建立不同類型干細胞并比較其分泌細胞因子的水平

張琴靜，陳愛琴，寧松，高超，蔣春艷，崔毓桂，陳娟，覃蓮菊，劉嘉茵

(南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學科，南京　210029)

·實驗研究·

建立不同類型干細胞并比較其分泌細胞因子的水平

張琴靜，陳愛琴，寧松，高超，蔣春艷，崔毓桂，陳娟，覃蓮菊*，劉嘉茵*

(南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學科，南京210029)

【摘要】目的比較不同類型干細胞分泌細胞因子的水平，探討其潛在的臨床意義。方法建立人類胚胎干細胞(hESCs)、臍帶間充質干細胞(UMSCs)、羊膜間充質干細胞(AMSCs)株系；實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)分析干細胞分泌細胞因子水平：(1)促炎因子，包括白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子(TNF-α)；(2)抑炎因子白細胞介素-10(IL-10)；(3)生長因子，包括肝細胞生長因子(HGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、干細胞因子(SCF)和血管內皮生長因子(VEGF)；(4)基質金屬蛋白酶MMP-1及其抑制劑TIMP-1；(5)血管形成因子(Angiogenin)，白血病抑制因子(LIF)以及骨形成蛋白(BMP4)。結果女性UMSCs分泌生長因子、血管生成因子、造血因子、抑炎因子等的能力顯著強于hESCs、AMSCs(P<0.05)；女性hESCs、男性UMSCs分泌金屬蛋白酶的水平顯著高于其它干細胞(P<0.05)。結論女性UMSCs可能具有更好的促進細胞生長、改善血供的能力；而女性hESCs、男性UMSCs則可能具有更強的降解結締組織的能力。

【關鍵詞】人胚胎干細胞；人羊膜間充質干細胞；人臍帶間充質干細胞；細胞分泌因子

Methods： The cell lines of human embryonic stem cells (hESCs)，umbilical cord mesenchymal stem cells (UMSCs) and amniotic mesenchymal stem cells (AMSCs) were established and identified. The expressions of secretory cytokines，such as：(1) pro-inflammatory factors of IL-6，IL-8 and TNF-α；(2) anti-inflammatory factor of IL-10；(3) Growth factors (HGF，BDNF，SCF and VEGF)；(4) matrix metalloprotein (MMP-1) and its inhibitor TIMP-1；(5) angiogenic factor，LIF and BMP4 were determined by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR).

Results： The expresses of growth factors，angiogenic factor，LIF and IL-10 in female UMSCs were significantly higher than those in hESCs and AMSCs(P<0.05). The expressions of MMP-1 in female hESCs and male UMSCs were significantly higher than those in other stem cell lines (P<0.05).

Conclusions： Female UMSCs may have stronger capacity to promote cell growth and improve blood supply. Female hESCs and male UMSCs may be more powerful in degradation of connective tissue.

(JReprodMed2016，25(6)：528-539)

干細胞是一種具有自我更新、增殖能力的特殊細胞，且具有多向分化潛能，在特定培養條件下能分化為特定類型的細胞[1]。最近幾年，認為干細胞治療是能夠修復和恢復受傷組織正常功能，具有潛力的替代治療方法[2]。卵巢功能早衰(POF)是引起女性不孕的常見原因，同時也增加了女性退行性疾病的發生率，如心血管疾病、骨質疏松、認知障礙[3-5]。針對POF的治療，目前廣泛接受的是激素替代療法(HRT)[6]，但該療法大大增加了靜脈血栓、卵巢癌和乳腺癌發生的風險[7-8]。另一類治療方法是將卵巢組織、卵母細胞或胚胎進行冷凍保存[9]，但依舊不能根治POF。研究顯示，移植間充質干細胞可恢復雌性POF模型小鼠的卵巢功能[10-13]。

研究顯示，移植的間充質干細胞是通過分泌細胞因子，而不是通過分化為新的卵母細胞改善受損卵巢的功能[14]。此外，直接注射細胞培養上清可改善受損器官的功能[15-16]。目前認為，干細胞分泌的細胞因子中，促炎因子可促進炎癥反應和組織損傷；而機體釋放的抗炎因子，如白細胞介素-10(IL-10)，具有抗炎和免疫調節的作用[17]；細胞生長因子則主要促進細胞增殖與分化，但不同的細胞因子也具有其特異的生物學功能，如血管內皮生長因子(VEGF)具有促進血管內皮細胞分裂、誘發血管形成及增加血管通透性的功能[18]，而肝細胞生長因子(HGF)則在細胞運動、侵襲轉移、上皮間質轉化中發揮重要作用[19]；金屬蛋白酶及其抑制劑主要維持機體結締組織的平衡[20]。另外，骨形成蛋白4(BMP4)主要參與骨的形成與胚胎發育[21]；白血病抑制因子(LIF)在不同細胞的作用不同，包括刺激或抑制細胞的增殖、分化或存活，同時也可促進胚胎發育[22]；血管生成素(Angiogenin)則可促進新生血管形成，同時通過調節細胞增殖、存活、遷移、侵襲、分化，在各種生理病理過程中發揮重要作用[23]。預測，將來干細胞培養上清提取物可直接作為注射劑治療包括POF在內的相關疾病。

然而，不同類型干細胞分泌細胞因子的種類、質量可能具有較大差異，因此適應證及療效也具有差異性。另外，推測不同性別的同類型干細胞分泌的細胞因子種類、質量可能也存在差異，對癥治療時應精準選擇。本研究為探明不同類型干細胞分泌細胞因子的質量，為將來干細胞治療生殖相關疾病提供依據，將比較不同種類、不同性別干細胞中細胞分泌因子的表達水平。

材料與方法

一、材料

人胚胎干細胞(hESC)系CCRM22由本實驗室構建[24]；α-MEM、DMEM F/12、Knockout血清替代物(knockout serum replacement，KSR)、1% L-谷氨酰胺(LG)、1%青霉素-鏈霉素(PS)、1%非必需氨基酸(NEAA)、膠原酶Ⅵ、Trizol、DPBS、CTSTMTrypLETMSelect Enzyme(Gibco，美國)；絲裂霉素C、α-二巰基乙醇、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸(VitC)、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma，美國)；間充質干細胞成軟骨分化培養基(Promo cell，德國)；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(Peprotech，美國)，血小板裂解物(Helios，中國)；胰島素、肝素鈉、反轉錄(PCR)試劑盒(Takara，日本)；PCR引物由南京瑞真生物技術有限公司合成。

兔多克隆抗體OCT4、NONAG、小鼠單克隆抗體SSEA-4羊抗兔二抗(紅色)、羊抗鼠二抗(綠色)(Abcam，美國)；流式抗體PE Mouse-Anti-Hman CD44、CD73、CD90、CD105、CD11b/Mac-1、CD19、CD34、CD45，FITC-Mouse-Anti-Human HLA-DR，DP，DQ、PE-Mouse-IgG2b、FITC-Mouse-IgG2a(BD，美國)；Mount封片劑(SBA，美國)。

二、方法

hESC細胞系CCRM15和CCRM22來源于不孕不育夫婦向本院生殖中心捐贈的廢棄胚胎。羊膜間充質干細胞來源的羊膜、臍帶間充質干細胞來源的臍帶，均由足月剖宮產產婦捐贈。實驗方案取得醫院倫理委員會批準，捐獻志愿者均簽署了書面知情同意書。

(一)人胚胎干細胞的建系及鑒定

1.胚胎干細胞的建系及培養：參照本實驗既往建立hESC的方法[24-25]建立胚胎干細胞系CCRM15。簡要步驟如下：提前準備滋養層小鼠成纖維細胞(MEF)，在胚胎第6天，將去除透明帶的囊胚種植于MEF上，每天更換ES培養基(DMEM/F12+20% KO-SR+1% LG+1% PS+1% NEAA+0.1 mmol/L α-二巰基乙醇+10 ng/ml bFGF)，待出現克隆樣生長的細胞團，機械法傳代(5代后用1 mg/ml 膠原酶Ⅵ消化后傳代)。

2.人胚胎干細胞表面標志物表達鑒定：4%多聚甲醛室溫固定hESCs，杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)洗滌，0.4% Triton X-100/PBS破膜，然后依次用5%BSA封閉、加一抗OCT4(1∶200)、NANOG(1∶200)、SSEA-4(1∶500)，過夜；洗滌后加二抗，室溫避光孵育，DPBS洗滌，Mount封片，熒光顯微鏡拍照。

3.擬胚狀體分化：hESCs克隆用1 mg/ml膠原酶Ⅳ不完全消化，使其保持團塊狀；接種至不貼壁培養皿內，加入不含bFGF的hESCs培養基；隔天換液，培養7 d。

4.基因組測序鑒定核型：收集培養至第6天的hESCs，應用美國Life TECH公司的Ion Torrent PGM測序系統，對人類全基因組進行較低深度(0.07X覆蓋度)的高通量全基因組測序。

(二)間充質干細胞的建系及鑒定

1.羊膜間充質干細胞的建系及培養：本實驗室改進了Marongiu等[26]的方法進行人類羊膜間充質干細胞(AMSC)的分離，建立AMSC株系AMSC1.2.2 (46，XY)、AMSC2.2.2 (46，XX)。簡述如下：DPBS清洗羊膜去除血細胞，加入Tryple，37℃水浴30 min；再次洗滌剩余組織，加入新鮮Tryple，37℃水浴45 min；加入PLT培養液(α-MEM+5%血小板裂解物+1%LG+2000u/ml肝素鈉)中和，離心棄上清；PLT培養液重懸細胞，種于培養皿，每3 d換液；當細胞融合度達80%～90%時，1∶4傳代。

2.臍帶間充質干細胞的建系及培養：本實驗按以下方法分離人類臍帶間充質干細胞(UMSC)，建立UMSC株系UMSC2.2.2(46，XX)、AMSC4.2.2(46，XY)：臍帶用DPBS清洗后剪成2 cm的小塊，抽除動、靜脈；將臍帶小塊剪碎成2 mm左右碎片，移至培養皿中均勻鋪開；加入少量PLT培養液濕潤組織，培養皿倒置放入培養箱培養24 h；加入足量血小板裂解物(PLT)培養基，繼續培養1～2周，加入Tryple消化組織塊周圍爬出的細胞，1∶3傳代。

3.流式細胞技術檢測AMSCs和UMSCs細胞表面標志物：AMSCs和UMSCs 均在第三代(P3)進行檢測。檢測基因包括血管細胞相關標志(CD11b、CD19、CD34、CD45)、間充質干細胞表面標志(CD44、CD73、CD90、CDl05)和免疫排斥相關的表面標志(HLA-DP/DQ/DR)。DPBS洗滌細胞，Tryple消化，等量PLT培養液中和后離心、重懸、分裝；分別加入鼠抗人流式抗體及相對應的同型對照，4℃避光放置20 min；離心、洗滌，加入DPBS重懸細胞，上機檢測(型號Gallios，Beckman，美國)。

4.AMSCs和UMSCs分化潛能檢測：AMSCs和UMSCs分別均在P3代進行中胚層分化誘導實驗。①成骨分化：細胞用DPBS洗滌后加入成骨分化培養基(DMEM+10% FBS+1% PS+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+0.1 μmol/L地塞米松+50 mg/L抗壞血酸)，每3 d換液，培養至21 d；茜素紅染色。②成脂分化：細胞用DPBS洗滌后加入成脂分化培養基(DMEM+10% FBS+1 μmol/L地塞米松+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+10 mg/L胰島素)，每3 d換液，培養至14 d；油紅O染色。③成軟骨分化：將細胞種于U型96孔板內(1×105cells/孔)，PLT培養，細胞成球后，培養液更換為商品化成軟骨分化培養基，每3 d換液，培養21 d；阿辛藍染色。

5.遺傳標志檢測-STR圖譜鑒定AMSCs和UMSCs：利用遺傳標志檢測-STR圖譜鑒定AMSCs和UMSCs的純合性以及核型，該實驗由南京醫科大學醫學檢驗學院完成。

(三)實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)

在CCRM15 (46，XX)、CCRM22 (46，XY)培養的第6天，加入膠原酶IV、Dispase消化為細胞克隆并收集、洗滌，然后加入tryple消化成單細胞；在AMSC1.2.2 (46，XY)、AMSC2.2.2 (46，XX)、UMSC2.2.2 (46，XX)、UMSC4.2.2 (46，XY)培養的第3天、細胞呈90%融合度時，加入tryple消化成單細胞。在以上細胞中加入適量的Trizol 試劑，按照Trizol試劑操作說明書提取總RNA；根據 Takara公司的逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，獲得cDNA為模板分別以下述引物(表1)，在RT-PCR儀(Life Technologies，美國)進行RT-qPCR檢測。反應過程如下：94℃預變性1 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，以上過程進行30個循環；最后72℃延伸5 min。每個樣品以其β-actin的表達量進行定量，實驗重復3次，結果以倍數改變±SD表示。

表1　各細胞因子引物序列

三、統計學方法

結果

一、建立、鑒定hESC細胞系

我們之前的研究證實CCRM22(46，XY)具有hESC的典型特征[24]。本次實驗建立的CCRM15特性與CCRM22一致：細胞呈克隆狀生長(圖1A)，能形成擬胚體(圖1B)，表達多能性標志物OCT4、NONAG、SSEA-4(圖1C)；另外，測序結果顯示其染色體核型為46，XX (圖1D)。

二、建立、鑒定AMSC、UMSC株系

成功建立AMSCs細胞系兩株，命名為AMSC1.2.2及AMSC2.2.2。P0時細胞混有少量羊膜上皮細胞，純化至P3時細胞呈典型的間充質細胞形態，呈放射狀或漩渦狀分布(圖2A)。

建立UMSCs細胞系兩株，命名為UMSC2.2.2和UMSC4.2.2。在組織塊貼壁培養約7 d左右組織塊周圍有細胞爬出，至貼壁培養14 d左右第一次傳代，其后每3～4 d可傳代，細胞形態為梭形，為間充質細胞形態(圖2B)。

細胞系遺傳標志檢測-STR圖譜結果顯示：UMSC2.2.2為46，XX；AMSC1.2.2和UMSC4.2.2來自同一胎盤，為46，XY；AMSC2.2.2已知胎兒性別為女性，即為46，XX。

流式細胞檢測結果表明：新建立的AMSC、UMSC系均符合間充質干細胞的質量鑒定標準[27]，其中CD44、CD73、CD90和CD105陽性率均超過95%，而CD11b、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR/DP/DQ的陽性率均<2%(圖3A～D)。

新建立的AMSCs、UMSCs均具有向中胚層分化潛能。在誘導分化條件下，4種間充質干細胞均可被誘導分化為成脂細胞(油紅陽性)、成骨細胞(茜素紅染色陽性)和成軟骨細胞(阿辛藍染色陽性)(圖4)。

三、hESC、AMSC和UMSC細胞分泌因子基因表達水平的比較

選取生殖細胞發育相關的高分泌的細胞因子進行分析。選取細胞因子種類包括：(1)促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α；(2)抑炎因子IL-10；(3)生長因子HGF、BDNF、SCF和VEGF；(4)基質金屬蛋白酶MMP-1及其抑制劑TIMP-1；(5)血管形成因子Angiogenin，造血因子LIF和骨形成蛋白BMP4。

(一)同種類型、不同性別干細胞中細胞分泌因子表達水平的比較

1.不同性別hESC中細胞分泌因子表達水平的比較：比較女性胚胎干細胞株系CCRM15(46，XX)、男性胚胎干細胞株系CCRM22(46，XY)中細胞分泌因子的相對表達水平(圖5)。發現：(a)促炎因子IL-6、IL-8低水平表達，TNF-α極低水平表達，且在CCRM15中的表達水平分別為CCRM22的4.3倍(P<0.01)、10.3倍(P<0.001)、13.9倍(P<0.001)。(b)抑炎因子IL-10在兩種hESCs中表達水平極低，在CCRM22中的表達水平約為CCRM15的2.1倍(P<0.01)。(c)生長因子在hESCs中表達水平較高，其中SCF、BDNF及HGF在CCRM22中的表達均顯著高于CCRM15，分別為1.3倍(P<0.01)、3.4倍(P<0.01)、3.8倍(P<0.001)；VEGF的表達水平無顯著的性別差異(P>0.05)。(d)金屬蛋白酶MMP-1及其抑制劑TIMP-1在hESCs中高水平表達，且在CCRM15中的表達水平均顯著高于CCRM22，分別為6.1倍(P<0.001)、1.1倍(P<0.001)。(e)BMP4在hESCs中高水平表達，但無顯著的性別差異(P>0.05)；LIF在hESCs中低水平表達，且在CCRM22中的表達量顯著高于CCRM15(1.9倍，P<0.01)；Angiogenin的表達水平與LIF相當，但在CCRM15中較高，為CCRM22中表達量的1.6倍(P<0.01)。

A：CCRM15和CCRM27均呈克隆狀生長，核質比高，邊界清晰(×4)；B：CCRM15能形成擬胚狀體，圖為擬胚狀體培養Day 4和Day 7時形態(×10)；C：免疫熒光檢測CCRM15多能性基因，其中OCT4、NANOG紅色信號為陽性，SSEA-4綠色信號為陽性，藍色為PAPI染核(×10)；D：基因組測序結果表明CCRM的核型為46，XX。標尺=50 μm圖1　CCRM15的細胞形態及多能性鑒定

圖2　間充質干細胞的細胞形態

A：AMSC2.2.2；B：AMSC1.2.2；C：UMSC2.2.2；D：UMSC4.2.2。圖中橫坐標均表示熒光強度，縱坐標均表示細胞計數。 CD44、CD73、CD90以及CD105陽性率>95%，CD11b、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR/DP/DQ陽性率<2%圖3　AMSCs和UMSCs表面標志物流式檢測

AMSC2.2.2、AMSC1.2.2、UMSC2.2.2、UMSC4.2.2在體外誘導條件下向中胚層分化：成脂、成骨、成軟骨分化。成脂分化為油紅O染色陽性，成骨分化為茜素紅染色陽性，成軟骨分化為阿辛藍染色陽性(均為×10)圖4　AMSCs和UMSCs具有向中胚層組織細胞分化潛能

以CCRM15為基數，比較各因子的相對表達倍數。*P<0.01；#P<0.001圖5　hESC株系CCRM15、CCRM22中細胞分泌因子相對表達水平比較

2.不同性別AMSC中細胞分泌因子表達水平的比較：比較羊膜間充質干細胞女性株系AMSC2.2.2 (46，XX)和男性株系AMSC1.2.2(46，XY)中細胞分泌因子的相對表達水平(圖6)。結果表明：(a)促炎因子IL-6、IL-8高表達，且AMSC2.2.2中的表達水平顯著高于AMSC1.2.2，分別為3.4倍(P<0.01)、8.6倍(P<0.01)；而TNF-α表達水平極低，且無顯著的性別差異(P>0.05)。(b)抑炎因子IL-10表達水平極低，且無顯著的性別差異(P>0.05)。(c)生長因子在AMSCs中高表達，其中BDNF、HGF在AMSC2.2.2中的表達量顯著高于AMSC1.2.2，分別為1.2倍(P<0.05)、3.9倍(P<0.001)；與此相反，VEGF在AMSC1.2.2的表達水平則為AMSC2.2.2中的3.1倍(P<0.01)；SCF的表達量無顯著的性別差異(P>0.05)。(d)金屬蛋白酶MMP-1低水平表達，其抑制劑TIMP-1以極高水平表達，但兩種分泌因子的表達水平均無顯著的性別差異(P>0.05)。(e)BMP4高水平表達，Angiogenin、LIF低水平表達，且在AMSC1.2.2中的表達水平均顯著高于AMSC2.2.2，分別為5.4倍(P<0.001)、3.3倍(P<0.001)、1.8倍(P<0.01)。

3.不同性別UMSC中細胞分泌因子表達水平的比較：比較臍帶間充質干細胞女性株系UMSC2.2.2(46，XX)和男性株系UMSC4.2.2(46，XY)中細胞分泌因子的表達水平(圖7)。結果顯示：(a)促炎因子IL-6、IL-8高表達，TNF-α極低表達，且IL-6、IL-8在UMSC2.2.2中的表達水平顯著高于UMSC4.2.2，分別為3.9倍(P<0.001)、6.1倍(P<0.001)；而TNF-α在UMSC4.2.2中的表達水平顯著高于UMSC4.2.2(10.3倍，P<0.01)。(b)抑炎因子IL-10在以極低水平表達，但UMSC4.2.2中的表達水平顯著高于UMSC2.2.2(1.9倍，P<0.01)。(c)生長因子在兩種性別細胞中均高表達，其中BDNF、HGF在UMSC2.2.2中的表達水平顯著高于UMSC4.2.2，分別為2.6倍(P<0.001)、5.5倍(P<0.001)，而VEGF在UMSC4.2.2中的表達水平較高，為UMSC2.2.2的1.4倍(P<0.05)；SCF的表達水平無顯著的性別差異(P>0.05)。(d)金屬蛋白酶MMP-1在UMSCs中低水平表達，且UMSC4.2.2中的表達水平顯著高于UMSC2.2.2(9.6倍，P<0.001)；而其抑制劑TIMP-1在UMSCs中高表達，且在UMSC2.2.2中的表達水平為UMSC4.2.2中的3.8倍(P<0.05)。(e)BMP4、Angiogenin在UMSC2.2.2低水平表達，BMP4表達水平在UMSC4.2.2中顯著高于UMSC2.2.2(1.8倍，P<0.05)；而Angiogenin、LIF的表達水平無顯著的性別差異(P>0.05)。

以AMSC2.2.2為基數，比較各因子的相對表達倍數。*P<0.05；**P<0.01；#P<0.001圖6　AMSC株系AMSC2.2.2、AMSC1.2.2中細胞分泌因子相對表達水平比較

以UMSC2.2.2為基數，比較各因子的相對表達倍數。*P<0.05；**P<0.01；#P<0.001圖7　UMSC株系UMSC2.2.2、UMSC4.2.2中細胞分泌因子相對表達水平比較

(二)不同類型、同性別干細胞中細胞分泌因子表達水平的比較

1.不同類型女性干細胞中細胞分泌因子表達水平的比較：兩兩比較女性干細胞系CCRM15、AMSC2.2.2、UMSC2.2.2中細胞分泌因子的相對表達水平(圖8)。發現：(a)促炎因子IL-6、IL-8表達水平在三種細胞間存在顯著差異，其中IL-6的相對表達量排序為AMSC2.2.2(4.9倍，P<0.001)>UMSC2.2.2(3.0倍，P<0.001)>CCRM15，IL-8為UMSC2.2.2(2.0倍，P<0.001)>AMSC2.2.2(3.0倍，P<0.001)>CCRM15；而TNF-α在CCRM15的相對表達量顯著高于AMSC2.2.2(16.0倍，P<0.001)和UMSC2.2.2(47.1倍，P<0.001)，但AMSC2.2.2和UMSC2.2.2間并無顯著差異(P>0.05)。(b)抑炎因子IL-10在CCRM15的相對表達量顯著高于AMSC2.2.2(2.0倍，P<0.05)和UMSC2.2.2(3.1倍，P<0.01)，但AMSC2.2.2和UMSC2.2.2間無顯著差異(P>0.05)。(c)生長因子VEGF、HGF的表達量在CCRM15、AMSC2.2.2、UMSC2.2.2三者間均存在顯著差異性，VEGF表達量排列順序為UMSC2.2.2(5.6倍，P<0.01)>AMSC2.2.2(2.5倍，P<0.05)>CCRM15，HGF為UMSC2.2.2(3.6倍，P<0.01)>AMSC2.2.2(3.9倍，P<0.01)>CCRM15；BDNF在AMSC2.2.2、UMSC2.2.2中的表達水平均顯著高于CCRM15，分別為2.1倍(P<0.01)、2.0倍(P<0.01)，但AMSC2.2.2、UMSC2，2.2之間無顯著差異(P>0.05)；SCF在三種細胞系間的表達水平無顯著差異性(P>0.05)。(d)金屬蛋白酶MMP-1及其抑制劑TIMP-1的相對表達水平在CCRM15、AMSC2.2.2和UMSC2.2.2三者間均存在顯著差異，MMP-1的表達水平排列順序為CCRM15(5.4倍，P<0.001)>AMSC2.2.2(5.0倍，P<0.01)>UMSC2.2.2，TIMP-1則為AMSC2.2.2(1.1倍，P<0.001)>UMSC2.2.2(37.2倍，P<0.001)>CCRM15。(e)BMP4表達水平在CCRM15中顯著高于AMSC2.2.2(18.5倍，P<0.001)和UMSC2.2.2(7.2倍，P<0.001)，但AMSC2.2.2、UMSC2.2.2間無顯著差異(P>0.05)；LIF的表達水平在UMSC2.2.2中顯著高于CCRM15(1.4倍，P<0.05)，但UMSC2.2.2與AMSC2.2.2間、AMSC2.2.2與CCRM15間無顯著差異(P>0.05)；Angiogenin在三種細胞系中的表達水平均存在顯著差異，排列順序為UMSC2.2.2(1.2倍，P<0.05)>CCRM15(1.5倍，P<0.01)>AMSC2.2.2。

2.不同類型男性干細胞中細胞分泌因子表達水平的比較：兩兩比較男性干細胞系CCRM22、AMSC1.2.2和UMSC4.2.2中細胞分泌因子的相對表達水平(圖9)。發現：(a)促炎因子中，IL-6在UMSC4.2.2中的表達水平顯著高于CCRM22(3.3倍，P<0.01)，其它細胞系之間無顯著差異(P>0.05)；IL-8、TNF-α在三種細胞中的表達水平無顯著差異(P>0.05)。(b)抑炎因子IL-10在CCRM22中的表達水平顯著高于AMSC1.2.2(3.5倍，P<0.001)、UMSC4.2.2(3.4倍，P<0.01)，但AMSC1.2.2和UMSC4.2.2之間無顯著差異(P>0.05)。(c)生長因子SCF、VEGF、BDNF以及HGF在三種細胞中的相對表達量均存在顯著差異性：SCF表達水平排列順序為CCRM22(1.2倍，P<0.05)>AMSC1.2.2(1.3倍，P<0.05)>UMSC4.2.2，BDNF為CCRM22(2.2倍，P<0.001)>AMSC1.2.2(2.0倍，P<0.01)>UMSC4.2.2，VEGF為UMSC4.2.2(2.6倍，P<0.001)>AMSC1.2.2(21.0倍，P<0.001)>CCRM22，HGF為CCRM22(1.4倍，P<0.05)>UMSC4.2.2(2.6倍，P<0.01)>AMSC1.2.2。(d)金屬蛋白酶MMP-1在UMSC4.2.2中的表達水平顯著高于CCRM22(2.1倍，P<0.01)、AMSC1.2.2(1.8倍，P<0.01)，而在CCRM22、AMSC1.2.2間無顯著差異性(P>0.05)；金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1的表達水平在AMSC1.2.2中顯著高于CCRM22(20.7倍，P<0.001)和UMSC4.2.2(1.9倍，P<0.01)，但CCRM22和UMSC4.2.2間無顯著差異性(P>0.05)。(e)BMP4在CCRM22中的表達水平顯著高于AMSC1.2.2(3.2倍，P<0.001)、UMSC4.2.2(3.8倍，P<0.001)，而在AMSC1.2.2、UMSC4.2.2之間無顯著差異(P>0.05)；Angiogenin在三者間均有顯著差異，且AMSC1.2.2(2.0倍，P<0.001)>UMSC4.2.2(1.7倍，P<0.001)>CCRM22；LIF的相對表達量在三者之間無顯著差異(P>0.05)。

以CCRM15為基數，比較相同性別不同種類干細胞細胞分泌因子的相對表達倍數。*P<0.05；**P<0.01；#P<0.001圖8　女性株系CCRM15、AMSC2.2.2以及UMSC2.2.2中細胞分泌因子相對表達水平比較

以CCRM22為基數，比較相同性別不同種類干細胞細胞分泌因子的相對表達倍數。*P<0.05；**P<0.01；#P<0.001圖9　男性株系CCRM22、AMSC1.2.2以及UMSC4.2.2中細胞分泌因子相對表達水平比較

討論

干細胞分為胚胎干細胞(ES)和間充質干細胞(MSCs)，根據其來源又可以具體分為胚胎干細胞(ESCs)、新生兒附屬物干細胞(NDSCs)、成體間充質干細胞(ASCs)、組織干細胞(TSCs)、誘導多能干細胞(iPSCs)等，其中NDSCs、ASCs和TSCs同屬于MSCs類型。

不同來源的干細胞臨床應用范圍、價值也各不相同。因為ES具有致瘤性，且存在倫理問題，因此hES更多的是用于機制研究而很少用于臨床治療，例如用來研究生殖細胞發育的調控機制[28-29]。MSCs來源較廣，具有低免疫原性的特性，因而具有較高的臨床應用潛能。目前，MSCs已廣泛用于改善化療后所致卵巢功能減退的研究[12-13]，而進入體內的MSCs并不能進一步分化為生殖細胞。我們推測，進入小鼠體內的MSCs通過分泌細胞因子來改善卵巢功能，其作用機制與脂肪間充質干細胞分泌的細胞因子可以改善小鼠阿爾茲海默癥癥狀[30]、羊膜間充質干細胞分泌的細胞因子可減少小鼠心肌梗死面積[15]類似。

細胞因子種類繁多，具體是哪一類或哪幾類細胞因子在其中發揮關鍵作用，目前尚無定論。另外，干細胞種類不同，分泌的細胞因子數量、質量存在差異；而對于改善生殖功能，可能不同性別干細胞具有不同的療效。為給基于干細胞的臨床治療提供依據，本研究比較包括了2種性別的3種干細胞類型、共6個細胞株中干細胞分泌因子表達水平的差異。

同類型、不同性別細胞進行比較時：(1)促炎因子IL-8、金屬蛋白酶及其抑制劑、Angiogenin在女性hESC系中的表達水平顯著高于男性hESC；而抑炎因子IL-10、生長因子HGF、BDNF、SCF及LIF則在男性hESC中的表達水平較高；(2)促炎因子IL-6、IL-8、生長因子BDNF及HGF的表達量在女性AMSC系中顯著高于男性AMSC系；VEGF、Angiogenin、LIF和BMP4則在男性AMSC系中的表達水平較高；(3)促炎因子IL-6、TNF-α，生長因子BDNF、HGF及金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1均在女性UMSC系中具有較高表達水平；而促炎因子IL-8，抑炎因子IL-10，生長因子VEGF，金屬蛋白酶MMP-1及BMP4均在男性UMSC系中表達水平較高。

同性別、不同類型細胞進行比較時，實驗結果顯示：(1)在女性細胞中，促炎因子IL-8，生長因子VEGF、HGF，LIF以及Angiogenin在UMSC中相對表達水平顯著高于其他細胞系；促炎因子IL-6及金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1則在AMSC中的相對表達量較高；而促炎因子TNF-α、抑炎因子、金屬蛋白酶MMP-1、BMP4在hESC中表達水平顯著高于成體干細胞；(2)男性細胞系中，促炎因子、金屬蛋白酶的表達水平在UMSCs中顯著高于其他兩種細胞類型；而抑炎因子、BMP4的表達水平在hESCs中較高；金屬蛋白酶抑制劑、Angiogenin的表達水平在成體干細胞中較高；生長因子的表達水平在三種細胞系中存在顯著差異、互有高低。

總之，女性hESCs、男性UMSCs可分泌較多的金屬蛋白酶，具有更強的降解纖維的能力，臨床上可考慮用于促進傷口愈合、抑制或消除疤痕；而女性UMSCs分泌生長因子、血管生成因子、造血因子、抑炎因子的能力要強于hESCs、AMSCs，可能具有更好的改善血供、提高生殖功能的療效。以上推測尚需動物實驗進一步驗證。

本實驗通過比較不同性別、不同類型干細胞中細胞分泌因子的表達水平差異，為研究干細胞治療、特別是POF治療機制提供了基礎，同時也為選擇合適類型的干細胞來實施POF臨床治療提供理論依據。

【參考文獻】

[1]Cherry AB，Daley GQ.Reprogramming cellular identity for regenerative medicine[J].Cell，2012，148：1110-1122.

[2]Liu J，Zhang H，Zhang Y，et al.Homing and restorative effects of bone marrow-derived mesenchymal cells on cisplatin injured ovaries in rats[J].Mol Cells，2014，37：865-872.

[3]Shelling AN.Premature ovarian failure[J].Reproduction，2010，140：633-641.

[4]Bachelot A，Rouxel A，Massin N，et al.Phenotyping and genetic studies of 357 consecutive patients presenting with premature ovarian failure[J].Eur J Endocrinol，2009，161：179-187.

[5]Panay N，Fenton A.Premature ovarian failure：a growing concern[J].Climacteric，2008，11：1-3.

[6]Maclaran K，Panay N. Premature ovarian failure[J]. J Fam Plann Reprod Health Care，2011，37：35-42.

[7]Chen H，Li J，Cui T，et al.Adjuvant gonadotropin-releasing hormone analogues for the prevention of chemotherapy induced premature ovarian failure in premenopausal women[DB].Cochrane Database Syst Rev，2011，(11)：CD008018.

[8]Antoine C，Ameye L，Paesmans M.et al. Systematic review about breast cancer incidence in relation to hormone replacement therapy use[J]. Climacteric，2014，17：116-132.

[9]Donnez J，Dolmans MM.Fertility preservation in women[J].Nat Rev Endocrinol，2013，9：736-749.

[10]Ghadami M，El-Demerdash E，Zhang D，et al.Bone marrow transplantation restores follicular maturation and steroid hormones production in a mouse model for primary ovarian failure[J/OL].PLOS One，2012，7：e32462.

[11]Kilic S，Pinarli F，Ozogul C，et al.Protection from cyclophosphamide-induced ovarian damage with bone marrow-derived mesenchymal stem cells during puberty[J].Gynecol Endocrinol，2014，30：135-140.

[12]Takehara Y，Yabuuchi A，Ezoe K，et al.The restorative of adipose-derived mesenchymal stem cells on damaged ovarian function[J].Lab Invest，2013，93：181-193.

[13]Xiao GY，Liu IH，Cheng CC，et al.Amniotic fluid stem cells prevent follicle atresia and rescue fertility of mice with premature ovarian failure induced by chemotherapy[J/OL].PLOS One，2014，9：e106538.

[14]Santiquet N，Vallieres L，Pothier F，et al.Transplanted bone marrow cells do not provide new oocytes but rescue fertility in female mice following treatment with chemotherapeutic agents[J].Cell Reprogram，2012，14：123-129.

[15]Danieli P，Malpasso G，Ciuffreda MC，et al.Conditioned medium from human amniotic mesenchymal stromal cells limits infarct size and enhances angiogenesis[J].Stem Cells Transl Med，2015，4：448-458.

[16]Gao Z，Zhang Q，Han Y，et al.Mesenchymal stromal cell-conditioned medium prevents radiation-induced small intestine injury in mice[J].Cytotherapy，2012，14：267-273.

[17]姚娜，李樹德，王文林.IL-6，IL-10在實驗性肺部炎癥中的研究進展[J].昆明醫科大學學報，2014，35：161-163.

[18]呂倩，王昌明，蔣明，等.HIF-1α和VEGF在大鼠COPD中的表達及肺血管重構的關系研究[J].中國藥理學通報，2012，28：772-777.

[19]孫燕來，李增軍.肝細胞生長因子及其受體c-Met表達與胃癌肝轉移的相關性[J].實用醫學雜志，2015，31：2635-2637.

[20]Nagase H，Visse R，Murphy G.Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs[J].Cardiovasc Res，2006，69：562-573.

[21]Guo WT，Dong DL.Bone morphogenetic protein-4：a novel therapeutic target for pathological cardiac hyperrophy/heart failure[J].Heart Fail Rev，2014，19：781-788.

[22]Nicola NA，Babon JJ.Leukemia inhibitory factor (LIF)[J].Cytokine Growth Factor Rev，2015，26：533-544.

[23]Sheng J，Xu Z.Three decades of research on angiogenin：a review and perspective[J/OL].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)，2016，48：399-410.

[24]Jiang C，Cai L，Huang B，et al.Normal human embryonic stem cell lines were derived from microsurgical enucleated tripronuclear zygotes[J].J Cell Biochem，2013，114：2016-2023.

[25]Huang B，Jiang C，Chen A，et al.Establishment of human-embryonic-stem-cell line from mosaic trisomy 9 embryo[J].Taiwan J Obestet Gynecol，2015，54：505-511.

[26]Marongiu F，Gramignoli R，Sun Q，et al.Isolation of amniotic mesenchymal stem cells[J].Curr Protoc Stem Cell Bio，2010，Chapter 1：Unit1E.5-1E.5.11.

[27]Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement[J]. Cytotherapy，2006，8：315-317.

[28]Wongtrakoongate P，Jones M，Gokhale PJ，et al. STELLA facilitates differentiation of germ cell and endodermal lineages of human embryonic stem cells[J/OL]. PLoS One，2013，8：e56893.

[29]Gkountela S，Li Z，Vincent JJ，et al. The ontogeny of cKIT+human primordial germ cells proves to be a resource for human germ line reprogramming，imprint erasure and in vitro differentiation[J]. Nat Cell Biol，2013，15：113-122.

[30]Yamazaki H，Jin Y，Tsuchiya A，et al.Adipose-derived stem cell-conditioned medium ameliorates antidepression-related behaviors in the mouse model of Alzheimer’s disease[J].Neurosci Lett，2015，609：53-57.

[編輯：谷炤]

Expressions of secretory factors in different types of stem cells

ZHANG Qin-jing，CHEN Ai-qin，NING Song，GAO Chao，JIANG Chun-yan，CUI Yu-gui，CHEN Juan，QIN Lian-ju*，LIU Jia-yin*

StateKeyLaboratoryofReproductiveMedicine，CenterofClinicalReproductiveMedicine，FirstAffiliatedHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210029

【Abstract】Objective： To compare the expression levels of secretory cytokine in different type of stem cell，and explore their clinical significance.

Key words：Human embryonic stem cell；Human amniotic mesenchymal stem cell；Human umbilical cord mesenchymal stem cell；Secretory cytokine

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.06.009

【收稿日期】2016-01-16；【修回日期】2016-02-05

【基金項目】973項目(2012CB944902)；國家自然科學基金(81370764，81370754)；江蘇省科技廳項目(BL2012009、BM201358)、衛生廳項目(ZX201110)

【作者簡介】張琴靜，女，江蘇昆山人，碩士，婦產科生殖醫學方向.(*通訊作者，Email：ljqin@njmu.edu.cn；jyliu_nj@126.com)