中等強度靜磁場對THP-1細胞分泌炎癥因子的影響

郭志霞，毛立斌，王會琴，張蕊，張同存

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中等強度靜磁場對THP-1細胞分泌炎癥因子的影響

郭志霞1，毛立斌1，王會琴2，張蕊2，張同存1

摘要:目的觀察中等強度靜磁場對人單核細胞白血病細胞THP-1增殖和炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-8分泌的影響。方法取對數生長期THP-1細胞，分為對照組和磁場處理組，利用60 mT、200 mT、400 mT的靜磁場分別作用細胞18 h、24 h，、48 h后，CCK-8法檢測細胞增殖情況。另取細胞分為對照組、磁場處理組、脂多糖（LPS）活化組、LPS+磁場組。利用60 mT、200 mT、400 mT的靜磁場分別作用磁場處理組和LPS+磁場組18 h、24 h、48 h后，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測各組TNF-α、IL-6、IL-8的水平。結果（1）與對照組相比，3種強度磁場處理組對THP-1細胞增殖無明顯影響（P＞0.05）。（2）各組24 h時TNF-α、IL-6水平較18 h升高，IL-8則無明顯變化。而48 h與24 h相比較，TNF-α出現下降，IL-6無明顯變化，IL-8出現升高。3個時點LPS活化組TNF-α、IL-6、IL-8水平較對照組及磁場處理組升高，經過磁場處理后，LPS+磁場組IL-6、IL-8、TNF-α水平均較LPS活化組下降（P＜0.05）。結論靜磁場對THP-1細胞釋放炎癥因子有一定抑制作用，可為類風濕關節炎的治療提供理論依據。

關鍵詞:類風濕關節炎；靜磁場；THP-1細胞；炎癥因子；脂多糖；酶聯免疫吸附試驗；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-6；白細胞介素-8

作者單位：1天津科技大學生物工程學院分子藥理學和分子生物學研究室（郵編300457），2工業發酵微生物教育部重點實驗室

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis, RA）是以關節滑膜慢性炎癥為特點的自身免疫性疾病，巨噬細胞在RA的發病過程中起重要作用[1-2]。目前臨床上主要使用抗炎藥物控制炎癥發展，但長期用藥存在不良反應[3]。近年來，磁療法因具有費用低、簡便易行、安全無創等優點，被初步用于RA臨床治療。但是由于磁場規格不盡相同，其作用機制尚不明確，限制了磁場的應用[4]。THP-1細胞株來源于急性單核細胞白血病患者，具有典型單核細胞特征，在佛波酯(PMA)的作用下成熟為巨噬細胞。多項研究證實THP-1細胞可作為RA的發病機制研究的體外模型[5-7]。本文旨在探究不同強度的靜磁場對THP-1細胞的作用，為磁療法在臨床上治療關節炎提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1試劑與磁場設備

1.1.1試劑PMA購自Sigma，脂多糖(LPS)購自碧云天，人腫瘤壞死因子(TNF)-α、人白細胞介素（IL）-6、IL-8、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自貝茵萊公司，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自奕源生物，RPMI-1640培養基購自GIBCO，胎牛血清購自四季青。

1.1.2磁場設備60 mT、200 mT、400 mT靜磁場由德中利德（天津）生物技術有限公司提供，靜磁體規格：Φ35 mm×20 mm×10 mm，見圖1。

Fig. 1 Schematic diagram of static magnetic field圖1靜磁體規格示意圖

1.2方法

1.2.1細胞培養THP-1（購自上海中國科學院細胞庫）在37℃，5%CO2條件下培養于含10%胎牛血清，100 U/mL青

霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基。取對數生長期的細胞進行實驗，實驗前用臺盼藍拒染法檢測細胞活力＞95%。

1.2.2靜磁場處理以及細胞增殖情況檢測細胞以1×105個/mL每孔100 μL接種于96孔板中，分為對照組和磁場處理組，每組設4個復孔。磁場處理組分別置于60 mT、200 mT、400 mT靜磁場上曝磁18 h、24 h、48 h，對照組在未充磁靜磁場上放置18 h、24 h、48 h。靜磁場處理后每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃避光孵育2 h，酶標儀于490 nm處測定光密度（OD）值，實驗重復3次。

1.2.3 THP-1細胞活化及炎癥因子測定THP-1細胞分為對照組、磁場處理組、LPS活化組[細胞經PMA（150 μg/L）誘導24 h，分化為成熟巨噬細胞。饑餓處理12 h后，加入LPS （1 mg/L）活化24 h；更換含血清培養基正常培養，即為活化后的THP-1細胞]、LPS+磁場組，每組設3個復孔。磁場處理組和LPS+磁場組分別置于60 mT、200 mT、400 mT靜磁場上作用18 h、24 h、48 h，對照組及LPS活化組在未充磁靜磁場上放置相應時間。曝磁結束后收集各組上清，按照ELISA試劑盒說明書操作測定各組IL-6、IL-8、TNF-α水平，在450 nm波長處測定OD值。根據標準曲線計算出待測炎癥因子的濃度。

1.3統計學方法應用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x ±s）表示，2組間均數的比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1靜磁場對THP-1細胞生長情況的影響與對照組相比，60 mT、200 mT、400 mT靜磁場對細胞生長情況無明顯影響(P＞0.05)，且隨著磁暴時間的延長，細胞生長情況差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.2靜磁場對THP-1細胞分泌炎癥因子的影響

2.2.1 TNF-α組內不同時間比較：3種磁場強度下，24 h時各組內TNF-α水平較18 h升高，而到48 h時則出現下降（P＜0.05）。組間比較：LPS活化組THP-1細胞TNF-α表達水平較對照組和磁場處理組升高（P＜0.05），經過磁場干預后，LPS+磁場組較LPS活化組TNF-α水平均有所降低（P＜0.05），見表2。

Tab. 1 Effects of static magnetic field on THP-1 cell growth表1靜磁場對THP-1細胞增殖情況的影響　?。╪=4，OD，x ±s）

Tab. 2 Effects of different inte nsity static magnetic field on secretion of TNF-α表2不同強度靜磁場對細胞釋放TNF-α的影響（n=3，ng/L，x ±s）

2.2.2 IL-6組內不同時間比較：3種磁場強度下，24 h時IL-6的釋放量高于18 h（P＜0.05），48 h與24 h IL-6的釋放水平差異無統計學意義。組間比較：3種磁場強度處理后，LPS活化組IL-6水平較對照組和磁場處理組升高（P＜0.05），而LPS+磁場組較LPS活化組IL-6水平均有所下降（P＜0.05），見表3。

2.2.3 IL-8組內比較：3種磁場強度下，各組內24 h與18 h IL-8水平差異無統計學意義（P＞0.05），48 h時IL-8水平明顯升高（P＜0.05）。組間比較：3種磁場強度處理后，LPS活化組IL-8水平較對照組和磁場處理組升高（P＜0.05），而LPS+磁場組較LPS活化組IL-8水平有所下降，見表4。

3　討論

THP-1細胞經LPS活化后，LPS可結合到細胞膜的TOLL樣受體上并激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）或核轉錄因子（NF）-κB信號通路，引起IL-6、IL-8、TNF-α的釋放[8-9]。TNF-α主要由單核細胞、巨噬細胞分泌產生，在調控細胞凋亡、炎癥和免疫的過程中起重要的作用，活化的TNF-α又可有效激活NF-κB通路。IL-6可刺激軟骨下骨囊性變及硬化，導致關節軟骨活動時應力分布不均，加速礦化的骨關節炎（OA）關節軟骨的退變[10-11]。IL-8在一定程度上趨化炎癥細胞進入關節其他組織（滑膜、滑液、韌帶等），合成、釋放多種炎癥介質，加重關節內炎癥反應。

Tab. 3 Effects of different intensity static magnetic field on secretion of IL-6表3不同強度靜磁場對細胞釋放IL-6的影響（n=3，ng/L，x ±s）

Tab. 4 Effects of different intensity static magnetic field on secretion of IL-8表4不同強度靜磁場對細胞釋放IL-8的影響（n=3，ng/L，x ±s）

磁場對于生物體的作用機制存在很多假說，其中被廣泛接受的是磁場通過影響細胞內外鈣離子濃度從而影響細胞的生物學效應[12-14]。此外，細胞內的大分子如蛋白質、酶等或帶不同電荷的基團，或含有過渡族金屬離子。這些部分往往是酶的活性中心，在穩恒磁場作用下這些金屬離子和基團的電荷受力方向及回旋半徑都不相同，導致整個酶分子的構象發生變形或扭曲，將活性中心外露或內包，從而改變了酶的活性,進而影響到細胞的正常生理活動。而炎癥細胞信號是一個復雜的信號系統，可以管理基本細胞活動，協調細胞行為。目前關于靜磁場對炎癥細胞的報道較少，且結論不一。Dini等[15]發現6 mT的靜磁場可抑制PMA引起的前單核細胞（U937細胞）分化，但并不影響細胞的增殖、，與本研究的結果基本一致。另有研究顯示靜磁場可使THP-1細胞和U937細胞吞噬指數和吞噬率下降，其作用在巨噬細胞的分化晚期明顯增強[12]。Aldinucci等[13]發現4.75 T強靜磁場可以有效促進外周血淋巴細胞的增殖能力，而淋巴細胞的活化程度無明顯變化，且血清中IL-1β、IL-6、干擾素（IFN）和TNF-α的含量無明顯改變。Vergallo等[16]采用2～754 mT不均一靜磁場作用于人外周血巨噬細胞和淋巴細胞，可以有效抑制巨噬細胞釋放TNF-α、IL-6、IL-8，及淋巴細胞釋放IL-6。本研究發現，3種強度的靜磁場對THP-1細胞的增殖并無影響。且LPS活化后的THP-1細胞釋放的炎癥因子水平升高，而經過磁場干預后，炎癥因子釋放減少，提示磁場對抑制炎癥因子的釋放有一定作用。另外3種炎癥因子隨時間的消長變化并不一致，這可能是由于TNF-α在炎癥反應中的特殊地位所致。TNF-α是一種重要的前炎性細胞因子，被認為是引發炎癥反應的起始者，其釋放較早，合成后可經TNF受體激活NF-κB信號通路，誘導其他炎癥因子的釋放，因而導致IL-6和IL-8釋放的峰值較晚。

靜磁場對細胞的生物效應是從多方位、多層次同時作用而表現出來的綜合效應，并不是某一因素單獨作用的結果。目前研究中大多實驗條件并不相同，得到的結論也各有側重。本研究提示靜磁場可能通過抑制IL-6、IL-8、TNF-α的釋放來輔助治療RA。

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(

2015-07-30收稿2015-11-20修回)

(本文編輯胡小寧)

The effect of moderate static magnetic fields on secretion of pro-inflammatory factors in THP-1 cells

GUO Zhixia1, MAO Libin1, WANG Huiqin2, ZHANG Rui2, ZHANG Tongcun1
1 Molecular Pharmacology and Molecular Biology Research Laboratory, College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457,China; 2 Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education
Corresponding Author E-mail: tony@tust.edu.cn

Abstract:Objective To investigate the effect of moderate static magnetic fields (SMF) on secretion of inflammato?ry factors tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-8 (IL-8) in human monocytic leukemic cell line THP-1. Methods THP-1 cells at logarithmic phase were divided into control group and magnetic treatment group. CCK-8 method was used to detect cell proliferation after THP-1 cells were exposed to 60 mT, 200 mT and 400 mT static magnetic fields at 18, 24 and 48 h. Then THP-1 cells were divided into control group, magnetic treatment group, LPS activation group and LPS+SMF treatment group. When magnetic treatment group and LPS+SMF treatment group were ex?posed to SMFat 18, 24 and 48 h, the levels of the cytokines TNF-α, IL-6 and IL-8 were determined by ELISA. Results (1) 60 mT, 200 mT and 400 mT SMF had no significant effects on cell proliferation in THP-1 cells (P＞0.05). (2)THP-1 cells secreted more TNF-α and IL-6 in 24 h than 18 h in every group, while IL-8 didn′t change. Compared with 24 h, the secre?tion of TNF-α decreased and IL-6 didn′t change, while IL-8 increased in 48 h. At three sampled time THP-1 cells of LPS activation group secreted more TNF-α, IL-6, IL-8 than those of control group and magnetic treatment group. After magnetic treatment THP-1 cells of LPS+SMF treatment group secreted less TNF-α, IL-6, IL-8 than those of LPS activation group (P＜0.05). Conclusion Static magnetic field may have some inhibitory effects on release of TNF-α, IL-6, IL-8 from THP-1 cells, which can provide basic datafor the treatment of rheumatoid arthritis.

Key words:rheumatoid arthritis; static magnetic field; THP-1 cells; inflammatory factors; LPS; ELISA; TNF-α; IL-6; IL-8

中圖分類號：R684.3

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/20150055

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31171303，31270837）；教育部長江學者和創新團隊發展計劃（IRT1166）

作者簡介：郭志霞(1989)，女，碩士在讀，主要從事關節炎和骨質疏松研究

通訊作者E-mail: tony@tust.edu.cn