布南色林對H2O2引起的PC12細胞損傷的神經保護作用研究

黃海潮，巫瑋，張小紅，聶陽，劉經亮，周捷

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布南色林對H2O2引起的PC12細胞損傷的神經保護作用研究

黃海潮1，巫瑋1，張小紅1，聶陽1，劉經亮1，周捷2

摘要：目的探討布南色林對H2O2引起的大鼠嗜鉻細胞瘤（PC12）細胞損傷的保護作用。方法取對數生長期PC12細胞，接種于96孔板，每孔加入終濃度為分別為0、5、10、20、40、80及160μmol·L-1的布南色林，觀察不同濃度布南色林對PC12細胞增殖的影響。另取細胞，分為空白細胞對照（C）組，H2O2處理（H）組，布南色林- H2O2處理（B）組,陽性對照（維生素E- H2O2處理，E）組）。MTT法檢測各組細胞的活性變化。用TUNEL法檢測各組細胞凋亡情況；倒置顯微鏡直接觀察法以及Hoechst33258染色法觀察氧化損傷細胞的形態變化；生化法測定各組細胞的超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量的改變。結果合適濃度的布南色林（0～20μmol·L-1）能促進PC12細胞的生長。與C組比較，H組的細胞活性下降，凋亡指數增加（P＜0.05）；細胞碎片增多，細胞損傷明顯；細胞內的SOD活性減低，MDA水平增高（P＜0.05）。與H組比較，B組的細胞活性增強，凋亡指數下降（P＜0.05）；細胞形態部分恢復；細胞內的SOD活性增強，MDA含量降低（P＜0.05）。結論布南色林對H2O2引起的神經損傷有保護作用。

關鍵詞：創傷,神經系統；細胞凋亡；PC12細胞；神經保護；布南色林；超氧化物歧化酶；丙二醛

作者單位：1廣東食品藥品職業學院（郵編510520）；2中山大學腫瘤防治中心藥學部

抗精神分裂癥新藥布南色林（Blonanserin）為高度選擇性的5-羥色胺Ⅱ（5-HT2）受體和多巴胺Ⅱ（D2）受體拮抗藥，能有效治療精神分裂癥陰性和陽性癥狀，還能有效改善患者的認知功能，不良反應較少[1-2]。研究顯示，精神分裂癥早期常伴有大量灰質的丟失[3]。神經解剖和影像學表明精神分裂癥伴有腦室的擴大[4]、大腦顳葉體積的縮小[5]以及神經元數量的明顯減少[6]。有研究證實，細胞凋亡可能參與了精神分裂癥的病理過程[7-8]。利培酮、奧氮平等非典型抗精神病藥對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤（PC12）細胞的氧化損傷有保護作用[9-10]。本研究旨在探討布南色林對H2O2引起的PC12細胞損傷是否有保護作用，以期為臨床用藥提供參考。

1　資料與方法

1.1一般資料PC12細胞購自中國醫學科學院細胞研究所；布南色林購自上海瀚香生物科技有限公司（純度＞98%）。細胞培養瓶、6孔板、96孔板（corning公司）；DMEM培養基、馬血清（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；Triton-X-100、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司）；pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS，杭州吉諾公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物有限公司）。

1.2細胞培養將PC12細胞接種于含有5%FBS和5%馬血清的DMEM培養基，于37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后換液1次，取對數生長期PC12細胞進行實驗。

1.3不同濃度布南色林對PC12細胞增殖的影響取實驗待用細胞，用0.25%胰酶消化，以4 000個/孔接種于96孔板，每孔加入終濃度分別為0、5、10、20、40、80及160μmol·L-1的布南色林。并設空白調零孔（只加DMEM培養基，不加細胞）。每組均設5個復孔，培養48 h，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，37℃繼續培養4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 100μL，用酶標儀檢測各孔在490 nm波長下的光密度（OD）值。

1.4 PC12細胞活性及細胞凋亡情況分析（1）細胞活性檢測。取對數生長期細胞，分空白細胞對照（C）組；200μmol·L-1H2O2處理（H）組；實驗（B）組，預先加入合適濃度布南色林處理12 h，再加入200μmol·L-1H2O2處理12 h；陽性對照維生素E-H2O2處理（E）組，預先加入濃度為200μmol·L-1維生素E處理12 h，再加入200μmol·L-1H2O2處理12 h。每組均設5個復孔，每孔加入5 g/L MTT 10μL，37℃繼續培養4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 100μL，用酶標儀檢測各孔在490 nm波長下的OD值，實驗重復3次。計算細胞活性，細胞活性（%）=OD藥物組/OD空白細胞組×100%。（2）細胞凋亡情況分析。實驗分組如（1）。按4×104個/mL密度接種于6孔板，經TUNEL處理后，在熒光顯微鏡下呈綠色熒光的為陽性。在200倍下，任選3個視野進行細胞計數，每個視野中計數100個細胞，以陽性細胞數為凋亡指數。

1.5布南色林對H2O2引起PC12細胞損傷的形態觀察按1.4進行實驗分組，藥物作用后，倒置顯微鏡觀察細胞形態；再加入4%的多聚甲醛固定，用10 mg·L-1的Hoechst 33258對細胞進行染色10 min后，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態。

1.6布南色林對PC12細胞中SOD、MDA含量的影響細胞接種于6孔板，實驗分組如1.4。藥物處理后，小心吸去原培養液，用PBS洗2遍，每孔加入0.1 mol·L-1的PBS和0.05 mol·L-1的EDTA（pH 8.0）2 mL，再加入100μL 1%的Triton-X-100，將培養板置振蕩器振蕩1 min使之溶解，加入25%的H3PO4溶液200μL，12 000 r/min于4℃離心1 h，取上清液，按試劑盒說明書測定SOD活性和MDA含量。

1.7統計學方法采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量數據以x ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1布南色林對PC12細胞增殖的影響濃度分別為0、5、10、20、40、80、160μmol·L-1的布南色林作用PC12細胞后，細胞OD值分別為0.426±0.019、0.428±0.012、0.432±0.005、0.446±0.013、0.378± 0.012、0.182±0.010及0.090±0.011（F=527.215，P＜0.05），其中0、5及10μmol·L-1組間差異無統計學意義外，其他組間差異均有統計學意義。濃度 40 μmol·L-1后呈逐漸降低趨勢（P＜0.05）。

2.2各組細胞活性和凋亡指數比較與C組比較，各實驗組細胞的活性下降，凋亡指數增加；與H組比較，B組和E組的細胞活性增強，凋亡指數下降（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of cell viability, apoptotic rate of PC12 cells, MDA and SOD between four groups表1各組細胞活性、凋亡指數、MDA和SOD水平比較（n=3，x ±s）

2.3 PC12細胞損傷的形態觀察C組細胞呈不規則多角形，Hoechst染色顯示正常PC12細胞核呈暗藍色的橢圓形，細胞碎片呈亮藍色，細胞損傷明顯；與C組比較，H組中細胞輪廓變得模糊，細胞呈不完整狀態，細胞碎片明顯增多，細胞損傷更明顯；與H組比較，E組和B組細胞貼壁生長明顯增多，細胞形態部分恢復，在B組和E組中部分細胞出現暗藍色的正常細胞核，見圖1。

2.4各組SOD活性以及MDA水平比較與C組比較，H組MDA水平增加、SOD活性減少；與H組比較，B組和E組MDA水平降低、SOD活性增加（均P＜0.05），見表1。

3　討論

3.1布南色林對PC12細胞增殖的影響目前，在精神分裂癥病因中，神經發育障礙假說獲得較多支持，認為在神經發育的過程中，某些腦區神經元的凋亡損傷、神經細胞的萎縮和數量減少，從而導致的神經元的排列、連接出現異常是精神分裂癥的病理基礎[7]。本研究結果顯示，0、5及10μmol·L-1組間細胞增殖情況差異無統計學意義，其他組間差異均有統計學意義， 40μmol·L-1后呈逐漸降低趨勢，表明布南色林＜20μmol·L-1，其對細胞的增殖影響不明顯，當藥物濃度達到20μmol·L-1時，細胞增殖增強；布南色林在較高濃度（ 40μmol·L-1）對PC12細胞生長有抑制作用，提示過量抗精神分裂藥物對神經細胞有損傷作用。

3.2布南色林對氧化損傷PC12細胞活性的影響在精神分裂癥患者中神經細胞的凋亡損傷往往與細胞的氧化應激水平有關。研究認為，患有精神分裂癥的患者血中的各種抗氧化物質及脂質過氧化物的水平存在異常，可能機制為患者腦內的自由基生成過多，或者是生理性清除機制有所減弱，從而導致脂質過氧化反應增多，神經毒性增強，引起神經元的凋亡損傷[11-12]。在布南色林對PC12細胞氧化損傷的結果中提示，合適濃度（20μmol·L-1）的布南色林能減輕H2O2引起PC12細胞的凋亡情況，并減少細胞氧化損傷程度。為了進一步證實其抗氧化的效果，通過測定損傷PC12細胞內的SOD以及MDA水平變化來明確布南色林抗氧化損傷效果。SOD是神經元內抗氧化系統中重要的生物酶，在一定程度上可保護細胞免受自由基的損害，其含量的高低通常反映機體抗氧化能力的強弱。MDA是神經元脂質過氧化的產物，可反映機體內的脂質過氧化程度以及自由基水平。本研究顯示，與C組比較，H組MDA水平增加、SOD活性減少；與H組比較，B組和E組MDA水平降低、SOD活性增加，表明濃度為20 μmol·L-1布南色林能降低H2O2引起PC12細胞損傷中MDA水平以及提高SOD的活性，其作用效果較陽性對照藥（維生素E）弱，而維生素E是被證實能夠阻斷細胞膜脂質過氧化，使細胞、組織、器官免受自由基攻擊，是研究氧化損傷中常用的陽性對照藥，提示布南色林對PC12細胞的保護作用可能與改變細胞內的自由基水平有關，這與相關研究相似[11-13]。綜上所述，布南色林作為第二代抗精神分裂癥藥，能減輕氧化應激引起的損傷，有神經保護作用。

對于其如何改變細胞內氧化應激水平以及對細胞內相關離子水平變化的影響尚待進一步深入研究。

（圖1見插頁）

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（2015-09-14收稿2015-11-06修回）

（本文編輯陸榮展）

實驗研究

Neuroprotective effects of blonanserin on H2O2-induced injury in PC12 cells

HUANG Haichao1, WU Wei1, ZHANG Xiaohong1, NIE Yang1, LIU Jingliang1, ZHOU Jie2
1 Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520, China;
2 Department of pharmacy, SUN YAT-SEN University Cancer Center Corresponding Author E-mail：Wuweide2009@163.com

Abstract：Objective To explore neuroprotective effects of blonanserin on H2O2-induced injury in PC12 cells. Meth?ods PC12 cells were divided into four groups: control group (C group), H2O2-treated group (H group), blonanserin pretreat?ed group (B group) and positive control group (vitamin E- pretreated, E group). The effects of different concentrations of blonanserin (0, 5, 10, 20, 40, 80 and 160μmol·L-1) on cell proliferation in PC 12 cells were observed. MTT assay was used to detect the cell activity of different groups. The apoptotic rates of different groups were measured by TUNEL assay. The mor?phological changes were observed usinginverted microscope and Hoechst 33258 staining. The superoxide dismutase (SOD)vi?ability and malondialdehyde (MDA) levels were detecded by biochemical methods in four groups. Results The appropriate concentration of blonanserin (0-20μmol·L-1)can promote the growth of PC12 cells. Comparingwith the C group, the apoptot?ic rate and MDA level were increased in group H, while the cell viability and the SOD viability were decreased obviously (P＜0.05). Compared with H group, the cell viability, SOD viability were significantly increased, while the MDA level and apoptotic rate were decreased (P＜0.05). Conclusion Blonanserin shows neuroprotective effect on H2O2-induced injury in PC12 cells.

Key words:trauma, nervous system；apoptosis; PC12 cell; neuroprotective; Blonanserin; SOD; MDA

中圖分類號：R749.3，R749.05

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150159

基金項目：廣東省醫學科學技術研究基金（B2013071）

作者簡介：黃海潮（1982），男，實驗師，碩士研究生，主要從事神經藥理研究

通訊作者E-mail：Wuweide2009@163.com