小鼠口服五氯柳胺的急性毒性研究

張吉麗， 李 冰， 司鴻飛， 周緒正， 程富勝， 張繼瑜

(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農業部獸用藥物創制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050)

小鼠口服五氯柳胺的急性毒性研究

張吉麗， 李 冰， 司鴻飛， 周緒正， 程富勝， 張繼瑜*

(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農業部獸用藥物創制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050)

摘要[目的]為初步評價五氯柳胺的安全性，對其進行小鼠的急性毒性試驗。[方法]預試驗采用遞增法確定給藥的劑量范圍和正式試驗分組。正式試驗采用簡化寇氏法，灌胃給藥，觀察7 d，觀察給藥后小鼠的體征變化，統計死亡率和死亡時間，計算LD50值及其95%置信區間。[結果]小鼠口服五氯柳胺的LD50為1.130 g/kg，95%置信區間為0.940～1.359 g/kg。[結論]按照化學物的急性毒性劑量分級，五氯柳胺為低毒化學物。

關鍵詞五氯柳胺；小鼠；急性毒性試驗；LD50

肝片吸蟲病是由肝片吸蟲引起的家畜常見的人畜共患病。該病遍及世界各地，嚴重阻礙了畜牧養殖業的健康發展，對保障食品安全、公共衛生安全和環境生態安全構成了極大的威脅，同時也造成了巨大的經濟損失。抗肝片吸蟲類藥物是目前防治肝片吸蟲病最有效的手段。五氯柳胺(Oxyclozanide)是水楊酰苯胺類化學合成抗肝片吸蟲的藥物，主要用于治療牛和羊的肝片吸蟲感染，在抗絳蟲和線蟲等蠕蟲感染方面也有較好的治療效果。五氯柳胺通過阻礙蟲體線粒體的氧化磷酸化過程，使能量不能合成，蟲體因能量耗盡而死[1]。國外有學者報道五氯柳胺的臨床抗蟲效果顯著，明顯優于阿苯達唑、萘托比胺、氯氰碘柳胺等藥物[2-3]。但是，國內對五氯柳胺的系統性研究報道較少。為了初步評價五氯柳胺的安全性，筆者以小鼠為實驗動物，進行了急性毒性試驗。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物。SPF級昆明系小鼠80只，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所，體重18～22 g，雌雄各半，雌性未產未孕。室溫下飼養3～5 d，自由采食飲水，以適應試驗環境。

1.1.2受試藥品。五氯柳胺原料藥，購自常州亞邦齊暉醫藥化工有限公司，批號為RD1506001。試驗前，精密稱取五氯柳胺原料藥，以羧甲基纖維素鈉為助懸劑，配制0.2 g/mL的混懸劑，待用。

1.2方法

1.2.1預試驗。采用遞加法進行預試驗。將20只昆明系小鼠，體重為18～22 g，平均分為5組，每組4只，雌雄各半，分別給小鼠稱重，計算給藥劑量。最高劑量組給藥劑量為3.375 g/kg BW，最低劑量組給藥劑量為0.667 g/kg BW。試驗前，禁食8～12 h，自由飲水。灌胃給藥，觀察7 d，記錄小鼠的死亡數，根據預試驗的最小致死劑量(LD100)和最大耐受劑量(LD0)來確定正式試驗給藥劑量范圍、組數(N)以及各組間劑量比(r)。

1.2.2急性毒性試驗。根據預試驗得到的最小致死劑量(LD100)為3.375 g/kg，最大耐受劑量(LD0)為0.667 g/kg，采用簡化寇氏法計算正式試驗組數以及各組間劑量比。

五氯柳胺正式試驗分為6組，包括5組不同劑量給藥組和1組空白對照組。將60只小鼠，隨機分為6組，5個給藥組的給藥劑量分別為3.375、2.250、1.500、1.000和0.667 g/kg。試驗前，禁食8～12 h，自由飲水。根據體重計算給藥劑量。空白對照組給予等量的飲用水。灌胃給藥后，前3 h持續觀察；3～8 h，每15 min觀察1次；8～12 h，每30 min觀察1次；12 h后，每2 h觀察1次；24 h后，每4 h觀察1次；3 d后，每天觀察3次，直至第7天結束。觀察小鼠的外觀體征、飲食、飲水、精神狀態、行為活動等，記錄小鼠死亡時間、死亡組別和死亡數量，對死亡動物進行剖檢進行切片處理，與空白對照組對比，觀察病理變化。采用改良寇氏法計算LD50及其95%置信區間。

LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]

(1)

(2)

LD50的95%置信區間= lg-1(lgLD50±1.96×SX50)

(3)

式中,Xm為最大劑量的對數；i為組距，相鄰2組劑量對數值之差；p為各劑量組死亡率；q為各劑量組存活率；∑p為各劑量組死亡率之和；n為各組動物數；SX50為lgLD50的標準誤差。

2結果與分析

2.1預試驗結果根據五氯柳胺原料藥急性毒性預試驗得到的最小致死劑量(LD100)為3.375 g/kg，最大耐受劑量(LD0)為0.667 g/kg。因此，確定正式試驗的組數(N)為5，各組之間的劑量比值r為1.5。

2.2急性毒性試驗結果

2.2.1臨床癥狀以及剖檢病理變化。據觀察，給藥后動物表現出的癥狀如下：給藥后出現精神沉郁，伏臥不動，眼睛微閉，被毛凌亂，食欲減退，給藥3 h后出現死亡現象，死亡時間集中在3～12 h，死亡前出現全身震顫、側翻現象，大約持續5 min死亡。給藥36 h后，再無死亡現象，但高劑量存活小鼠依然表現為精神沉郁，3 d后逐漸恢復飲食、飲水。但是，將存活小鼠體重變化與空白組進行對比發現，給藥組小鼠體重增長緩慢。第8天后，對全部小鼠進行剖檢，與空白對照組相比，發現給藥組肝有出血點、脾腫大、腎的質地脆且易碎、胃壁薄而透明等現象，且高劑量組癥狀明顯。

2.2.2半數致死量(LD50)及95%置信區間。五氯柳胺混懸劑試驗組的死亡數如表1所示。小鼠口服五氯柳胺的LD50為1.130 g/kg，95%的置信區間為0.940～1.359 g/kg。

表1　五氯柳胺原料藥正式試驗結果

3討論

該試驗選用SPF級昆明系小鼠為實驗動物，保證實驗動物本身清潔無污染，有效消除試驗誤差。在給藥過程中，嚴格按照灌胃給藥的操作，以防由于灌胃方法不當而導致小鼠死亡，影響試驗結果的準確性。

由于五氯柳胺不溶于水，所以在配制供試品過程中加入羧甲基纖維素鈉作為助懸劑，配制五氯柳胺供試品濃度為0.2 g/mL。但考慮到小鼠的胃容量，一般給藥量為每10 g體重的給藥量為0.1～0.2 mL[4]。因此，在給藥過程中，因為給藥體積過大，需要進行多次給藥，2次給藥時間間隔1～2 h，給藥體積不得超過0.4 mL，防止小鼠因灌胃受試物的體積過大而撐死。

五氯柳胺作為一種高效抗肝片吸蟲化學合成藥物，臨床抗蟲效果顯著。但是，因其水溶性差，有一定的毒性，限制了其臨床應用。研究開發一種或幾種五氯柳胺的上市制劑，對獸醫臨床防治肝片吸蟲病具有重要意義。該試驗結果可為今后五氯柳胺新制劑的開發和臨床安全有效用藥提供參考依據。

參考文獻

[1] 劉祥宜,朱建民,張建峰，等.五氯柳胺的合成[J].浙江化工，2010,41(8):11-12.

[2] SANABRIA R， MORENO L， ALVAREZ L，et al.Efficacy of oxyclozanide against adultParamphistomumleydeniin naturally infected sheep[J].Veterinary parasitology，2014,206:277-281.

[3] ARIAS M S,SANCHIS J,FRANCISCO I,et al.The efficacy of four anthelmintics againstCalicophorondaubneyiin naturally infected dairy cattle[J].Veterinary parasitology,2013,197:126-129.

[4] 農業部獸藥評審中心.獸藥研究技術指導原則匯編[M].北京:化學工業出版社，2012:11.

Study on the Acute Toxicity of Oxyclozanide in Mice by Oral Administration

ZHANG Ji-li, LI Bing, SI Hong-fei, ZHANG Ji-yu*et al

(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS, Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development of Ministry of Agriculture, Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province, Lanzhou, Gansu 730050)

Abstract[Objective] In order to evaluate the safety of Oxyclozanide, the acute toxicity test in mice was conducted. [Method] The incremental method was used to determine the groups and dosage of the formal experiment in preliminary experiment. According to the simplified Karber's method in the formal experiment, after giving medicine lavage and observing for 7 days, the change of sign was observed after administration in mice, the mortality and death time was recorded, the LD50and 95% confidence interval was calculated. [Result] The LD50of Oxyclozanide in mice was 1.130 g/kg and 95% confidence interval was 0.940-1.359 g/kg. [Conclusion] According to the classification of acute toxicity dosages of chemicals, Oxyclozanide is the low toxic chemical.

Key wordsOxyclozanide; Mice; Acute toxicity test; LD50

基金項目“十二五”國家科技支撐計劃項目(2015BAD1101)；國家現代農業產業技術體系專項(CAR-38)。

作者簡介張吉麗(1992- )，女，黑龍江大慶人，碩士研究生，研究方向：動物抗寄生蟲藥。*通訊作者，研究員，博士，博士生導師，從事獸醫藥理學與毒理學研究。

收稿日期2016-03-13

中圖分類號S 865.1+3

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)12-148-02