氯化鈷低氧對黑色素瘤細胞系遷移能力及FSTL1表達分泌的影響

任方元，李蓮，姜芳馨，馮靖，陳寶元，曹潔

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氯化鈷低氧對黑色素瘤細胞系遷移能力及FSTL1表達分泌的影響

任方元1，李蓮1，姜芳馨2，馮靖1，陳寶元1，曹潔1

摘要：目的探討氯化鈷（CoCl2）化學模擬低氧對黑色素瘤細胞系B16F10遷移的影響，以及Follistatin-like 1 （FSTL1）蛋白在此過程中的轉錄、表達和分泌情況。方法CoCl2模擬低氧作用于小鼠B16F10細胞，實驗分為3組：0 μmol/L CoCl2對照組、50 μmol/L和100 μmol/L CoCl2處理組。用MTT法測定細胞活力；用Transwell法測定細胞遷移能力；qRT-PCR檢測Fstl1 mRNA表達；Western blot檢測細胞內外FSTL1蛋白表達。結果CoCl2模擬低氧可以導致B16F10細胞存活率顯著下降，并呈濃度和時間依賴性；50 μmol/L CoCl2處理組（0.158±0.006）、100 μmol/L CoCl2處理組（0.203±0.002）B16F10細胞遷移能力均明顯高于對照組（0.107±0.001，均P＜0.05）；50 μmol/L CoCl2處理組（1.573±0.114）、100 μmol/L CoCl2處理組（2.219±0.085）Fstl1 mRNA表達均顯著高于對照組（0.962±0.054，均P＜0.05），而胞內FSTL1蛋白表達與Fstl1 mRNA表達趨勢一致。同時也發現，CoCl2處理組細胞外FSTL1蛋白表達均低于對照組，且100 μmol/L CoCl2處理組幾乎檢測不到FSTL1表達。結論CoCl2模擬低氧促進黑色素瘤細胞遷移，可能與FSTL1的表達和分泌有關，但其功能和作用機制還需進一步探討。

關鍵詞：黑色素瘤；細胞運動；細胞低氧；氯化鈷；遷移；FSTL1

作者單位：1天津醫科大學總醫院呼吸科（郵編300052）；2南開大學生命科學院

FSTL1的轉錄、表達和分泌情況，為研究低氧與腫瘤的關系及其分子機制提供新的目標和思路。

1　材料與方法

1.1材料黑色素瘤細胞可傳代細胞株B16F10由天津南開大學生命科學院肺發育和疾病實驗室饋贈。DMEM培養基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（美國Gibco公司），TRIzol（美國Invitrogen公司），M-MLV逆轉錄酶（美國Promega Leiden公司），SYBR?Select Master Mix（美國AMBION公司），Fstl1和內參β-actin的實時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物（上海生工生物工程技術服務有限公司），Fibronectin膠、Fstl1抗體（美國Santa Cruz公司），β-actin抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養B16F10細胞用含10% FBS的DMEM培養液于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。待細胞長至70%～80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化并以1∶4傳代，取生長良好的第3～5代細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法測定細胞活力取處于對數生長期的黑色素瘤細胞，以5×103個/孔的密度接種于96孔板內，培養4 h后棄掉原培養基，分別加入不同濃度的CoCl2（0、50、100、200和400 μmol/L），每個濃度組設4個復孔，在不含血清的DMEM中分別培養24 h、48 h。吸去舊培養基，每孔加入MTT溶液10 μL和含10%FBS的DMEM培養基100 μL，繼續培養4 h后，吸去原溶液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液終止反應。37℃培養10 min，于492 nm波長處測定各孔光密度（OD）值，計算細胞存活率。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.3 Transwell法測定細胞遷移能力在Transwell小室下部加入一定量Fibronectin膠，于37℃培養箱孵育2 h。取對數生長期的細胞，消化成單細胞懸液后計數，調整濃度為5.0×104/mL。將細胞加入Transwell的上室，每孔加入100 μL細胞懸液。在Transwell小室底部加入不同濃度CoCl2（50、100 μmol/L），由10%FBS的培養基配制。37℃、5% CO2培養箱中培養24 h，每組細胞做2個復孔。24 h后用鑷子小心取出Transwell小室，吸干上室液體，10%甲醛室溫固定，結晶紫染色。用棉簽擦去上室未穿膜的細胞。體式顯微鏡1.6及10倍光鏡拍照。將小室濾膜取出，甲醇溶解，充分溶解后在酶標儀570 nm下測各孔吸光度（A）值，以衡量細胞的遷移能力。

1.2.4 qRT-PCR利用TRIzol提取細胞RNA，利用M-MLV逆轉錄酶將總RNA反轉錄為cDNA，然后用SYBR?Select Master Mix進行qRT-PCR。PCR引物設計見表1。PCR反應條件：95℃預變性3 min，94℃變性40 s，60℃復性30 s，72℃延伸30 s，循環40次后，72℃延伸7 min。以β-actin為內參來校正目的基因的表達量。Fstl1引物：上游5′-TTAT?GATGGGCACTGCAAAGAA-3′,下游5′-ACTGCCTTTAGAG AACCAAGCC-3′，產物151 bp。β-actin引物：上游5′-AGG CCAACCGTGAAAAGATG-3′,下游5′-AGAGCATAGCCCTC?GTAGATGG-3′，產物265 bp。

1.2.5 Western blot分析B16F10細胞分別用不同濃度的CoCl2（50、100 μmol/L）在不含血清的DMEM中處理24 h后，收集各組細胞及上清。收集的細胞超聲破碎后，于4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清即為蛋白提取溶液。用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，加入5×Sample buffer，100℃煮沸5 min，根據蛋白濃度取一定量蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳分離。收集的細胞上清用飽和三氯乙酸（TCA）沉淀，加入100μL 1×Sample buffer，100℃煮沸5 min，每組各取30 μL總蛋白進行SDS-PAGE膠電泳分離。濕轉法將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，再分別加入羊抗鼠FSTL1多克隆抗體（1∶200），兔抗鼠β-actin多克隆抗體（1∶5 000）4℃孵育過夜。TBST洗膜5次，每次7 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯影。1.3統計學方法采用SPSS 16.0統計軟件處理，數據用均數±標準差（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1不同濃度CoCl2對B16F10細胞活力的影響隨著CoCl2濃度和培養時間的增加，B16F10細胞活力逐漸降低。CoCl2終濃度為200、400 μmol/L處理B16F10細胞24 h和48 h時以及CoCl2終濃度為50、100 μmol/L處理B16F10細胞48 h時，細胞活力均顯著下降（P＜0.05）。而50、100 μmol/L處理B16F10細胞24 h，細胞活力未受到顯著影響（P＞0.05），見表1。故后續研究中選擇50 μmol/L和100 μmol/L 2個劑量處理細胞24 h作為CoCl2的實驗濃度和時間，觀察黑色素瘤細胞的生物學變化。

Tab. 1 Effects of hypoxia induced by different concentrations of CoCl2on cell viability of B16F10表1不同濃度CoCl2誘導低氧對B16F10細胞存活率的影響（n=4，%, x ±s）

2.2 CoCl2低氧對B16F10細胞遷移能力的影響50 μmol/L和100 μmol/L CoCl2處理組B16F10細胞遷移能力（0.158±0.006，0.203±0.002）均高于對照組（0.107±0.001，均P＜0.05），見圖1。

2.3 CoCl2低氧對B16F10細胞FSTL1轉錄、表達和分泌的影響50 μmol/L和100 μmol/L CoCl2處理組Fstl1 mRNA轉錄水平（1.573±0.114，2.219±0.085）均高于對照組（0.962±0.054，均P＜0.01），見圖2A。而胞內FSTL1蛋白表達與Fstl1 mRNA表達趨勢一致，見圖2B。同時也發現，不同濃度CoCl2處理B16F10細胞后，胞外FSTL1蛋白表達均低于對照組，且100 μmol/L CoCl2處理組幾乎檢測不到。

Fig. 1 Effects of hypoxiainduced by different concentrations of CoCl2on migration of B16F10圖1 CoCl2低氧對B16F10細胞遷移能力的影響

Fig. 2 Effects of CoCl2induced hypoxiaon expression of Fstl1 mRNA and FSTL1 protein in B16F10圖2 CoCl2低氧對Fstl1 mRNA和FSTL1蛋白表達的影響

3　討論

3.1研究背景惡性黑色素瘤因具有很高的增殖、局部浸潤和遠處轉移的潛能，使其在皮膚腫瘤中具有惡性程度高、預后差的特點。遷移不僅是細胞進行很多重要生理活動的基礎，同時也是腫瘤發生和炎癥反應等病理過程中的重要環節[5]。如何控制癌細胞的運動是治療腫瘤的關鍵問題之一。導致腫瘤細胞的遷移運動有著多種不同的機制，腫瘤發生發展過程存在的氧供應不足是其重要的原因之一。

3.2低氧模型建立細胞的低氧模型主要分為2種：環境低氧和細胞內低氧。環境低氧模型通過改變氧分壓使細胞處于低氧狀態，其與體內細胞缺氧的生理狀況更接近，但需要特殊的細胞培養設備且費用高昂，而CoCl2模擬的細胞內缺氧模型操作相對簡單，低氧更易于控制，因此更常用于各種實驗性缺氧研究[6]。Co2+是鐵螯合酶的底物，它可以通過與Fe2+競爭性結合血紅蛋白，阻斷氧感受器與氧結合，使細胞“感覺”缺氧，上調低氧誘導因子1α（HIF-1α）的表達而增強細胞的抗缺氧能力[7]。本研究采用CoCl2成功模擬了小鼠黑色素瘤細胞的缺氧環境，發現低氧環境可以導致B16F10細胞存活率顯著下降，并呈濃度和時間依賴性。同時發現CoCl2低氧可以促進B16F10細胞的遷移能力以及Fstl1 mRNA和胞內蛋白表達顯著升高，而抑制FSTL1蛋白向胞外的分泌。

3.3 FSTL1與腫瘤的關系FSTL1作為一個胞外分泌的小分子蛋白，具有生物學功能的多樣性?，F有研究表明FSTL1在胚胎發育[8-9]、類風濕性關節炎[10]、心血管疾病以及肺纖維[11-12]等過程中都扮演著重要角色。FSTL1的表達和人類多種腫瘤細胞也密切相關，但關于FSTL1在腫瘤免疫中的研究存在分歧。一方面，有研究發現在多種腫瘤細胞系中FSTL1均是低表達，研究發現connexin43蛋白通過調控FSTL1的分泌[13]，從而抑制癌細胞增殖以及遷移[14]；另一方面，也有研究發現FSTL1可以促進前列腺癌細胞的轉移[15]，這說明FSTL1對于腫瘤具有雙向調節的作用。本研究顯示，CoCl2模擬低氧雖然促進了FSTL1的轉錄和胞內蛋白水平表達，但卻抑制了FSTL1向細胞外的分泌。FSTL1可通過改變細胞微環境，在細胞外水平調節細胞的各種活動。因此，筆者推測CoCl2低氧促進黑色素瘤細胞遷移可能主要與FSTL1蛋白向胞外的分泌有關。

3.4展望本課題組在后續的研究中將對FSTL1進行knockdown或加入其抑制劑，降低或阻斷FSTL1的表達，觀察其對遷移是否有減低或逆轉作用，進一步明確CoCl2低氧促進黑色素瘤細胞遷移與FSTL1蛋白的關系及其分子機制。

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（2015-09-02收稿2015-11-12修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of cobalt chloride-induced hypoxia on cell migration and expression and secretion of FSTL1 in melanoma cell line

REN Fangyuan1，LI Lian1，JIANG Fangxin2，FENG Jing1，CHEN Baoyuan1, CAO Jie1
1 Respiratory Department of Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052, China;
2 College of Life Sciences, Nankai University
Corresponding Author E-mail：tjcaojie@sina.com

Abstract：Objective To explore the effects of cobalt chloride (CoCl2)-induced hypoxia on migration of melanoma cells, and to detect the transcription, expression and secretion of Follistatin-like 1(FSTL1)in this process. Methods B16F10 melanoma cell line was treated with CoCl2in order to mimic hypoxia. Experimental cells were divided into three groups: 0 μmol/L, 50 μmol/L and 100 μmol/L CoCl2treatment groups. MTT assay was used to assure cell viability, and to determinethe treatment concentration of CoCl2. Transwell assay was used to determine the migration ability of B16F10 melanoma cell line. Real-time PCR was used to measure the mRNA expression of Fstl1. Western blot assay was used to detect the intracel?lular and extracellular protein expression of FSTL1. Results The cell viability of B16F10 melanoma cell line was signifi?cantly reduced by CoCl2treatment, with a time and concentration-dependent manner. The migration ability of B16F10 cell line was significantly increased in CoCl2treated group compared with that of control group (P＜0.05). The mRNA level of Fstl1 was obviously higher in CoCl2treated group than that of control group (P＜0.05). The intracellular expression of FSTL1 protein was consistent with the expression trend of Fstl1 mRNA. Simultaneously, the extracellular protein level of FSTL1 was significantly decreased compared with that of control group. There was no expression of FSTL1 in 100 μmol/L CoCl2treat?ment group. Conclusion The migration ability of melanoma cell line is enhanced by CoCl2treatment, which may be associ?ated with expression and secretion of FSTL1, however, the relevant mechanism still needs further investigation.

Key words:melanoma；cell movement；cell hypoxia；cobalt chloride；migration；follistatin-like 1黑色素瘤是一類來源于神經嵴黑色素細胞的高度惡性腫瘤，具有很高的發病率和死亡率，一旦遠處轉移，預后極差。低氧是腫瘤發生發展過程中存在的一種普遍的病生理現象，同時也是誘發腫瘤細胞遷移的始動因素之一[1]。氯化鈷（cobalt chloride，CoCl2）是一種常用的化學性低氧模擬劑，經常應用于研究低氧與腫瘤的關系及其分子機制。Follistatin-like protein 1（FSTL1）是一種可分泌的小分子糖蛋白（38 ku），屬于Fst-SPARC蛋白家族[2]。研究表明它可以調控腫瘤細胞的增殖和分化，是一個與腫瘤相關的蛋白因子[3]。研究表明低氧對腫瘤遷移和進展具有重要作用[4]，而在此過程中FSTL1的表達分泌及其調控的分子機制尚不清楚。本研究通過CoCl2模擬細胞缺氧檢測低氧對黑色素瘤細胞系B16F10遷移能力的影響，并進一步觀察在此過程中腫瘤相關蛋白

中圖分類號：R739.5

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150144

基金項目：國家十二五科技支撐計劃（2012BAI05B02）

作者簡介：任方元（1990），女，碩士在讀，主要從事睡眠低氧性疾病和腫瘤相關研究

通訊作者E-mail：tjcaojie@sina.com