葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（G6PD）c.1311C〉T/IVS?1193T〉C與3′?UTR的多態(tài)性探討

林芬　楊輝　吳教仁　楊立業(yè)

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葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（G6PD）c.1311C〉T/IVS?1193T〉C與3′?UTR的多態(tài)性探討

林芬楊輝吳教仁楊立業(yè)

［摘要］目的對中國人群葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（glucose?6?phosphate dehydrogenas，G6PD）c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性與3′?非翻譯區(qū)（3′?untranslated regions, 3′?UTR)的多態(tài)連鎖相關(guān)性進(jìn)行研究。同時(shí)了解粵東、華北地區(qū)健康人群中該突變基因的攜帶情況。方法應(yīng)用全自動(dòng)生化儀速率法測定G6PD活性，基因測序檢測G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性。根據(jù)G6PD基因UTR區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，測序確證攜帶c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性的G6PD缺乏標(biāo)本是否連鎖有UTR單個(gè)堿基上的變異（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)的變異。結(jié)果華南地區(qū)有39 例G6PD缺乏樣本檢測到攜帶c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變，其3′?UTR和5′?UTR端沒有檢測到SNP位點(diǎn)的變異。同時(shí)，我們研究發(fā)現(xiàn)G6PD酶活性正常的人群中也攜帶有c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C變異，其在潮州、梅州各100名正常人群中發(fā)生率分別為15.7%和12%，在鄭州和石家莊各50名正常人群中發(fā)生率分別為2%和8%。該變異在中國南方與北方的正常人群之間相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。粵東地區(qū)G6PD缺乏者中攜帶c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變的樣本并未發(fā)現(xiàn)連鎖有UTR SNP位點(diǎn)突變。結(jié)論關(guān)于G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變與G6PD缺乏之間的相關(guān)性值得進(jìn)一步探討。

［關(guān)鍵詞］G6PD缺乏癥；基因突變；UTR

作者單位：南方醫(yī)科大學(xué)附屬潮州市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東，潮州521021

葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（glucose?6?phosphate de?hydrogenas，G6PD）缺乏癥的發(fā)病原因主要是G6PD基因突變，導(dǎo)致G6PD酶活性降低，紅細(xì)胞受氧化損傷而遭到破壞，引起溶血性貧血。臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)性，其溶血的嚴(yán)重程度與剩余酶的功能呈負(fù)相關(guān)［1-3］。我們在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，粵東地區(qū)G6PD缺乏的病例中常發(fā)現(xiàn)2種靜止突變，外顯子c.1311C〉T和IVS?11 93T〉C顯示出強(qiáng)連鎖，而這種病例未發(fā)現(xiàn)其它外顯子的突變。不久前，國外研究者指出c.1311C〉T和IVS?11 93T〉C2種靜止突變與其下游非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一個(gè)單個(gè)堿基上的變異（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)連鎖，這個(gè)位點(diǎn)的基因突變導(dǎo)致了基因表達(dá)（mRNA）降低［4］，從而引起G6PD缺乏。中國人群中攜帶c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C突變的G6PD缺乏者是否也連鎖有SNP位點(diǎn)的變異？目前無文獻(xiàn)報(bào)告。另外，也有少數(shù)研究報(bào)道在G6PD正常的人群中也存在c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性［5-7］，但是關(guān)于其在中國正常人群中的具體發(fā)生頻率鮮見報(bào)道。針對以上2個(gè)方面，我們作了如下研究。

1　對象與方法

1.1研究對象

2014年6月至12月從廣東省梅縣婦幼保健院、平遠(yuǎn)縣人民醫(yī)院和興寧縣人民醫(yī)院、揭陽普寧婦幼保健院以及潮州市中心醫(yī)院體檢中心收集的G6PD缺乏全血樣本進(jìn)行基因檢測，并對其中39例攜帶有c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性的樣本進(jìn)行非翻譯區(qū)（untranslated regions, UTR) SNP位點(diǎn)檢測。同時(shí)，我們收集南方潮州和梅縣、北方鄭州和石家莊（樣本由上海凱普生物有限公司提供）G6PD正常人群全血樣本進(jìn)行G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性檢測。

1.2方法

1.2.1G6PD活性測定

參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》介紹方法［8］，應(yīng)用全自動(dòng)生化儀速率法進(jìn)行G6PD活性缺乏的篩查，酶活性低于5.3 U/L的樣本診斷為G6PD缺乏。

1.2.2DNA提取

采用深圳亞能生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.3c.1311C〉T以及IVS?11 93T〉C分型檢測

膜反向斑點(diǎn)雜交法采用深圳亞能生物技術(shù)有限公司試劑盒，設(shè)計(jì)10對引物用于2號～13號外顯子（包括外顯子和外顯子?內(nèi)含子接合區(qū)）的擴(kuò)增及基因測序。其中11號～12號外顯子引物序列為：上游引物5′?GCAGTGGCATCAGCAAGA；下游引物3′?AGTGACGGGTGGAGGAGA。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3 min；擴(kuò)增94℃30 s，55℃30 s，72℃35 s，共35個(gè)循環(huán)。

1.2.45′?UTR和3′?UTR區(qū)域的擴(kuò)增和測序

針對G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變樣本，設(shè)計(jì)4對引物用于5′?UTR和3′?UTR區(qū)域的擴(kuò)增和測序，分別是3′?UTR1引物：1F （GCAGACGAGCTGATGAAGA）和1R（GGAGT?GGGACAAGGAA GTG）（738 bp）；3′?UTR2引物：2F（TCACTCCAGCCCAACAGA）2R（GGTC CT?CAGGGAAGCAAA）（397 bp）；5′?UTR1引物：1F （AGGCGGGGAAACCGGACAGT）和1R（GTC CCCTTCGCTCTCGGGGT）（574 bp）；5′?UTR2引物：2F（ACCCCGAGAGCGAAG GGG AC）和2R （CGGCTGGGCATTGGGGAGTG）（330 bp）。

1.2.5測序結(jié)果分析

將測序序列用BLAST進(jìn)行比對，同時(shí)對測序圖譜應(yīng)用Chromas軟件直接分析，從而鑒定基因突變類型。DNA序列比對數(shù)據(jù)庫：NCBI BLAST （httP：//www.nebi.nlm.nih.gov/BLAST/）。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性在中國南方與北方正常人群之間的比較采用SPSS 16.0專業(yè)版軟件做χ2檢驗(yàn)分析，以P〈0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C的UTR區(qū)檢測

我們對粵東地區(qū)人群進(jìn)行G6PD缺乏癥的流行病學(xué)調(diào)查研究［9］，此次選取了廣東省潮州、揭陽普寧、梅縣、平遠(yuǎn)、興寧所檢測出的39例攜帶c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性的G6PD缺乏樣本，針對3′?UTR和5′?UTR的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，這些樣本并未檢測到SNP位點(diǎn)的變異，c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C和3′?UTR測序圖見圖1。

2.2 G6PD正常人群的c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性

我們分別對南方（潮州和梅州）和北方（鄭州和石家莊）G6PD正常人群的c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性進(jìn)行調(diào)查，在潮州100名健康人群中檢出15例（男6例，女9例），發(fā)生率為15%；在梅州100名健康人群中檢出12例（男5例，女7例），發(fā)生率為12%。在鄭州50名健康人群中僅發(fā)現(xiàn)1例，為男性，發(fā)生率是2%；而在石家莊50名健康人群中發(fā)現(xiàn)4例，均為女性，發(fā)生率是8%。經(jīng)SPSS16.0專業(yè)版軟件χ2檢驗(yàn)分析，南方正常人群c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C發(fā)生率和北方正常人群相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.025）。人類基因計(jì)劃組中有G6PDc.1311C〉T在不同國家正常人群中的分布頻率（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），其中歐洲、美國、非洲國家的分布頻率分別為7.16%、12.39%和21.71%，但沒有c.1311C〉T合并IVS?11 93T〉C基因多態(tài)性的數(shù)據(jù)。中國部分地區(qū)正常人群中G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C的發(fā)生率見表1。

表1　中國部分地區(qū)正常人群G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C的發(fā)生率Table 1 The frequency of G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C among healthy people in some parts of China

3　討論

目前，世界范圍內(nèi)已報(bào)道190多種G6PD基因突變類型，中國人群中報(bào)道發(fā)現(xiàn)30多種［5］，幾乎所有的突變都位于G6PD基因的編碼區(qū)，且絕大部分為單個(gè)堿基置換的錯(cuò)義突變，但是仍有一些病例無法從經(jīng)典的分子病理學(xué)知識(shí)中得到解答。

1989年，有研究者［10］發(fā)現(xiàn)G6PD c.1311C〉T突變是一個(gè)同義突變，不會(huì)造成G6PD氨基酸的替換，常與其它突變共存，在歐洲人中G6PD地中海型c.563 C〉T突變伴發(fā)c.1311C〉T，日本人中G6PD c.1264G〉A(chǔ)伴發(fā)c.1311C〉T。于國龍等［10］對廣東省G6PD缺乏癥的研究中發(fā)現(xiàn)，廣東的G6PD缺乏癥患者c.1311C〉T突變常伴發(fā)IVS?11 93T〉C突變，推測由于c.1311C〉T和IVS?11 93T〉C 2個(gè)位點(diǎn)相距較近，可能導(dǎo)致核內(nèi)不均一RNA（heteroge?neous nuclear RNA，hnRNA）在形成成熟的mRNA過程中，核內(nèi)的小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）與11內(nèi)含子的結(jié)合引起構(gòu)象改變致使剪切位點(diǎn)改變，從而引起G6PD酶活性降低。我們在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，粵東地區(qū)的G6PD缺乏病例中c.1311C〉T和IVS?11 93T〉C這2種靜止突變也常同時(shí)出現(xiàn)，而這種病例并沒有發(fā)現(xiàn)其它外顯子的突變。

國外有研究者對馬來西亞原住民人群Negrito 的G6PD缺乏者的分子機(jī)制進(jìn)行研究，在這些病例中發(fā)現(xiàn)了G6PD基因3′?UTR 3個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性（SNPs），包括rs112950723、rs111485003和rs1050757，單倍型c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C與rs1050757G強(qiáng)相關(guān)，推論rs1050757通過影響mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄或者miRNA的調(diào)節(jié)過程，導(dǎo)致G6PD mRNA降解發(fā)生變化，從而致使G6PD缺乏［4］。我們推測中國人群中攜帶c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C突變的G6PD缺乏者也可能連鎖有SNP位點(diǎn)的變異，因此，我們將在廣東、廣西收集的39例攜帶有c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變的G6PD缺乏標(biāo)本作為研究對象，針對3′?UTR和5′?UTR 的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序。通過檢測，39例攜帶c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變基因的G6PD缺乏者沒有檢測到UTR SNP位點(diǎn)的變異。c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變基因3′端rs1050757位點(diǎn)A到G轉(zhuǎn)變在馬來西亞原住民人群Negrito中導(dǎo)致酶缺乏有可能局限于本地，與Negrito系東南亞古老居民，長期相對封閉的原始生活環(huán)境有關(guān)。

c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C基因突變在G6PD正常和缺乏的樣本中均存在，在中國人群G6PD缺乏癥患者中c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變的發(fā)生率約為5.1%～11.1%，在G6PD正常人群的發(fā)生率約為9.4%～18.4%［6］。王穎等［7］對海南黎族人群的研究中發(fā)現(xiàn)，在海南黎族男性G6PD缺乏和正常組中c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變發(fā)生頻率分別為6.0%和24%。何永蜀等［5］研究顯示云南彝族G6PD缺乏癥患者和健康對照組c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變頻率分別為18.3%和29.9%。我們此次在潮州和梅州G6PD正常人群中檢測出的c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變的發(fā)生率分別為15%和12%，與以往文獻(xiàn)的研究基本一致，由此可見c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變在粵東地區(qū)正常人群中普遍存在。多年來，我國學(xué)者對于G6PD缺乏癥的研究大多來自南方各省，北方正常人群中是否也存在c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變沒有文獻(xiàn)報(bào)道。我們收集了石家莊、鄭州各50名健康人群樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)4例c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C突變基因，由此可見該突變點(diǎn)在北方正常人群中也存在，只是發(fā)生率明顯降低。

c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C為一古老突變，它可能在長期的群體傳遞過程中與其它G6PD突變基因發(fā)生交叉，我們認(rèn)為不完全排除該突變點(diǎn)多態(tài)性變異與酶缺陷有關(guān)的可能，粵東地區(qū)c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C基因突變的G6PD缺乏樣本是否還受其他影響酶活性表達(dá)的基因調(diào)控？我們將對此進(jìn)一步研究和分析。

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論著

The investigation of polymorphism on G6PD c.1311C＞T/IVS?1193T＞C and 3′?UTR（untranslated re?gions）

LIN Fen，YANG Hui，WU Jiaoren，YANG Liye
（Central Laboratory，Affiliated Chaozhou Central Hospital，southem Medical University，Chaozhou，Guang?dong，China，521021）

［ABSTRACT］Objective To explore the linkage relationship of G6PD c.1311C〉T/IVS?11 93T〉Cpoly?morphism with the 3′?UTR polymorphism in the Chinese population, and investigate the frequency of c.1311C〉T/IVS?11 93T〉C polymorphism in healthy individuals in the eastern Guangdong province and northern China. Methods The activity of G6PD enzyme was analyzed through Auto?bioanalyzer, and the G6PD c.1311C〉T/ IVS?11 93T〉C gene polymorphism was detected by DNA sequencing. Specific primers were designed for ampli?fication of the 5′and 3′?UTR of the G6PD gene. Results 39 cases of G6PD deficiency were detected with c.1311C〉T/IVS?1193T〉C polymorphism in the northern China. However, no variation in the 3′and 5′?UTR re?gions was found among those samples. At the same time, c.1311C〉T/IVS?1193T〉C polymorphism was also de?tected in individuals with normal G6PD activity. The frequencies of c.1311C〉T/IVS?1193T〉C polymorphism in healthy individuals of Chaozhou and Meizhou area were 15.7% and 12%, respectively. Furthermore, the frequen?cy of the polymorphism in healthy individuals of Zhengzhou and Shijiazhuang were 2% and 8% respectively. The frequencies of the polymorphism in healthy individuals were statistically significant in the North and thebook=2,ebook=13South. Conclusion The UTR SNP variations were not found among G6PD deficiency samples detected with c.1311C〉T/IVS?1193T〉C gene polymorphism in the eastern Guangdong province. The relationship of G6PD c.1311C〉T/IVS?1193T〉C polymorphism with G6PD deficiency requires further study.

［KEY WORDS］G6PD deficiency；Gene mutation；Untranslated regions

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（A2014902,B2013444）；廣東省臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目（檢驗(yàn)科）（2012）；潮州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014S08）

通訊作者：楊立業(yè)，E?mail: yangleeyee@sina.com