3株中度嗜鹽菌的分離鑒定與生長特性研究

周芳芳，熊濤

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

3株中度嗜鹽菌的分離鑒定與生長特性研究

周芳芳，熊濤

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

[摘要]將湖北省荊州拍馬造紙廠的高鹽污水，采用平板劃線法篩選并純化培養后，得到3株單菌落，通過觀察菌落的顏色、形狀和鞭毛等特征，將菌液進行革蘭氏染色試驗、需氧性試驗和淀粉水解等生理生化試驗，可將這3株菌株初步鑒定為鹽單胞菌屬(Halomonas)，都屬于中度嗜鹽菌。耐鹽度試驗結果顯示，3株菌株能在1.5%～20.0%NaCl中生長，且最適生長濃度為12.0%。pH生長試驗表明最適生長pH為7.0。

[關鍵詞]高鹽污水；中度嗜鹽微生物；鹽單胞菌屬(Halomonas)

中度嗜鹽菌的分布廣泛,鹽生長濃度寬(但通常要低一些),對營養的要求低，易于適應環境[3]。中度嗜鹽菌的用途很廣泛且由來已久，比如Tetragenococcus的菌株很久以前就被用于食品如醬油等的發酵中。人們對它們潛在的生物技術應用充滿了興趣。目前對中度嗜鹽菌應用方面的研究主要集中在對它們產生的酶和一些功能性分子、大分子多聚物以及生物環保等方面[4,5]。本研究從高鹽污水中分離出3株嗜鹽菌，通過對不同鹽濃度下的生長情況及生理生化特性分析，確定為中度嗜鹽菌,可為研究中度嗜鹽菌在生物技術應用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗所用高鹽污水來自湖北省荊州拍馬造紙廠。

1.2方法

1.2.1培養基配制

CM培養基:將酸性水解酪蛋白7.5g、酵母浸出物10g、檸檬酸鈉3g、MgSO4·7H2O 20g、KCl 2g、檸檬酸鐵0.004g、NaCl 98.9g加水至1000mL[6]。

Gibbons改良培養基:將酪蛋白氨基酸5g、酵母浸出物10g、細菌蛋白胨5g、檸檬酸鈉3g、KCl 2g、MgSO4·7H2O 20g、NaCl 120g、瓊脂18g加水至1000mL[7]。

ATCC213培養基: MgSO4·7H2O 20g、KCl 5g、CaCl2·6H2O 0.2g、酵母提取物10g、Tryptone 5g、NaCl 180g加水至1000mL[8]。

1.2.2菌株的篩選、分離與純化

菌株的篩選：采用恒溫搖床培養,各取0.2mL水樣分別加入到3支裝有150mL CM培養基的三角瓶中,放入到30℃150r/min的搖床中培養5d。

菌株的分離：將培養液稀釋到10-6,準確吸取適當稀釋度的菌液0.1mL均勻涂布在含12%NaCl Gibbons平板上,在37℃培養24h,觀察菌落形態[9]。

菌株的純化：分別用接種環挑取不同菌落,用劃線法在改良的Gibbons培養基上純化分離出來的菌種,固體培養于加有少量蒸餾水的塑料袋中,放入37℃恒溫培養箱中培養1周后挑選單菌落,反復劃線,直至獲得純菌[10]，并做好標記。

1.2.3形態學特征觀察

觀察菌落形狀、顏色、大小、濕度、透明度、邊緣及有無鞭毛等形態特征。

1.2.4耐鹽菌和嗜鹽菌的鑒別

將分離純化的菌株分別浸泡在蒸餾水中放置24h后，用光學顯微鏡觀察到這3種菌有變形和破壁的現象發生。

1.2.5生理生化特性試驗

包括革蘭氏染色試驗、甲基紅試驗、需氧性試驗、明膠液化試驗、纖維素分解試驗、乙酰甲基醇反應、檸檬酸反應，是否產生吲哚、產氨試驗，是否水解淀粉試驗。

1.2.6最適生長pH的測定

將所分離出來的3株菌株按2% 的接菌量分別接入到不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的改良Gibbons固體培養基中，37℃培養，觀察是否生長并做好標記。

1.2.7耐鹽性測定

配制NaCl%為0.0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0的ATCC213液體培養基，以5%的接菌量接種，37℃搖床振蕩培養2～7d，用722型分光光度計于 460nm波長處測光密度值。

1.2.8藥敏試驗

將分別浸有青霉素、卡拉霉素、慶大霉素、氯霉素、氧氟沙星和利福平等抗生素的厚濾紙片放在預先涂布好細菌的Gibbons培養基上，于37℃培養，觀察抗菌素對它們有無抑制作用。

2結果與分析

2.1菌落形態

圖1　初次篩選的菌落形態

經過初篩，分離出淡粉色、乳白色、橙黃色3種顏色的菌落(圖1)。淡粉色菌落為小的圓形菌落，規則、濕潤、有光澤；乳白色菌落為大而不規則的圓形菌落，濕潤、有光澤；橙黃色菌落為大的圓形菌落，規則、濕潤、有光澤。

采用劃線平板法將3種顏色的菌落分別純化培養后，得到3株菌株分別暫定為1號(淡粉色)、2號(乳白色)、3號(橙黃色)菌株。其形態特征分別如圖2和表1所示。

由文獻[11]可知，嗜鹽菌和耐鹽菌多數呈淡乳色、淡粉、淡黃及橙黃色的圓形菌落。為此，將3種菌株分別浸泡在蒸餾水中放置24h后，用光學顯微鏡觀察到這3種菌株是否有變形和破壁的現象發生，以鑒別它們是耐鹽菌還是嗜鹽菌。試驗結果表明，3種菌株在蒸餾水中放置24h有變形和破壁現象。根據文獻[12]可判定分離出來的3種菌株并不是耐鹽菌，而為嗜鹽菌。

圖2　3種顏色的菌落純化培養結果

1號菌株2號菌株3號菌株顏色淡粉乳白橙黃細胞形狀桿狀桿狀短桿運動性+--鞭毛單鞭毛周毛周毛

表2　3株菌株的生理生化特性

注：“+”陽性；“-”陰性。

表3　菌株在不同pH下生長情況

注：“”表示生長良好；“+”表示生長；“-”表示不生長。

2.2生理生化特征

3種菌株的生理生化試驗結果如表2所示。根據生理生化特性，結合菌落的形態特征，也可初步判定分離的3株菌株是嗜鹽菌。

圖3　不同NaCl濃度下3株菌株的生長情況

2.3最適生長pH

菌株在不同pH下生長情況如表3所示，可見3株菌株生長的最適pH均為7。

2.4耐鹽度曲線

3種菌株的最適NaCl濃度均為12.0%，且在鹽濃度低于1.5%和高于20.0%時均不生長，從圖3明顯可見3種菌株的生長速度依次是：2號>3號>1號。

2.5藥敏試驗結果

1號菌株對氯霉素、利富平、氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素敏感，對氧氟沙 星不敏感；2號菌株對氯霉素、利富平、氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素敏感，對氧氟沙星不敏感，且生長旺盛；3號菌株對氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、氧氟沙星不敏感，但對氯霉素、利富平敏感。

3討論

根據其形態及生理生化、藥敏試驗結果并參考伯杰氏細菌手冊可知，本研究分離出的3種菌株符合鹽單胞菌屬的特征，即能在含1.5%～20.0%NaCl的培養基中生長,其最適NaCl生長濃度為12.0%,在蒸餾水中有變形和破壁的現象,為革蘭氏陰性桿菌,好氧或兼氧,極生叢毛運動或不運動,不液化明膠,產H2S,pH生長范圍在5.5～8.0之間,最適pH在7.0左右。但具體種類還有待于DNA雜交以及16S rDNA序列分析后才能最終做出結論。

由于造紙廠廢水、砷礦廢水及許多人類活動造成的小環境是高鹽或高鹽堿的，而中度嗜鹽菌在這類環境中可以很好地生存，而且中度嗜鹽菌作為最基礎的代謝者，配合著酵母、原蟲等其他微生物，可以將許多對人類和動植物有害的物質改造成為低害甚至無害的物質釋放出來，所以，中度嗜鹽菌的這一生理特點，使得其在環保方面有良好的應用前景。

[參考文獻]

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[11]迪麗拜爾·托乎提，徐曉晶.新疆艾丁湖及鄰近地區嗜鹽菌和耐鹽菌的數量分布[J].生態學報，2001，21(8)：1387～1391.

[12]曾靜，竇岳坦，楊蘇聲.新疆地區鹽湖的中度嗜鹽菌的16S rDNAPCR-RFLP分析[J].微生物學通報，2000，27(5)：327～330.

[收稿日期]2016-02-28

[作者簡介]周芳芳 (1989-)，女，碩士生，研究方向為動物基因工程疫苗。通信作者：熊濤，xiongtao@hotmail.com。

[中圖分類號]X172

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)15-0059-04

[引著格式]周芳芳，熊濤.3株中度嗜鹽菌的分離鑒定與生長特性研究[J].長江大學學報(自科版) ，2016，13(15)：59～62.