不同季節(jié)柿葉中黃酮類成分含量的動態(tài)變化及抗氧化活性研究

胡秀梅，鄧向軍，武謙虎

(1.鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江　212002；2.鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江　212000)

◇藥物分析◇

不同季節(jié)柿葉中黃酮類成分含量的動態(tài)變化及抗氧化活性研究

胡秀梅1，鄧向軍1，武謙虎2

(1.鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江212002；2.鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江212000)

摘要：目的研究不同季節(jié)柿葉中蘆丁和總黃酮含量的動態(tài)變化及其抗氧化活性。方法采用反相高效液相色譜法對不同生長季節(jié)柿葉中蘆丁含量進(jìn)行測定；采用紫外分光光度法對不同生長季節(jié)柿葉總黃酮含量進(jìn)行測定；采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力測定和總抗氧化性能測定，研究不同生長季節(jié)柿葉的抗氧化活性。結(jié)果柿葉中蘆丁含量在8月份最高；柿葉中總黃酮含量在9月份最高；柿葉的抗氧化活性9月份最強。結(jié)論柿葉中的黃酮類成分含量和抗氧化活性與生長季節(jié)有關(guān)，柿葉的抗氧化活性還可能與其黃酮類成分含量有關(guān)，為柿葉的采收及應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柿屬;蘆丁;黃酮類;采收期

柿葉為柿樹科(Ebenaceae)柿樹屬(Diospyros)植物柿(DiospyroskakiL.f.)的新鮮或干燥葉，味苦，性寒，具有生津止渴、清熱解毒、潤肺強心、鎮(zhèn)咳止血等功效。柿葉作為藥用，始載于明朝《滇南本草》，曰“經(jīng)霜葉敷臁瘡”；《本草再新》記載用于“治咳嗽吐血，止渴生津”。現(xiàn)代藥理研究表明[1-3]，柿葉及其所含黃酮類、酚類、鞣質(zhì)類等化合物具有抗氧化、抗菌、止血、減肥降脂、降血糖、保護(hù)心血管等作用。Han等[4]研究發(fā)現(xiàn)，柿葉中黃酮類化合物具有明顯的清除自由基效應(yīng)，能明顯抑制人中性粒細(xì)胞中過氧化物的產(chǎn)生。據(jù)此認(rèn)為，柿葉黃酮類化合物具有明顯的抗氧化作用，其有開發(fā)為新型天然抗氧化劑的潛力[5-7]。

目前已有文獻(xiàn)報道[8]采用分光光度法測定柿葉藥材總黃酮含量，但系統(tǒng)研究不同生長季節(jié)柿葉中蘆丁和總黃酮成分含量及其抗氧化活性的動態(tài)變化還未見報道。為此，本實驗采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定柿葉中蘆丁含量；紫外分光光度法測定總黃酮含量；采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力測定和總抗氧化性能測定，對不同采收期柿葉蘆丁、總黃酮含量的動態(tài)變化和抗氧化活性進(jìn)行系統(tǒng)地研究，為柿葉藥材的適時采收利用提供依據(jù)。

1材料與儀器

1.1材料與試劑柿葉，2014年5～11月采自鎮(zhèn)江南山，經(jīng)武謙虎主任中藥師鑒定為柿樹科植物柿DiospyroskakiL.f.的葉，低溫干燥后備用；DPPH，美國Sigma公司；磷酸鈉、鉬酸銨、濃硫酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；色譜分析用甲醇，江蘇漢邦科技有限公司；其余試劑均為分析純。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所，批號：0844-200003。

1.2儀器與設(shè)備JASCO LC1500高效液相色譜系統(tǒng)，日本分光公司；Inertsil ODS-3分析柱，日本 GL Science 公司；UV-2102PCS型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)分析儀器有限公司；HHS-1恒溫水浴鍋，上海浦東躍新科學(xué)儀器廠；MP502B電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；1810-B型自動雙重純水蒸餾器，上海申立玻璃儀器公司。

2方法與結(jié)果

2.1供試品溶液的制備

2.1.1蘆丁供試品溶液的制備前期實驗采用以蘆丁得率為指標(biāo)，響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，確定了柿葉中蘆丁最佳提取工藝為：稱取5 g干燥的柿葉粉末于250 mL的燒瓶中，加入100 mL甲醇，索氏回流提取6 h后，回收甲醇，殘渣用甲醇溶解并定容至100 mL，備用。

2.1.2總黃酮供試品溶液的制備前期實驗采用以總黃酮得率為指標(biāo)，響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，確定了柿葉中總黃酮最佳提取工藝為：柿葉粉末1 g，加70%乙醇20 mL，回流提取3次，每次3 h，過濾回收乙醇后，定容至100 mL量瓶中，得供試品溶液。

2.2對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品10.1 mg，置10 mL容量瓶中，甲醇定容制得濃度為1.01 g·L-1的蘆丁對照品溶液。

2.3空白溶液的制備以甲醇作為空白樣品溶液，精密吸取20 μL進(jìn)樣分析。

2.4色譜條件色譜柱(測定蘆丁)：Kromasil C18柱(250 nm×4.6 nm，5 μm)；測定蘆丁含量的流動相：甲醇—水(49∶51) ，流速1 mL·min-1，檢測波長365 nm；進(jìn)樣量20 μL，按外標(biāo)法計算含量。對照品、空白對照和樣品色譜圖見圖1。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍考察

2.5.1HPLC蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線精密量取一定體積的1.01 g·L-1的蘆丁對照品溶液，用甲醇分別稀釋成 6.31、12.62、25.25、50.5、101 mg·L-1溶液。取上述對照品溶液過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣分析，以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=17 854X+3111.2，r=0.999 9，結(jié)果表明蘆丁在6.31～101 mg·L-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2UV蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線精密量取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于15 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min；再加10% 硝酸鋁1 mL，搖勻，放置6 min；再加1 mol·L-1氫氧化鈉2 mL，加甲醇補至15 mL，搖勻，放置10 min，于510 nm波長下測吸光度。以吸光度A對濃度C線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.002 5X+0.162 3，r=0.999 1。蘆丁在33.67～ 168.33 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

注：蘆丁對照品(A)、空白樣品(B)、柿葉樣品(C)。

圖1HPLC色譜圖

2.6精密度試驗精密量取“2.2” 項中配制的蘆丁對照品溶液，按“2.5.1” 項測定方法連續(xù)進(jìn)樣6次，計算蘆丁峰面積的RSD為1.86%(n=6)。表明HPLC儀器的精密度良好。按“2.5.2” 項測定方法，顯色后測定吸光度，計算吸光度RSD為1.37%(n=6)。實驗表明UV儀器的精密度(重現(xiàn)性)良好。

2.7重復(fù)性試驗精密量取同一批次的蘆丁供試品溶液6份，按“2.5.1” 項測定方法連續(xù)進(jìn)樣6次，計算蘆丁含量的RSD為1.74%(n=6)，實驗表明重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性試驗精密量取蘆丁供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，計算蘆丁峰面積的RSD為1.28 %(n=6)表明蘆丁供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；精密吸取總黃酮供試品溶液，加顯色劑顯色后，每1 h測定一次吸光度，連續(xù)測定6 h，計算吸光度RSD為2.04 %(n=6)表明總黃酮供試品溶液顯色后在6 h內(nèi)顯色穩(wěn)定。

2.9加樣回收率試驗精密稱取已知蘆丁含量的柿葉粉末，加入定量的蘆丁對照品，按“2.1.1”項制備樣品溶液，各平行6份，按“2.5.1” 項測定方法進(jìn)行測定，蘆丁的加樣回收率為99.87%，RSD 為1.13%(n=6)；精密稱取已知總黃酮含量的柿葉粉末，加入定量的蘆丁對照品，按“2.1.2”項制備樣品溶液，各平行6份，按“2.5.2” 項測定方法進(jìn)行測定，取1 mL顯色，總黃酮含量以蘆丁計，計算回收率為99.29%，RSD 為1.46 %(n=6)。

2.10樣品含量測定

2.10.1不同采收期柿葉中蘆丁含量的測定精密稱取不同采收期的柿葉粉末，按“2.1.1”項下方法制備成蘆丁供試品溶液，按“2.5.1” 項測定方法對不同采收期柿葉中蘆丁的含量進(jìn)行測定，每個采收期的柿葉制備3份，每份樣品連續(xù)測定3次，計算蘆丁的平均含量。柿葉蘆丁含量隨生長季節(jié)的變化趨勢見圖2。

圖2　不同采收期柿葉中蘆丁含量動態(tài)變化

2.10.2不同采收期柿葉中總黃酮含量的測定精密稱取不同采收期的柿葉粉末，按“2.1.2”項下方法制備成蘆丁供試品溶液，按“2.5.2” 項測定方法對不同采收期柿葉中總黃酮的含量進(jìn)行測定，每個采收期的柿葉制備3份，每份樣品連續(xù)測定3次，計算總黃酮的平均含量。柿葉總黃酮含量隨生長季節(jié)的變化趨勢見圖3。

圖3　不同采收期柿葉中總黃酮含量動態(tài)變化

2.11不同采收期柿葉的抗氧化活性的測定

2.11.1DPPH自由基清除能力測定精密稱取不同采收期的柿葉粉末，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，稀釋濃度為1 g·L-1，分別取100、200、400、600、800 μL于具塞試管中，各自補充蒸餾水至1 mL，加入去離子水溶液2 mL，0.1 mmol·L-1DPPH溶液(精密稱取4 mg DPPH，用無水乙醇定容至50 mL)1 mL ，搖勻，黑暗處靜置30 min后，用去離子水調(diào)零，測定517 nm處吸光度A樣品，再測定1 mL不用濃度的樣品溶液與3 mL 去離子水混合液在517 nm處的吸光度A對照，同時測定1 mL DPPH溶液與3 mL去離子水在517 nm處的吸光度A空白。VC作陽性對照，DPPH清除率按式(1)計算。柿葉DPPH自由基清除能力隨生長季節(jié)的變化趨勢見圖4。

DPPH清除率=[A空白-(A樣品-A對照)/A空白]×100%

(1)

圖4　不同采收期柿葉清除DPPH能力比較

2.11.2總抗氧化能力的測定精密稱取不同采收期的柿葉粉末，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，稀釋濃度為1 g·L-1，分別取100、200、400、600、800 μL于具塞試管中，各自補充去離子水至1 mL，各加3 mL混合液(精密稱取磷酸鈉1.065 g，鉬酸銨0.494 g，用少量去離子水溶解后加濃硫酸3.28 mL，定容于100 mL容量瓶中得)，加塞于95℃水浴中加熱90 min，取出后流水冷卻至室溫，用去離子水調(diào)零，在695 nm處測定吸光度。依據(jù)波長695 nm處的吸光度變化來衡量不同采收期的柿葉總抗氧化性能的高低。柿葉總抗氧化能力隨生長季節(jié)的變化趨勢見圖5。

3討論

本實驗系統(tǒng)研究了不同生長季節(jié)的柿葉中蘆丁和總黃酮含量的動態(tài)變化以及其抗氧化活性的變化，不同生長季節(jié)的柿葉中蘆丁和總黃酮含量均有一定的差異性，且抗氧化活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

圖5　不同采收期柿葉總抗氧化能力比較(A=695 nm)

不同生長季節(jié)的柿葉中，蘆丁含量從5月份開始逐漸升高，到8月份含量達(dá)到最高，之后又開始降低，10月份霜降以后，含量急劇下降。柿葉總黃酮含量變化趨勢與蘆丁基本相同，即含量從5月份開始逐漸升高，到9月份含量達(dá)到最高，9月份以后又開始降低，10月霜降以后含量急劇降低。這些變化提示，柿葉中蘆丁和總黃酮含量含量可能與溫度有關(guān)，7、8、9月份氣溫高，黃酮成分含量升高，10月份霜降后溫度降低，黃酮成分含量下降，這與韓衛(wèi)娟等[9]研究不同(品)柿葉中總黃酮含量年動態(tài)變化基本一致，總黃酮含量高峰時期分別集中在7月和8月中下旬。但具體機制有待進(jìn)一步研究。

不同生長季節(jié)的柿葉均具有一定的清除DPPH能力，且隨著各濃度的增大，清除DPPH自由基能力逐漸呈上升趨勢。而在一定濃度范圍內(nèi)，柿葉清除DPPH能力從5月份開始逐漸增強，8、9月份最強，9月份強與陽性對照Vc相當(dāng)，10、11月份又逐漸降低。同樣，不同生長季節(jié)的柿葉也具有一定的總抗氧化的能力，且隨著各濃度的增大，總抗氧化的能力逐漸呈上升趨勢。而在一定濃度范圍內(nèi)，柿葉總抗氧化的能力從5月份開始顯著增強，8、9月份最強，與陽性對照Vc相當(dāng)，10、11月份又明顯降低，變化趨勢較明顯。總之，不同生長季節(jié)的柿葉都具有一定的抗氧化能力，但存在一定的變化趨勢，其與黃酮類成分含量的動態(tài)變化趨勢相同，表明不同生長季節(jié)的柿葉的抗氧化活性可能與其黃酮類成分含量有關(guān)，孫彩云等[10]半仿生提取柿葉黃酮也證明了柿葉總黃酮對油脂過氧化、DPPH 自由基、羥基自由基、超氧自由基均有一定的抑制作用。結(jié)果表明柿葉黃酮類化合物是一種很有潛力的天然、安全、高效的抗氧化劑[11]。但其具體機制有待進(jìn)一步研究。

本實驗初步揭示了不同生長季節(jié)柿葉中蘆丁和總黃酮含量及其抗氧化活性的變化規(guī)律，實驗結(jié)果提示在柿葉的利用上，應(yīng)重視其不同季節(jié)所含的成分和活性的變化，根據(jù)柿葉不同有效成分的功效，合理安排采收時間以利于柿葉資源和產(chǎn)品開發(fā)[12]及臨床應(yīng)用。

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Dynamic change of flavonoids content and the antioxidant activities in persimmon leaves from different growing seasons

HU Xiu-mei1，DENG Xiang-jun1，WU Qian-hu2

(1.TheFirstPeople’sHospital,Zhenjiang,Jiangsu212002,China;2.TheThirdPeople’sHospital,Zhenjiang,Jiangsu212000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the variation of rutin and total flavonoids content and the antioxidant activities in persimmon leaves from different growing seasons.MethodsThe rutin content was determined by high performance liquid chromatography.The total flavonoids content was determined by UV.The antioxidant activities in persimmon leaves from different growing seasons were evaluated with DPPH radical scavenging assay and total antioxidant assay.ResultsRutin and total flavonoids reached their highest contents in persimmon leaves in August and September respetively.The antioxidant activity reached highest in persimmon leaves in September.ConclusionsThe flavonoid content and antioxidant activity of persimmon leaves were associated with the growing seasons,and antioxidant activity may also be associated with flavonoids content of persimmon leaves,which provided certain scientific basis for the collection and application of persimmon leaves.

Key words:Diospyros;Rutin;Flavones;Collecting Periods

通信作者:武謙虎，男，主任中藥師， 研究方向:中藥藥理學(xué)及臨床藥學(xué),E-mail:wuqihu2003@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.011

(收稿日期：2016-01-25，修回日期：2016-03-14)