銀杏4-香豆酸輔酶 A 連接酶基因的克隆與序列分析

雷靜，許鋒，王曉輝，張威威，廖詠玲

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州434025)

銀杏4-香豆酸輔酶 A 連接酶基因的克隆與序列分析

雷靜，許鋒，王曉輝，張威威，廖詠玲

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州434025)

[摘要]根據銀杏(Ginkgo biloba L.)轉錄組中的基因序列設計引物，從銀杏中克隆到了4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)的cDNA片段，命名為Gb4CL，GenBank 登錄號為KU820947。Gb4CL全長1736bp，含有1個1671bp的ORF，編碼557個氨基酸。核苷酸和蛋白質序列多重比較結果顯示，Gb4CL與其他植物的4CL基因的核苷酸與蛋白質序列均高度同源。Gb4CL編碼的蛋白質與日本柳杉(Cryptomeria japonica)、白豆杉(Pseudotaxus chienii)、北美云杉(Picea sitchensis)的4CL氨基酸同源性分別為82%、83%、80%。4CL系統進化樹顯示，Gb4CL與裸子植物親緣關系最近。該研究通過克隆Gb4CL基因，并進行相關的生物信息學分析，可為掌握銀杏木質素生物合成中關鍵基因的調控機理提供參考。

[關鍵詞]銀杏(Ginkgo biloba L.)；4CL；基因克隆；序列分析

銀杏(GinkgobilobaL.)是我國特產的古老珍貴樹種，具有極高的經濟、生態、觀賞和科研價值，其藥用價值也已受到世界范圍內研究者廣泛關注。銀杏葉片主要含有2種活性成分——黃酮類化合物(Flavonoids)和萜內酯(銀杏內酯 Ginkgolides)。其中木質素合成涉及到的重要次生代謝途徑，即苯丙氨酸代謝途徑(phenylpropanoid pathway)中生成的如香豆素、黃酮醇、木質素、軟木酷及其他的苯類化合物，對植物維持細胞壁結構、抗病害、抗紫外線損傷、作為花粉發育和植物與微生物相互作用的信號分子等生長與發育過程作用顯著[1,2]。同時在人類生活中這類次生代謝產物還可作為藥物、食品添加劑、芳香劑、染料等，具有極大的經濟和社會價值。因此利用基因工程手段研究改造相關基因次生代謝產物的合成具有重大的實際意義。

4-香豆酸輔酶 A 連接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)是苯丙氨酸途徑中的關鍵性限速酶，作用于苯丙酸途徑中最后一步反應，分別催化p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸生成相應的輔酶A(CoA)酯，這些硫酯處于苯丙酸代謝途徑和各種末端產物特異合成途徑的分支點，其中生成的香豆酰CoA、阿魏酰CoA 及芥子酰CoA 轉化為肉桂醇衍生物后，通過還原反應生成木質素單體[3]。人們對4CL有較為明確的認識始自4CL基因的克隆。迄今已從多種植物中分離到編碼4CL的基因，如歐芹(Petroselinumcrispum)[4]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[5]、火炬松(Pinustaeda)[6]、煙草(Nicotianatabacum)[7]、大豆(Glycinemax)[8]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[9]、花楸(Sorbusaucuparia)[10]、小立碗蘚(Physcomitrellapatens)[11]、鈍鯪紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)[12]等。而有關銀杏4CL基因克隆的研究尚未見報道。為此，本研究以銀杏為材料，對其4CL基因進行克隆，并做相關核苷酸、蛋白質、進化樹分析研究，以期為進一步研究銀杏4CL基因的功能提供參考。

1材料與方法

1.1材料

銀杏取自長江大學銀杏科技園，品種為家佛手，取十五年生銀杏的葉，采集后液氮速凍存放于-80℃冰箱中。

實驗所用大腸桿菌DH5α為長江大學園藝園林學院園藝生物技術實驗室保存，pMD18-T vector kit購自香港Invitrogen公司，AMV反轉錄酶、dNTPs、RNasin和TaqDNA聚合酶購自美國Promega(Madison,WI,USA)公司。引物合成及序列測定由上海生工生物工程技術服務有限公司(Shanghai Sangon Biotechnology Company China)完成。

1.2方法

1.2.1總 RNA 的提取

按照蔡榮等[13]的方法提取銀杏葉的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計分析總RNA 的純度和濃度，保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.2銀杏4CL基因cDNA的克隆

取銀杏葉總RNA1μg用于cDNA第一鏈的合成，具體操作按照AMV Reverse Transcriptase kit說明書。根據銀杏轉錄組中4CL基因序列設計引物，上游引物Gb4CLup:5’-ATGGCTCTTATTGCGCCTTCT-3’;下游引物Gb4CLdown:5’-GCATTTGTGACGCACGAGAA-3’，以合成的cDNA第一鏈為模板，擴增得到銀杏4CL基因開放閱讀框(ORF)序列。反應程序為：94℃預變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共32個循環；最后于72℃下延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物，并用高純度 PCR 產物純化試劑盒回收 PCR 產物。按照pMD18-T 載體試劑盒說明書，將回收片段與pMD18-T 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α菌株，選取陽性克隆提取質粒DNA，經酶切鑒定后測序。

1.2.3生物信息學分析

M.DL2000 DNA Marker；1.Gb4CL基因PCR擴增產物圖1　Gb4CL基因片段PCR擴增圖

Gb4CL基因cDNA序列的ORF查找及翻譯借助DNAMAN 6.0和Vector NTI 10.0完成，核酸和蛋白質同源性分析在NCBI(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST/)上用BLAST 完成。然后利用Vector NTI 10.0完成4CL氨基酸序列比對，通過Clustal X1.83和MEGA 4.0 構建4CL基因的分子進化樹，并進行Bootstrap檢測。

2結果與分析

2.1Gb4CL 基因cDNA克隆及其核苷酸序列分析

以合成的銀杏cDNA第一條鏈為模板，利用Gb4CLup和Gb4CLdown引物組合，通過RT-PCR方法克隆得到的銀杏4CL基因cDNA片段，命名為Gb4CL，GenBank 登錄號為KU820947,PCR擴增電泳結果見圖1。該片段克隆測序全長為1736bp，ORF有1671bp，編碼557個氨基酸。核苷酸序列比對顯示，該片段與其他植物4CL基因序列相似性大于70%(表1)，如與芝麻(Sesamumindicum)4CL的同源性為73%，與馬鈴薯(Solanumtubero-

表1　銀杏4CL基因與其他植物4CL基因核苷酸序列同源性比較

sum)、番茄(Solanumpennellii)、潘那利番茄(Solanumlycopersicum) 4CL的同源性均為70%。因此，可以初步推測該片段為銀杏4CL基因家族成員之一。

2.2Gb4CL 蛋白質分析

根據Gb4CL核苷酸序列的ORF推測的4CL氨基酸序列結果見圖2。利用 Computer pI/Mw軟件分析推Gb4CL蛋白質等電點和分子量分別為 5.62和60ku，與所報道的其他植物的4CL蛋白質性質相似。利用Vector NTI 10.0對Gb4CL蛋白質序列與其他植物4CL蛋白質序列進行比較。Gb4CL多肽與其他植物4CL氨基酸序列之間的相似性大于70%(圖3)，與同為裸子植物的日本柳杉(Cryptomeriajaponica，AFJ73433.1)、白豆杉(Pseudotaxuschienii，AFJ73459.1)、北美云杉(Piceasitchensis，ABR17998.1)的同源性分別為82%、83%、80%，與錘枝樺(Betulapendula，AIR95613.1)和可可(Theobromacacao，XP_007014191.1)的同源性為71%，與土肉桂(Cinnamomumosmophloeum，AFG26323.1)、水曲柳(Fraxinusmandshurica，AHL44986.1)和甜椒(Capsicumannuum，ACF17632.1)的同源性為70%，說明 Gb4CL與其他植物中4CL蛋白質的序列和功能極為相似。

Gb4CL序列中也具有完整保守的功能結構域(motif)，如圖3中肽基序BOXI在4CL蛋白序列中幾乎絕對保守，被認為是4CL催化反應中保守的AMP結合功能域，負責催化木質素合成途徑中4-香豆酸和輔酶A的連接，而且與熒光素酶、長鏈脂肪酰基2CoA合成酶、肽合成酶中發現的保守基序相似，也是腺苷酸形成酶超家族(the superfamily of adenylate-forming enzymes)的分類依據之一[14]。肽基序BOXII在所有 4CL 中絕對保守，其中甘氨酸Gly(G)、谷氨酸Glu(E)、半胱氨酸Cys(C)是最為保守的氨基酸位點，且中心的 C 殘基被認為直接參與催化進程[15]。這與黃勝雄等[16]的研究相一致。

方框中為起始子和終止子，下劃線為特異引物Gb4Clup和Gb4Cldown圖2　Gb4CL基因核酸序列及其所推導的氨基酸序列

氨基酸完全一致的序列用黑底白字表示，完全不相似氨基酸序列用白底黑字表示，部分相似的氨基酸序列用灰底黑字表示。BOX I表示保守的AMP結合功能域;BOX II表示GEICIRG保守區。蛋白質簡稱、植物學名及GenBank登錄號如下：Cj4CL日本柳杉(Cryptomeria japonica)，AFJ73433.1；Pc4CL白豆杉(Pseudotaxus chienii)，AFJ73459.1；Ps4CL北美云杉(Picea sitchensis)，ABR17998.1；Bp4CL錘枝樺(Betula pendula)，AIR95613.1；Tc4CL可可(Theobroma cacao)，XP_007014191.1；Ca4CL甜椒(Capsicum annuum)，ACF17632.1；Fm4CL水曲柳(Fraxinus mandshurica)，AHL44986.1；Co4CL土肉桂(Cinnamomum osmophloeum)，AFG26323.1圖3　Gb4CL蛋白質與其他植物4CL蛋白質氨基酸序列的多重比較

圖4　Gb4CL蛋白與其他植物4CL蛋白氨基酸序列的系統進化樹

2.3Gb4CL 分子進化分析

利用軟件 Clustal x 1.83 和 MEGA 4.0通過 Neighbor-joining(NJ)方法構建了Gb4CL 的系統進化樹(圖4)。分析表明：在裸子植物(Gymnosperm)、單子葉植物(Monocotyledon)、雙子葉植物(Dicotyledon)和真菌(Eumycete)中4CL都有相同的進化起源，4CL基因家族在進化上存在一定的保守性，銀杏Gb4CL蛋白與同一分類中的水杉(Metasequoiaglyptostroboides，AFJ73430.1)、白豆杉(Pseudotaxuschienii，AFJ73459.1)、日本柳杉(Cryptomeriajaponica，AFJ73433.1)的親緣性最近，與同一分類中的其他松科植物北美云杉(Piceasitchensis，ABR17998.1)、馬尾松(Pinusmassoniana，ACO40513.1)、火炬松(Pinustaeda，AAA92669.1)、輻射松(Pinusradiata，ACF35279.1)同源性也達到80%，在進化距離上較單子葉植物而言，裸子植物4CL與雙子葉植物親緣關系更近，處于同一分支上，與真菌類親緣關系最遠，這表明在裸子植物和被子植物分化之前這些4CL基因就已經存在于植物中，在植物中的進化時間超前于裸子植物和被子植物分化的時間。

3小結與討論

本研究首次從銀杏中克隆得到其4CL基因，并將其命名為Gb4CL，利用生物信息學軟件進行多序列比對分析，結果顯示Gb4CL與其他植物已分離的4CL基因有較高的同源性，并含有共同的功能結構域BOXI(PYSSGTTGLPKLGV)和BOX II(GEICIRG)。4CL基因在植物中多是以基因家族的形式存在的，目前發現的4CL基因可分為2類：Ⅰ類的4CLs主要與木質素的生物合成有關，Ⅱ類的4CLs主要調控類黃酮的生物合成[17]。目前已有多項研究顯示通過抑制4CL基因活性可以降低植物中木質素含量，4CL基因的過量表達可以增加木質素的含量，進而增強植物抗病性和抗倒伏能力[18～20]，而對4CL基因的正向或負向調控可能僅僅只是影響了木質素的合成，對苯丙氨酸途徑中其他次生代謝產物的合成影響不大，不干擾植物的正常生長發育[19,21]。開展植物木質素生物合成途徑的研究，不僅是在模式植物，而且在一些木本植物如銀杏中同樣有利于更好地揭示植物次生代謝途徑在木質素積累中的調控作用。由于銀杏具有極大的生物效能，因此進行銀杏次生代謝過程中相關基因的克隆和鑒定對其生物工程改良具有很大的推動作用。

[參考文獻]

[1]Fukasawa-Akada T,Kung S,Watson J C.Phenylalanineammonia-lyasegene structure,expression,andevolution inNicotiana[J].Plant Mol Biol,1996,30:711～722.

[2]Zhong R,Morrison W H,Himmelsbach D S,etal.Essential role of caffeoyl Co-enzyme A O-methyltransferase in lignin biosynthesis in woody poplar plants[J].Plant Physiol,2000,124:563～578.

[3]Whetten R,Sederoff R.Lignin biosynthesis[J].Plant Cell,1995,7:1001～1013.

[4]Neutaedter D A,Lee S P,Douglas C J.A novel parsley 4CL1 cis-element is required for developmentally regulated expression and protein-DNA complex formation[J].Plant J,1999,18:77～88.

[5]Becker-André M,Schulze-Lefert P,Hahlbrock K.Structural comparison,modes of expression,and putative cis-acting elements of the two 4-coumarate:CoA ligase genes inpotato[J].J Biol Chem,1991,266:8551～8559.

[6]Zhang X,Chiang V.Molecular cloning of 4-coumarate:coenzyme A ligase inloblollypineand the roles of thisenzyme in the biosynthesis of lignin in compression wood[J].Plant Physiol,1997,113:65～74.

[7]Lee D,Douglas C J.Two divergent members of a tobacco4-coumarate:coenzyme A ligase (4CL) gene family[J].Plant Physiol,1996,112:193～205.

[8]Lindermayr C,M?llers B,Fliegmannm J,etal.Divergent members of asoybean (GlycinemaxL.) 4-coumarate:coenzyme A ligasegene family:Primary structures,catalytic properties,and differential expression[J].Eur J Biochem,2002,269:1304～1315.

[9]Yi Li,Kim J I,Pysh L,etal.Four isoforms ofArabidopsisthaliana4-coumarate:CoA ligase (4CL) haveoverlapping yet distinct roles in phenylpropanoid metabolism[J].Plant Physiol,2015,10:1～37.

[10]Gaid M M,Scharnhop H,Ramadan Hn,etal.4-Coumarate:CoA ligase family members from elicitor-treatedSorbusaucupariacell cultures[J].J Plant Physiol,2011,168:944～951.

[11]Silber M V,Meimberg H,Ebela J.Identification of a 4-coumarate:CoA ligase gene family in the moss,Physcomitrellapatens[J].Phytochemistry,2008,69:2449～2456.

[12]Shuai G,Hai N,Rui X,etal.Cloning and functional characterization of a 4-coumarate CoA ligasefrom liverwortPlagiochasmaappendiculatum[J].Phytochemistry,2015,111:48～58.

[13]蔡榮,許鋒,陳柳吉,等.銀杏不同組織的總RNA提取方法的改進[J]．生物技術，2007，17(4)：38～41．

[14]Fulda M,Heinz E,Wolter F P.The fadD gene ofEscherichiacoliK12 is located close tornd at 39.6 min of the chromosomal mapand is a new member of the AMP-binding protein family[J].Mol Gen Genet,1994,242:241～249.

[15]Stuible H,Kombrink E.Identification of the substrate specificity-conferring amino acid residues of 4-coumarate：Coenzyme A ligase allowsthe rational design of mutant enzymes with new catalytic properties[J].J Biol Chem,2001,276:26893～26897.

[16]黃勝雄,胡尚連,孫霞,等.木質素生物合成酶4CL基因的遺傳進化分析[J].西北農林科技大學學報(自然科學版),2008,36(10):199～206．

[17]Wei X,Wang X.Evolution of 4-coumarate:coenzyme A ligase(4CL) gene and divergence ofLarix(Pinaceae)[J].Mol Phylogenet Evol,2004,31:542～553.

[18]賈彩紅,趙華燕,王宏芝,等.抑制4CL基因表達獲得低木轉基因毛白楊[J].科學通報,2004,49(7):662～666.

[19]楊向東,王漢中,胡贊民,等.毛白楊4CLcDNA的克隆、表達及活性分析[J].華中農業大學學報,2006,25(2):101～105.

[20]黃杰恒,李威,曲存民,等.甘藍型油菜不同抗倒性材料中木質素代謝途徑關鍵基因表達特點[J].作物學報,2013,39(8):1339～1344.

[21]Hu J,Li G,Struss D,etal.SCAR and RAPD markers associated with 18 carbon fatty acids in rapeseed,Brassicanapus[J].Plant Breed,1999,118:145～150.

[收稿日期]2016-03-03

[基金項目]國家自然科學基金項目(31000904)。

[作者簡介]雷靜 (1989-)，女，碩士生，研究方向為林木遺傳育種。通信作者：許鋒，xufeng198@126.com。

[中圖分類號]Q785

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)15-0042-07

[引著格式]雷靜，許鋒，王曉輝，等.銀杏4-香豆酸輔酶 A 連接酶基因的克隆與序列分析[J].長江大學學報(自科版) ，2016，13(15)：42～48.