丹柴合劑對樹突狀細胞的誘導分化作用

李穎曦，陳丹，王小東，景亞青，李克秋，李光

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丹柴合劑對樹突狀細胞的誘導分化作用

李穎曦1，陳丹2，王小東2，景亞青1，李克秋1，李光1

摘要：目的研究中藥復方制劑丹柴合劑對樹突狀細胞（DCs）的誘導分化作用，并探討其機制。方法制備丹柴合劑的大鼠含藥血清。分離人外周血單個核細胞，經磁珠篩選出CD14+單核細胞，培養5～7 d獲得未成熟樹突狀細胞（imDCs），分為空白血清組與含藥血清組，空白血清組分別加入含或不含脂多糖（LPS）的大鼠空白血清，含藥血清組分別加入含或不含LPS的大鼠含藥血清。用流式細胞術檢測DCs表面分子CD86、CD11b和人白細胞抗原（HLA）-DR的表達；用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測DCs分泌白細胞介素（IL）-10的水平；用流式細胞術檢測DCs對T細胞增殖能力的影響；用實時定量PCR檢測吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）基因的表達。結果經丹柴合劑作用后，DCs高表達CD11b，低表達CD86與HLA-DR，IL-10分泌增加。且該制劑通過促進DCs表達IDO進而抑制DCs介導的T細胞增殖能力。結論丹柴合劑可誘導DCs分化為調節性樹突狀細胞（DCregs）并發揮免疫調節作用。

關鍵詞：樹突細胞；免疫耐受；吲哚胺-吡咯2,3-雙加氧酶；調節性樹突狀細胞；免疫調節

作者單位：1天津醫科大學基礎醫學院生物學教研室（郵編300070），2藥理學教研室

一直以來，免疫排斥反應是治療器官移植和自身免疫性疾病的瓶頸。誘導機體產生針對移植物抗原和自身抗原的免疫耐受是治療器官移植后免疫排斥反應和自身免疫性疾病的關鍵。樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是體內作用最強的抗原提呈細胞，它具有雙向調控免疫作用的功能，既可提呈抗原，激活T細胞，刺激免疫應答，又可抑制T細胞增殖，誘導免疫耐受[1]。近年來，調節性樹突狀細胞（regulatory dendritic cells，DCregs）誘導的免疫耐受作用備受關注，在器官移植后免疫排斥反應、變態反應和自身免疫性疾病的治療中具有潛在前景[2]。DCregs是一類具有負向免疫調節功能的DCs亞群，其高表達CD11b/c分子、低表達共刺激分子CD80、CD86和人白細胞抗原（HLA）-DR，其可增強細胞因子白細胞介素（IL）-10、轉化生長因子（TGF）-β的分泌，還可抑制T細胞增殖并促進調節性T細胞擴增，從而誘導免疫耐受[3]。目前，DCregs已成為治療包括移植物抗宿主病在內的免疫相關疾病的一種新策略[4]。中藥復方制劑丹柴合劑是天津醫科大學腫瘤醫院吳雄志教授在長期臨床工作中總結出的具有誘導免疫耐受作用的驗方，本文旨在研究丹柴合劑對DCs的誘導分化作用和對免疫功能的調節，并探討其機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康SPF級成年SD大鼠，體質量180～200 g，雌雄各半，購自北京軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.1.2材料與試劑CD14+磁珠購自德國Miltenyi Biotec；RPMI 1640培養基購自美國Hyclone Thermo Scientific；胎牛血清購自以色列Biological Industries；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）與IL-4購自美國R&D Systems；LPS購自美國Sigma-Aldrich；anti-CD86抗體、anti-CD11b抗體、an?ti-HLA-DR抗體、同型抗體、anti-CD4+FITC抗體和7-AAD抗體均購自美國BioLegend。人IL-10酶聯免疫試劑盒購自北京達科為。Trizol購自美國Life Technologies；逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen；實時定量PCR（Real-time PCR）試劑盒購自美國Applied Biosystems。引物合成于上海生工生物工程公司。

1.2實驗方法

1.2.1丹柴合劑及含藥血清的制備采用經常規炮制的生藥，按份數稱取柴胡6 g、牡丹皮6 g、白芍6 g、郁金6 g、甘草6 g，分別粉碎為粗末，混合，放入100℃沸水中浸泡30 min，再加入8倍的水，在100℃條件下浸提1 h，共浸提2次，最后將所得水提液合并使用；水提液經濾紙充分過濾后3 500 r/min離心15 min；旋轉蒸發濃縮，凍干，得到凍干粉，藥物得率為11.5%（W/W）。取該中藥復方制劑凍干粉，用PBS稀釋成適宜濃度，以6 g/kg劑量給予大鼠灌胃，每日2次，連續給藥3 d，作為含藥血清組；將等體積的PBS給予大鼠灌胃，作為空白血清組。末次給藥后1 h經腹主動脈取血，室溫靜置3 h后無菌分離血清，再經56℃滅活30 min，即可得到含藥/空白血清，凍存于-20℃備用。

1.2.2細胞培養從健康志愿者的外周靜脈血中梯度離心獲得外周血單個核細胞（PBMC），再經CD14+磁珠篩選出純度可達90%的CD14+單核細胞。淋巴細胞取自第0天已貼壁的PBMC上清液。將CD14+單核細胞用含20%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養基重懸并以1×106個/mL密度接種，加入60 μg/L GM-CSF和30 μg/L IL-4，培養5～7 d獲得未成熟樹突狀細胞（immature dendritic cells，imDCs）。收集imDC，

分為空白血清對照組與含丹柴合劑的含藥血清組。空白血清對照組分別加入含或者不含LPS（100 μg/L）的10%體積的大鼠空白血清，而含藥血清組分別加入含或者不含LPS（100 μg/L）的10%體積的含藥血清。

1.2.3 DCs表型分子鑒定收集imDC，實驗方法與分組同1.2.2。48 h后收集細胞，用100 μL PBS緩沖液重懸，加入異硫氰酸熒光素（FITC）或棗紅蛋白（PE）標記的抗體（anti-CD86、anti-CD11b、anti-HLA-DR），于4℃避光孵育20～30 min，PBS洗2遍，用流式細胞儀檢測標記細胞的陽性率或平均熒光強度，未標記的DCs作為流式檢測設門對照，最后用FlowJo軟件分析。

1.2.4酶聯免疫吸附試驗（ELISA）收集imDC，實驗方法與分組同1.2.2。48 h后，收集培養細胞的上清，用酶聯免疫試劑盒檢測IL-10的含量。

1.2.5混合淋巴細胞反應收集imDC，實驗方法與分組同1.2.2。48 h后，將DCs作為刺激細胞（1×104個/mL），淋巴細胞（1×105個/mL）作為應答細胞，兩者以1∶10的比例接種于24孔板中共培養5 d，再用100 μL PBS重懸，用anti-CD4+FITC和7-AAD的抗體標記淋巴細胞，最終用流式細胞儀檢測CD4+7-AAD-的細胞數量。

1.2.6 Real-time PCR用Trizol法提取經10%含藥血清與10%空白血清作用48 h的DCs總RNA，再將2 μg總RNA經逆轉錄試劑盒合成為cDNA，用Real-time PCR檢測各組吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）的相對表達量，并用相對于管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate de?hydrogenase，GAPDH）的倍數表示，每個樣品設3次重復。引物序列如下：IDO（84 bp），上游為5′-GCCCTTCAAGTGTTTC ACCAA-3′，下游為5′-CCTTTCCAGCCAGACAAATATATG-3′；GAPDH（89 bp），上游為5′-TGCACCACCAACTGCTTAG C-3′；下游為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.3統計學方法采用SPSS 16.0分析數據，計量資料用均數±標準差（x ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1丹柴合劑對DCs表型的影響imDC空白血清組、imDC含藥血清組、imDC+LPS空白血清和imDC+ LPS含藥血清組CD86陽性細胞百分率分別為（39.50±6.20）%、（16.95±2.05）%、（75.15±1.75）%、（56.00±3.10）%（F=132.52，P＜0.05），見圖1。經丹柴合劑作用后，imDC組和經LPS刺激的imDC組CD86陽性細胞百分率均顯著降低，分別低于其對照組57.09%（P＜0.05）和25.48%（P＜0.05）。4組CD11b陽性細胞百分率分別為（5.13±0.99）%、（10.16±0.95）%、（4.91±0.46）%、（6.64±0.44）%（F= 31.02，P＜0.05），見圖1。imDC組與經LPS刺激的imDC組CD11b陽性細胞百分率分別高于其對照組49.51%和35.23%（P＜0.05）。

此外，4組的HLA-DR平均熒光強度分別為1 252.00±211.00、901.00±41.00、1 784.50±113.50、1 436.00±92.00（F=24.11，P＜0.05），見圖1。經該制劑作用后，imDC組與經LPS刺激的imDC組HLADR平均熒光強度均顯著降低，分別低于其對照組28.04%和19.53%（P＜0.05）。綜上，丹柴合劑可使共刺激分子CD86和抗原提呈分子HLA-DR表達降低，使DCregs的特征性表面分子CD11b表達增強。

Fig. 1 The phenotypic characteristics of DCs treated with Danchaiheji圖1丹柴合劑對DCs表型的影響

2.2丹柴合劑對DCs分泌細胞因子的影響imDC空白血清組、imDC含藥血清組、imDC+LPS空白血清組與imDC+LPS含藥血清組分泌的IL-10濃度分別為（108.50±5.20）、（127.17±4.55）、（168.50±4.90）、（209.30±8.50）ng/L（F=168.25，P＜0.05），見圖2。實驗發現，與imDC和imDC+LPS空白血清組比較，丹柴合劑均能促進DCs分泌DCregs的特異性標志物IL-10（P＜0.05）。

Fig. 2 The cytokine production of DCs treated with Danchaiheji圖2丹柴合劑對DCs分泌細胞因子的影響

2.3丹柴合劑對T細胞增殖能力的影響imDC空白血清組、imDC+LPS空白血清組與imDC+LPS含藥血清組T細胞的平均熒光強度分別為1 062.50± 22.50、1 641.00±138.00、1 024.00±83.00（F=40.67，P＜0.05），見圖3。研究發現，隨著imDC分化成熟，其刺激同種異體T細胞增殖的能力也隨之增強（P＜ 0.05），而丹柴合劑可顯著降低經LPS刺激的DCs誘導的T細胞增殖能力（P＜0.05），提示丹柴合劑能顯著抑制DCs介導的淋巴細胞增殖作用。

Fig. 3　 The effects of Danchaiheji on the proliferation of T cells圖3丹柴合劑對T細胞增殖能力的影響

2.4丹柴合劑在mRNA水平對IDO表達的影響經丹柴合劑作用后的imDC+LPS組IDO的相對表達量高于空白血清組近1.5倍（6.65±0.40 vs 4.73±0.23，F=471.22，P＜0.05），見圖4，提示該制劑可促進DCs高表達IDO。

Fig. 4 The relative transcription levels of IDO by real-time PCR圖4 Real-time PCR檢測IDO基因的相對表達量

3　討論

3.1治療免疫排斥反應的現狀一直以來，免疫排斥反應是治療器官移植和自身免疫性疾病的難點與重點。目前在免疫排斥反應的治療中，療效最為確切的是免疫抑制劑。理想的免疫抑制劑具有高效、低毒、方便和經濟的特點，然而目前在臨床上投入使用的免疫抑制劑大多存在廣泛而強烈的毒副作用，長期服用可使患者的免疫功能下降，抗感染能力降低，甚至引起強烈的肝腎毒性[5]。例如肝移植常用的免疫抑制劑環孢素A、他克莫司等藥物的神經毒作用已屢見報道，兩者可出現頭痛、癲癇、震顫、失明、局灶性腦白質病等神經系統病變[6]。因此，誘導患者產生針對移植物抗原和自身抗原的免疫耐受是治療器官移植后免疫排斥反應和自身免疫性疾病的關鍵。

3.2 DCregs的免疫調節性能DCs根據其分化成熟的不同狀態可分為imDCs和成熟樹突狀細胞（mature dendritic cells，mDCs）。imDCs低表達共刺激分子并產生大量抗炎細胞因子，抑制免疫應答，而mDCs與imDCs恰恰相反，其高表達共刺激分子并產生大量炎性細胞因子，誘導適應性免疫應答[7-8]。近年來，DCregs誘導的免疫耐受作用備受關注，在器官移植免疫排斥反應、變態反應和自身免疫性疾病的治療中具有潛在的前景[2]。誘導產生DCregs的方法很多，如免疫抑制劑[9]、基質細胞[10]、生物制劑[11]。但由于大多數免疫抑制劑可降低機體的免疫功能，甚至具有肝腎毒性和神經毒作用，給患者帶來嚴重的不良反應。因此，尋找一種經濟、安全而又能高效獲得DCreg的方法具有良好的臨床應用價值。

3.3丹柴合劑的免疫調節性能本研究旨在克服上述不足之處，根據多年的臨床實踐，反復臨床驗證拆方組方，提供一種安全、經濟、有效誘導免疫耐受的中藥復方制劑——丹柴合劑。其配伍原理為少陽肝膽，病機為正邪相爭，調理肝膽，使邪證兩孤立，則可誘導機體免疫系統對病邪的免疫耐受。此方以柴胡為君，疏肝解表，白芍、郁金為臣，疏肝活血，肝藏血，佐以牡丹皮涼血，甘草調和諸藥為使。肝體陰而用陽，白芍養肝之體，柴胡助肝之用；肝主氣而藏血，柴胡理氣，郁金活血；氣有余便是火，更加牡丹皮涼血清熱。縱觀全方，攻補皆施，氣血同調，實為調理肝膽以誘導免疫耐受之良方。本文通過大量實驗證實，DCs經丹柴合劑作用后可誘導分化為一種高表達CD11b，低表達CD86與HLA-DR的DCs亞型，該DCs亞型可促進細胞因子IL-10的分泌。此外，將LPS刺激后的DCs與CD4+T細胞共培養后，該制劑可顯著抑制DCs介導的T細胞增殖能力。IDO是一種調控色氨酸的代謝酶，其通過犬尿氨酸通路調控色氨酸的代謝，IDO還可抑制T細胞活化和增殖參與誘導免疫耐受[12]。大量研究報道，IDO在誘導免疫耐受中發揮重要的作用，可用于治療器官移植后排斥反應、自身免疫性關節炎等免疫性疾病[13-14]。本研究發現丹柴合劑可誘導DCs使IDO基因表達上調。

3.4前景展望綜上，丹柴合劑通過上調IDO表達將DCs誘導分化為具有負向免疫調節功能的DCregs，從而誘導免疫耐受。這些發現在器官移植免疫排斥反應、變態反應和自身免疫性疾病的治療中具有潛在的前景，為DCregs的靶向治療和細胞治療提供了進一步的支持。

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（2015-10-23收稿2015-10-30修回）

（本文編輯李鵬）

The differential effects of traditional Chinese medicine Danchaiheji on dendritic cells

LI Yingxi1, CHEN Dan2, WANG Xiaodong2, JING Yaqing1, LI Keqiu1, LI Guang1
1 Department of Biology, Basic Medical College, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China;
2 Department of Pharmacology, Basic Medical College Corresponding Author E-mail：lig@tmu.edu.cn

Abstract:Objective To explore the effects of traditional Chinese formula Danchaiheji on the differentiation of regula?tory dendritic cells (DCs) and the underlying mechanism. Methods The rat blood serums with or without the formula Dan?chaiheji were prepared. The peripheral blood mononuclear cells were separated from the peripheral venous blood of healthy donors. CD14+monocytes were isolated using CD14+magnetic beads and cultured for 5-7 days to obtain immature dendritic cells (imDCs). Then the cells was divided into control group and Danchaiheji containing rat serum group. Control group was divided into two subgroups (containing LPS and without LPS). Danchaiheji containing rat serum group was also divided into two subgroups (containing LPS and without LPS). The surface markers CD86, CD11b and HLA-DR of DCs were detected by flow cytometry. The level of IL-10 was determined by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The proliferation of al?logeneic T-cells was detected by flow cytometry and the expression level of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) was deter?mined using quantitative real-time PCR. Results DCs treated with the formula Danchaiheji exhibited high CD11b and low CD86 and HLA-DR expression levels as well as promoted the secretion of IL-10. In addition, the drug could inhibit the pro?motion of DCs on the proliferation of T cells, which was associated with the up-regulation of IDO expression. Conclusion The traditional Chinese formula Danchaiheji can induce the differentiation of DCs into regulatory DCs and play a role in in?hibitory effect on immune function.

Key words:dendritic cells；immune tolerance；indoleamine-pyrrole 2,3,-dioxygenase; regulatory dendritic cells；immu?nomodulation

中圖分類號：R392.4

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150255

基金項目：國家高技術研究發展計劃（863計劃）資助項目（2012AA021003）；國家自然科學基金資助項目（21177091）

作者簡介：李穎曦（1990），女，碩士在讀，主要從事免疫耐受方面研究

通訊作者E-mail：lig@tmu.edu.cn