACE擴增獲得的3′端和5′端cDNA序列在軟件VectorNTI11.0上進行序列拼接，通過軟件拼接獲得全長cDNA序列，并利用獲得的序列設計兩端引物PF5、PR6(表1)擴增tylF基因全長的cDNA序列。PCR反應體系25.0μL：2.0μL模板cDNA，2.5μL10×TaqDNAPolymerasBuffer，0.9μL10mmol/LdNTPs，1.0μL引物F1，1.0μL引物R1，0.5μLTaqDNAPolymeras，ddH2O補齊至25.0μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5min；94 ℃變性40s，60 ℃退火60s，72 ℃延伸60s，30個循環；72 ℃延伸10min。

1.2.2.6測序及序列生物信息學分析。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切下目的條帶，采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收后，將純化回收的目的基因片段與pMD18-T載體連接。將連接好的產物轉化大腸桿菌感受態細胞進行藍白斑篩選，并進行PCR驗證。將驗證成功轉化感受態的菌液應用M13通用引物進行測序，測序由上海生工生物工程技術服務公司完成。

1.2.3測序及測序結果生物信息學分析。將測序結果在GenBank中進行BLAST比對，利用Blast2go軟件[7-8](http：//www.blast2go.com/b2ghome)進行生物信息學分析，利用Pfam在線軟件[9](http：//pfam.xfam.org/)進行蛋白質結構域預測。

2結果與分析

2.1弗氏鏈霉菌tylF基因保守序列cDNA克隆與分析以弗氏鏈霉菌的cDNA為模板，利用設計好的引物PF和PR進行RT-PCR，結果獲得片段約為800bp的目的條帶。將該片段純化后轉化至大腸桿菌感受態中，篩選陽性菌落進行PCR檢驗和測序分析，結果表明，RT-PCR獲得的目的片段長度為821bp(圖1)。將該片段的核苷酸序列與NCBI中的序列進行比對，其結果與恥垢分枝桿菌和鳥型分枝桿菌中的tylF基因同源性分別達70%和76%，初步說明已經成功獲得了tylF基因的部分序列。

注：M.DL2 000 Marker,1.陰性對照,2.tylF基因保守序列陽性克隆。Note：M.DL2 000 Marker, 1.Negative control, 2.Positive clone of tylF gene conserved sequence.圖1　tylF基因保守序列電泳圖譜Fig.1　Agarose gel electrophoretic analysis of tylF gene PCR products

2.2弗氏鏈霉菌tylF基因全長cDNA序列的克隆與分析由圖2可知，利用3′-RACE技術克隆獲得cDNA片段長度為417bp，其中有196bp與已經克隆獲得的821bp中間片段具有重疊區，同時帶有19bp長的Poly(A)尾巴。利用5′-RACE技術克隆獲得cDNA片段長度為305bp，其中有102bp與已經克隆獲得的821bp中間片段具有重疊區。通過VectorNTI11.0軟件對已經獲得的3′-RACE片段序列、5′-RACE片段序列以及RT-PCR片段序列進行比對和拼接，從而獲得弗氏鏈霉菌tylF基因全長cDNA序列。由圖3可知，弗氏鏈霉菌tylF基因全長cDNA序列全長為1 245bp，并帶有19bp長的Poly(A)，tylF基因起始密碼子ATG位于203nt處，終止密碼子TAG位于1 130nt處。全長1 245bp序列中包含203bp的5′端非翻譯區(UTR，untranslatedregion)和115bp的3′端非翻譯區，以及927bp的開放讀碼框(ORF)，編碼一個含309個氨基酸殘基的蛋白質，經預測編碼TylF蛋白。

注：M.DL 2 000 Marker，1.5′-RACE PCR產物，2.3′-RACE PCR產物。Note：M.DL 2 000 Marker，1.5’-RACE PCR products，2.3’-RACE PCR products.圖2　tylF基因RACE擴增電泳圖譜Fig.2　Agarose gel electrophoretic analysis of tylF gene RACE PCR products

注：M.DL2 000 Marker，1和2.tylF基因全長cDNA序列陽性克隆，3.陰性對照。Note：M.DL 2 000 Marker，1 and 2.The cDNA sequence positive cloning of the whole tylF gene，3.Negative control.圖3　tylF基因全長cDNA序列電泳圖譜Fig.3　Agarose gel electrophoretic analysis of tylF gene cDNA sequence

2.3弗氏鏈霉菌tylF基因全長cDNA序列生物信息學分析將已經獲得的弗氏鏈霉菌tylF基因全長序列編輯成fasta格式文件，利用生物信息學軟件Blast2go對tylF基因進行功能注釋分析和KEGG代謝途徑分析。由圖4可知，tylF基因被功能注釋為大菌素-O-甲基轉移酶。同時GO功能注釋結果顯示，其被注釋到參與分子功能中甲基轉移酶活性和生物學途徑中甲基化過程。由圖5可知，tylF基因被注釋上的酶標號為EC2.1.1.101，是大環內酯類衍生物合成過程中的關鍵酶基因。由圖6可知，獲得的tylF基因全長cDNA序列包含了整個TylF蛋白保守結構域，其長度為223個氨基酸。

圖4　tylF注釋信息Fig.4　tylF gene annotation information

注：紅色框標記為tylF基因所參與大環丙酯類衍生物合成的作用位置。Note: The red box was the interaction site of tylF gene participated in macrolide derivatives synthesis. 圖5　大環內酯類衍生物合成途徑Fig.5　Biosynthesis of meberde macrolides

圖6　TylF蛋白保守域分析Fig.6　Analysis protein domain of TyLF gene

3結論與討論

該研究利用RT-PCR技術從弗氏鏈霉菌B-62169菌株中克隆獲得tylF基因的保守序列，同時利用巢式PCR技術、3′-RACE和5′-RACE技術獲得tylF基因的全長cDNA序列。通過VectorNTI11.0軟件拼接獲得的弗氏鏈霉菌tylF基因全長cDNA序列全長為1 245bp，并帶有19bp長的poly(A)尾巴，該基因起始密碼子ATG位于203nt處，終止密碼子TAG位于1 130nt處，全長序列中包含203bp的5′端非翻譯區和115bp的3′端非翻譯區，以及927bp的開放讀碼框(ORF)，編碼一個含309個氨基酸殘基的蛋白質，經預測編碼TylF蛋白。通過生物信息學分析軟件對該基因進行了全面系統的分析，tylF基因編碼的酶是大菌素-O-甲基轉移酶，對該基因功能注釋結果顯示其參與分子功能中甲基轉移酶活性和生物學途徑中甲基化過程。tylF基因在KEGG代謝過程中被注釋的酶標號為EC2.1.1.101，是大環內酯類衍生物合成過程中的關鍵酶基因。將獲得tylF基因全長cDNA序列進行蛋白質結構域分析，證實該基因編碼TylF蛋白，并具有223個氨基酸蛋白結構域。

在NCBI尚未公布有關弗氏鏈霉菌中tylF基因全長cDNA序列的信息，僅有恥垢分枝桿菌、鳥型分枝桿菌等分歧桿菌中tylF基因mRNA序列。該研究結合生物學知識和生物信息學分析，更進一步對tylF基因信息進行研究，重點從轉錄組學層面上解釋了tylF基因參與大環內酯類衍生物合成途徑中的關系，明晰了泰樂菌素抗生素合成代謝的積累機制，為今后定向提高大環內酯抗生素的產量提供參考。

參考文獻

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CloningandBioinformaticsAnalysisoftylFGeneinStreptomyces fradiae

YANMing-liang

(CollegeofElectricalEngineering,NavalUniversityofEngineering,PLA,Wuhan,Hubei4300000)

Abstract[Objective] To research the cloning and bioinformatics analysis of tylF gene in Streptomyces fradiae. [Method] The partial cDNA of tylF was cloned from Streptomyces fradiae B-62169 through RT-PCR technique by specific primers designed on the basis of tylF gene in GenBank website. And its bioinformatics analysis was carried out. [Result] A 1245 bp full length cDNA sequence of tylF was obtained using nested PCR and RACE technique. The cloned tylF cDNA contained an open reading frame (ORF) of 927 bp and was predicted to encode a deduced protein with 309 amino acid residues. Bioinformatics analysis results showed that the gene encoding enzymes was macrocin-O-methyl transferase, which participated in the methylation process of methyltransferase activity and biological pathways in molecular function. Full-length cDNA sequence of the tylF structural gene for protein domain analysis confirmed that the gene encoding TylF protein having 223 amino acids was completed and the protein domains. [Conclusion] This research provides data support for the methylation reaction mechanism of tylosin biosynthetic process, and the further researches on biosynthesis and metabolic pathways of macrolides antibiotics.

Key wordstylF; Tylosin; Streptomyces fradiae; Gene cloning

作者簡介閆明亮(1993- )，男，吉林通化人，本科生，專業：電氣工程。

收稿日期2016-03-30

中圖分類號Q 81

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)12-126-04