去腎交感神經術對心肌梗死犬下丘腦血管緊張素Ⅱ及氧化應激水平的影響

馬藝杰，盧成志，李超，張瑾，王麗，宋立君

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去腎交感神經術對心肌梗死犬下丘腦血管緊張素Ⅱ及氧化應激水平的影響

馬藝杰1，盧成志2，李超2，張瑾2，王麗2，宋立君3

摘要:目的探討去腎交感神經術對心肌梗死（MI）犬下丘腦血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）及氧化應激水平的影響。方法18只犬隨機均分為MI組、MI+去腎交感神經術組（RDN組）和假手術組。前2組通過明膠海綿栓塞法建立MI模型，假手術組只行冠脈造影檢查。MI后1周對RDN組行去腎交感神經術，余2組只行腎動脈造影檢查。MI后4周檢測AngⅡ、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量及尼克酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶亞基gp91phox蛋白的表達。結果與假手術組相比，MI組下丘腦AngⅡ、MDA含量增加，gp91phox蛋白表達增加，SOD活性降低（P＜0.01）。MI組AngⅡ與SOD活性呈負相關，與gp91phox蛋白表達量呈正相關（r分別為-0.849和0.950，P＜0.01）。RDN組較MI組AngⅡ、MDA含量降低，gp91phox蛋白表達降低，SOD活性增加（P＜0.01）。結論去腎交感神經術可以降低下丘腦AngⅡ含量，抑制NADPH氧化酶表達，降低氧化應激水平，改善MI后心功能。

關鍵詞:心肌梗死；下丘腦；血管緊張素Ⅱ；氧化性應激；疾病模型,動物；去腎交感神經術

作者單位：1天津醫科大學一中心臨床學院（郵編300192）；2天津市第一中心醫院心內科，3消化科

心肌梗死（MI）時，交感神經的過度激活會促進MI后心肌、交感神經重構，導致心力衰竭（心衰）、惡性心律失常等的發生，影響遠期預后[1-2]。因此，抑制增強的交感神經活性是MI治療的重要靶點。下丘腦是神經內分泌活動的重要調節中樞，通過多種機制主動參與交感神經活性的調節[3]，其中腎素-血管緊張素系統(RAS）、活性氧簇（ROS）等體液機制起重要作用[4]。去腎交感神經術（renal denervation, RDN）通過選擇性阻斷腎交感神經，除可用于頑固性高血壓的治療[5]外，還可用于左室肥厚、惡性心律失常、心功能不全等其他高交感神經活性疾病的治療[6-7]。然而，目前有關RDN治療MI的中樞機制尚未明確。Yu等[4]在MI大鼠下丘腦內發現,尼克酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)氧化酶活性增加,予以血管緊張素（Ang）Ⅱ受體拮抗劑可以降低NADPH氧化酶活性，抑制ROS生成，降低交感神經活性，改善心功能。因此，筆者推測抑制中樞及外周AngⅡ、氧化應激水平可以作為高交感神經活性MI的治療靶點之一。本研究旨在觀察RDN對MI犬下丘腦AngⅡ及NADPH氧化酶的影響，以探討RDN治療MI的可能中樞機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器AngⅡ酶聯免疫試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；羊抗gp91phox一抗購于美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的抗羊抗體購于北京中杉金橋；-80℃冰箱購于日本SANYO公司；Ep?pendorf離心機購于德國Eppendorf公司；GSM-Ⅱ麻醉呼吸機購于北京宏潤達科技發展有限公司；Allura Xper FD10心血管X線系統購于荷蘭Philips公司；IBI-1500T射頻消融儀購于美國IBI公司；6F冷鹽水消融導管購于北京心諾普醫療。

1.2實驗動物及分組18只健康雜種犬，10～12月齡，雄性8只，雌性10只，購于天津春樂實驗動物中心。采用簡單隨機化分組分為3組：假手術組6只，只行冠狀動脈（冠脈）造影，1周后行腎動脈造影；MI組6只，MI造模后1周行腎動脈造影；RDN組6只，MI造模后1周行RDN。

1.3 MI模型構建及RDN模型構建參照文獻[8]，6%戊巴比妥鈉30 mg/kg靜脈麻醉后，犬仰臥位固定，氣管插管機械通氣，穿刺股動脈行冠脈造影，于前降支第一對角支遠端微導管注射自制直徑約1 mm的明膠海綿顆粒。栓塞后10 min再次行冠脈造影，以靶血管呈“殘根樣”改變，確認血流阻斷，作為判斷構建MI模型成功的標準。造模后假手術組犬無死亡，MI組和RDN組各有1只犬分別于MI后1 d、3 d死亡。MI后1周對RDN組行RDN，連接IBI-1500T射頻消融儀，設定溫度43℃，功率10 W，穿刺股動脈和腎動脈造影定位后，于腎動脈主干近端約1/2處開始，由遠及近行環形4點消融，每點持續90 s，對側腎動脈重復此操作。MI組及假手術組只行腎動脈造影。

1.4下丘腦AngⅡ、gp91phox蛋白測定MI后4周處死各組犬，開顱，于灰結節和視交叉之間留取下丘腦，-80℃冰箱保存。（1）AngⅡ蛋白表達水平測定。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定AngⅡ含量：嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，450 nm波長下測光密度（OD）值并繪制標準曲線圖。在標準曲線圖上根據每個待測樣品的OD值查找出其相對應的濃度。（2）Western blot檢測gp91phox蛋白表達水平。按BCA蛋白定量試劑盒說明書測定各樣品總蛋白濃度。上樣

電泳后移至PVDF膜上，封閉，加gp91phox一抗（1∶500）4℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標記二抗，ECL顯影并定影后Image J 1.48u軟件分析蛋白條帶，用目的蛋白與內參β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.5下丘腦SOD、MDA測定采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，硫代巴比妥酸法檢測MDA，按照試劑盒說明書操作，根據標準曲線計算公式計算MDA、SOD含量。MDA含量（μmol/g）=（測定OD值-對照OD值）/（標準OD值-空白OD值）×標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度。SOD（U/mg）活力=（對照OD值-測定OD值）/對照OD值÷50%×反應液總體積/取樣量÷待測樣本蛋白濃度。

1.6統計學方法采用SPSS 20.0軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗，相關性采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組犬下丘腦AngⅡ和gp91phox蛋白表達（1）AngⅡ。MI后4周，假手術組、MI組、RDN組的AngⅡ含量（μg/L）分別為1.81±0.08、2.54±0.06及2.10± 0.09（F=120.75, P＜0.01），其中MI組、RDN組高于假手術組，RDN組低于MI組（均P＜0.01）。（2）gp91phox。假手術組、MI組、RDN組下丘腦gp91phox蛋白相對表達量分別為0.54±0.15、1.36± 0.05及0.93±0.10（F=70.39，P＜0.01）。其中MI組、RDN高于假手術組，RDN組低于MI組（均P＜0.01）。見圖1。

Fig. 1 The expression of gp91phox protein in hypothalamus of three groups圖1各組犬下丘腦gp91phox蛋白表達

2.2各組犬下丘腦MDA、SOD含量與假手術組比較，MI組MDA含量明顯升高、SOD含量降低(P＜0.01)；與MI組比較，RDN組MDA含量降低、SOD含量升高（P＜0.01），見表1。

Tab. 1 The levels of MDA and SOD in hypothalamus of three groups表1各組犬下丘腦MDA、SOD含量（x ±s）

2.3 AngⅡ與gp91phox、SOD表達水平的相關性分析MI組AngⅡ與SOD呈負相關，與gp91phox蛋白表達量呈正相關（r分別為-0.849和0.950, P＜0.01）。

3　討論

各種原因引起ROS生成與抗氧化系統失衡時，即可產生氧化應激[9]。ROS主要由NADPH氧化酶催化生成，其中gp91phox是其重要的功能亞基[10]。Sun等[11]在下丘腦神經元細胞中發現，AngⅡ可以增加gp91phox活性，促進ROS的生成，增加神經元活性。Su等[10]在大鼠高血壓模型中證實，AngⅡ通過激活NADPH氧化酶促進ROS生成，進而參與對外周交感神經活性的調節。研究證實，RDN可以降低循環RAS，改善MI后心肌重構治療MI；且效果優于單一血管緊張素轉化酶抑制劑、AngⅡ受體拮抗劑或美托洛爾藥物治療[12]。筆者前期研究表明，RDN可以降低心臟氧化應激水平，抑制MI后心臟交感神經重構，改善心功能[13]。然而RDN對MI后中樞AngⅡ、氧化應激影響的研究甚少。本實驗采用明膠海綿栓塞法構建MI模型，觀察RDN對MI犬下丘腦AngⅡ、gp91phox的影響，探討RDN治療MI的可能中樞機制。與Yu等[4]研究結果一致，本實驗發現，MI組較假手術組下丘腦局部AngⅡ含量增多，gp91phox表達增加，且下丘腦AngⅡ含量與gp91phox蛋白表達量呈正相關；行RDN后下丘腦內增加的AngⅡ及gp91phox顯著降低，表明RDN可以降低MI犬中樞AngⅡ含量、抑制gp91phox表達，改善心功能。

MDA是脂質過氧化產物，代表機體氧化水平；SOD是抗氧化酶，能清除氧自由基，代表機體抗氧化水平[14]。Jing等[15]研究發現，MI大鼠血清及心肌MDA含量升高，SOD活性下降，抗氧化劑可以降低MDA含量，升高SOD活性，縮小MI面積，改善心功能。Siddiqui等[16]在臨床中亦發現，MI患者血清MDA含量升高，SOD活性下降。本研究顯示，MI組犬下丘腦MDA含量、gp91phox蛋白表達均較假手術組增多，同時SOD活力降低，表明下丘腦處于氧化應激狀態；行RDN后MDA含量、gp91phox蛋白表達減少，SOD活力增加，表明下丘腦氧化應激水平降低，提示RDN可能通過抑制下丘腦NADPH氧化酶亞基gp91phox表達，減少ROS生成，從而降低下丘腦氧化應激水平。研究證實，中樞ROS作為AngⅡ的下游信號分子，可通過影響K+、Ca2+通道的通透性[17]、核轉錄因子活性[18]以及神經遞質等的釋放，進而介導對交感神經活性的調節。因此，RDN可能通過選擇性阻斷交感神經、降低下丘腦AngⅡ水平，從而降低氧化應激水平。

綜上所述，RDN可以降低下丘腦AngⅡ含量、抑制NADPH氧化酶表達，進而降低氧化應激水平，改善MI后心功能。

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（2015-07-20收稿2015-10-03修回）

（本文編輯陸榮展）

The effects of renal denervation on hypothalamus angiotensinⅡand oxidative stress in myocardial infarction dogs

MA Yijie1, LU Chengzhi2, LI Chao2, ZHANG Jin2, WANG Li2, SONG Lijun3
1 First Center of Clinical College, Tianjin Medical University，Tianjin 300192, China; 2 Department of Cardiology, 3 Department of Gastroenterology, Tianjin First Center Hospital Corresponding Author E-mail:lucz8@126.com

Abstract:Objective To explore the effects of renal denervation (RDN) on hypothalamus angiotensinⅡ(AngⅡ) and oxidative stress in myocardial infarction (MI) dogs. Methods Eighteen mongrel dogs were randomly divided into MI group (n=6), RDN group (n=6) and sham operation group (n=6). Myocardial infarction model was made in the former two groups by gelatin sponge embolization of the left anterior descending artery. One week after MI, RDN was given to dogs in RDN group. Levels of AngⅡ, malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and expression of gp91phox protein were detected four weeks after MI. Results Compared with control group, hypothalamus AngⅡ, MDA and expression of gp91phox protein were increased in MI group (P＜0.01), but SOD was decreased (P＜0.01). There was a negative correlation between AngⅡand SOD activity in MI group (r=-0.849, P＜0.01). There was a positive correlation between AngⅡand expression of gp91phox protein in MI group (r=0.950, P＜0.01). Compared with MI group, hypothalamus AngⅡ, MDA and expression of gp91phox protein were decreased in RDN group (P＜0.01), but SOD was increased (P＜0.01). Conclusion RDN can de?crease the level of hypothalamus AngⅡand the level of hypothalamus oxidative stress, and improve heart function of MI dogs.

Key words:myocardial infarction；hypothalamus；angiotensinⅡ；oxidative stress；disease models, animal；renal dener?vation surgery

中圖分類號：R542.22

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150032

基金項目：天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目（14JCYBJC26100）；天津市衛生局科技基金項目（2014KY11）

作者簡介：馬藝杰（1990），女，碩士在讀，主要從事高血壓、冠心病研究

通訊作者E-mail：lucz8@126.com