應用微陣列比較基因組雜交技術檢測乳腺癌患者共有拷貝數變異的初步研究

周慧　何丹　楊學習　李粉霞

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應用微陣列比較基因組雜交技術檢測乳腺癌患者共有拷貝數變異的初步研究

周慧1何丹2楊學習1李粉霞2

［摘要］目的探討乳腺癌患者基因組中共有的拷貝數變異與乳腺癌發生發展的關系，為乳腺癌的預防、治療和預后提供基本依據。方法使用微陣列比較基因組雜交技術檢測樣本基因組DNA的拷貝數變異。將得到的拷貝數變異在人類基因組變異數據庫和孟德爾遺傳數據庫進行變異分析，尋找樣本共有的拷貝數變異并分析其與乳腺癌的關系。結果發現1q21、8p11、8p12、8q11、14q32、14q32.33（其中包含2個片段），20q13和22q11共9個共有拷貝數變異，其中4個拷貝數變異通過人類基因組變異數據庫證實為正常多態性拷貝數變異。有5個拷貝數變異在人類基因組變異數據庫中不存在相似片段并且在孟德爾遺傳數據庫中有致病基因，包括4個擴增片段和1個缺失片段。結論1q21.1q42.2、8q21.12q23.3和20q13.2q13.31 3個片段的擴增及8p12p11.23的缺失與乳腺癌的發生和發展有一定聯系，但8q11.22q11.23的擴增與乳腺癌的發生、發展的相關性尚有待于進一步驗證。

［關鍵詞］乳腺癌；拷貝數變異；微陣列比較基因組雜交

作者單位：1.南方醫科大學生物技術學院，廣東，廣州510515
2.廣州市達瑞生物技術股份有限公司，廣東，廣州510665

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在全球呈明顯的上升趨勢，嚴重危害著廣大婦女的身體健康。盡管我國女性乳腺癌總體發病率在世界范圍處于中低水平［1］，但隨著工業化的發展、人們生活方式的變化，乳腺癌總發病率在不斷提高，特別是在較發達城市如北京、上海、天津、廣州等，乳腺癌已成為婦女發病率最高的惡性腫瘤［2］。據世界衛生組織國際癌癥研究中心（Inter?national Agency for Research on Cancer，IARC）統計，2008年中國女性乳腺癌標化發病率為21.6/ 100 000，在全球184個有統計資料的國家中位列第99位，標化死亡率為5.7/100 000，位列第145位，均顯著低于世界平均水平［2］。但是由于人口基數大，卻占世界新診斷乳腺癌的12.2%，死亡例數占世界乳腺癌死亡人數的9.6%［3］。如何進行早期預防并降低乳腺癌發病率已經成為乳腺腫瘤研究中的重大現實課題。

乳腺癌是一種遺傳異質性腫瘤，臨床上根據免疫組化檢測ER、PR、HER2和Ki67的結果，將乳腺癌劃分為Luminal A型、Luminal B型、HER?2陽性和三陰性乳腺癌。各亞型與乳腺癌的疾病轉歸、患者預后和治療反應密切相關。不同亞型的乳腺癌在總生存期和無復發生存期上存在顯著差異，其中Luminal A型的預后較好，而三陰性乳腺癌的預后交差。但目前臨床上免疫組化檢測沒有統一的檢測和評估規范，很難確切的進行分子分型。早在2000年，Perou等［4］就嘗試采用基因芯片的方式將乳腺癌分成不同的亞型。根據基因表達譜，可以把乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、HER?2陽性和基底樣乳腺癌。其中大部分基底樣乳腺癌是三陰性乳腺癌。基于芯片表達譜的分子分型更易進行標準化檢測和評估。除此以外，芯片還可以檢測到其他癌基因或者抑癌基因的拷貝數變異（copy number variation，CNVs）。這些在人類基因組中廣泛存在的缺失、插入、重復和復雜位點的變異，長度為1 kb以上，其突變率遠高于單核苷酸多態（single nucleotide polymorphism，SNP）。這些特異的變異可以成為潛在的治療靶標。例如，AKT1和FGFR1在乳腺癌變異和擴增的頻率分別為4%和10%，對特定的抑制劑靶向治療敏感［5-6］。對這些靶向變異位點的掃描可以幫助我們找到靶向治療的特定受益人群。微陣列比較基因組雜交（array?based comparative genomic hybrid? ization，aCGH）用DNA探針取代了細胞中期染色體，可以檢測基因組DNA在相應的序列或基因上的拷貝數變異［7］，一次檢測相當于對基因組同時進行了成千上萬個獨立的熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）。然而，aCGH無法檢測不導致CNVs的染色體畸變，如點突變、平衡易位和倒位等［7］。Pollack［8］用aCGH的方法在乳腺癌中不僅證實了比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）探測到的17q和20q上的擴增區域，而且新發現了1q、8q、11q和15q擴增區域，3p、6q、9p、10q和Xq缺失區域［9］。這些片段上含有很多與乳腺癌相關的基因。

本實驗擬用aCGH檢測中國人群乳腺癌患者的全基因組DNA，尋找與分析乳腺癌共有的CNVs并探討這些CNVs與中國人群乳腺癌發生發展的關系，期望為乳腺癌的預防、治療和預后提供基本檢測方法和技術依據。

1　材料和方法

1.1病例資料

樣本為南方醫科大學南方醫院乳腺中心收治的4名漢族女性患者，年齡分別為40歲、57歲、56歲、59歲，平均年齡為53歲。樣本均為左側乳腺浸潤性導管癌，根據乳腺癌淋巴結轉移（tumor node metastasis，TNM）分期，原發腫瘤體積不大于5 cm，除3號樣本無區域淋巴結轉移之外，其他均有一定程度區域淋巴結侵犯。所有樣本均無遠處轉移。

1.2芯片檢測共有CNVs

安捷倫aCGH試劑盒購自美國Agilent公司，1×TE（pH 8.0）、Molecular grade來自美國Pro?mega公司，SureScan Microarray Scanner、Hybridiza?tion Oven、CytoGenomix和CytoGenomics Edition分析軟件來自美國Agilent公司。

使用QIAamp DNA Mini Kit提取組織中的基因組DNA，用Thermo NanoDrop2000C紫外/可見分光光度計測量提取DNA的濃度和純度。要求2.0〉260/280〉1.8，260/230〉1.0。分別取0.5 μg樣本DNA量和reference量到反應管中，加水至13 μ L。加入隨機引物2.5 μ L，然后進行片段化和單鏈化。隨后冰上配制Cy3和Cy5 2種染料的標記混合液，每管加入9.5 μ L的標記控制混合液后孵育標記。用純化柱子對標記后的DNA進行純化，然后使用NanoDrop 2000 UV?VIS分光光度計來檢測并計算產量與比活度。制備Hybridization Mas?ter Mix，將標記的被測和對照樣品混勻加29 μ L到每管混合物后孵育。使墊圈滑片和雜交室底部磨合和對齊，將雜交樣本混合液40 μ L放在墊圈的中央，放上有活性的芯片，后封閉雜交室。將雜交室放入雜交箱，配平，20 rpm，67℃，24 h。從雜交箱拿出雜交盒，取出芯片進行洗滌。

1.3芯片掃描和數據分析

芯片用SureScan Microarray Scanner進行掃描，用Agilent CytoGenomics Edition進行分析得到CNVs。得到所有樣本全部CNVs后，篩選4例樣本共有CNVs，通過查詢DGV（database of genomic variants）數據庫、線上《人類盂德爾遺傳》（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數據庫和查找相關文獻對實驗所得片段進行研究。

2　結果

2.1乳腺癌共有CNVs

4個乳腺癌樣本共發現CNVs總數為295個，其中2號樣本有82個，1號、3號和4號樣本均為71個（圖1）。發現9個共有CNVs，包括2個純和擴增（8p11.23p11.22和22q11.22），6個雜合擴增（1q21.1q42.2，8q11.22q11.23，8q21.12q23.3，14q32.33中的2個片段和20q13.2q13.31）和1個雜合缺失（8p12p11.23），片段變異范圍為117 kb～84 684 kb，包含基因個數為1個～152個基因。

2.2數據庫查找結果

通過查詢DGV數據庫、OMIM數據庫和相關文獻檢索對實驗所得片段進行分析。在發現的9個共有CNVs中，4個共有CNVs為正常多態性CNVs，為無關CNVs；5個共有CNVs是致病性CNV，包括1q21.1q42.2、8q11.22q11.23、8q21.12q23.3、20q13.2q13.31這4個片段的擴增和8p12p11.23的缺失（表1）。

3　討論

隨著乳腺癌發病率的持續增長，人們對乳腺癌發生發展機制的研究愈發迫切。在眾多發病因素當中，基因拷貝數的變異是重要致病因素之一，通過對基因拷貝數的檢測可了解基因狀態以及研究一些未知的機制。本實驗用aCGH的方法一次檢測整個基因組基因的拷貝數變異，得到整個基因組所有的拷貝數變異片段后，尋找4個樣本共有的CNVs，通過數據庫查詢和利用收集的資料對這些片段進行分析。

實驗結果發現4例樣本的共有CNVs 9個，其中：8p11.23p11.22、14q32.33中的2個片段和22q11.22在DGV數據庫中存在相似片段，是正常多態性CNVs，可判斷為無關CNVs。在DGV數據庫中沒有相似片段的CNVs有1q21.1q42.2、8q11.22q11.23、8q21.12q23.3、20q13.2q13.31這4個片段的擴增和8p12p11.23的缺失，共5個CNVs，并且所有這些片段在OMIM數據庫中都存在致病基因。

片段1q21.1q42.2里共包含的基因有572個，其中包括了3個1qETS（E?twenty six）家族。ETS是轉錄因子家族中的最大的家族之一，是后生動物所特有的。ETS家族有很多功能，包括細胞分化的調控、細胞周期的調控、細胞遷移、細胞增殖、細胞凋亡、血管生成等。許多ETS都被證實與癌癥有關，基因拷貝數增加是一種致癌基因激活的替代機制。經研究表明，在乳腺癌當中，1q擴增是最常見的拷貝數變異［10］。Mesquita等［10］通過染色體CGH評估141乳腺癌全基因組拷貝數變異，顯示1q21和1q32是2個基因拷貝數增加最頻繁的染色體帶。他們通過FISH證實了1q擴增，展示了基因拷貝數增加的ETS基因：ETV3（位于1q21q23），ELF3和ELK4（兩者都位于1q32）。用實時定量PCR評估3個1qETS基因表達水平以及其靶基因MYC和CRISP3，展示乳腺癌1q21和1q32的基因拷貝數擴增與ETS轉錄因子ETV3和ELF3在這些位點過表達有關。3個ETS基因中，ELF3與乳腺癌發生相關，可能是導致1q拷貝數增加的效應因子［10］。利用包括CGH的傳統細胞學技術，可以識別乳腺癌細胞系和腫瘤的拷貝數變異常發生的區域。這些CNVs當中，包含已知的或候選的癌基因、一些腫瘤抑制基因以及相關基因，如1q、8q22的擴增和8p的缺失［8］。Yang等［11］研究也表明在乳腺癌中發現8q24、20q13、11q12和8p12?p11基因區域擴增。絕大多數的乳腺癌（80%）1q、8q單獨擴增或兩者兼而有之，也可能出現3種變化（+ 1q，+8q或?13q），占腫瘤的91%［12］。本實驗所得到的共有CNV中，8p12p11.23的缺失和8q21.12q23.3的擴增與以上研究報道的結果一致，因此我們推斷這2個片段的拷貝數變異與乳腺癌的發生發展有關。

表1　乳腺癌樣本共有CNVsTable 1 The common CNVs in the breast cancer samples

在目前報道的拷貝數變異與乳腺癌相關關系的研究中，較少提及8q11.22q11.23片段。但我們查找OMIM數據庫發現這個片段內有一個致病基因存在：視網膜母細胞瘤基因1誘導卷曲蛋白（RB1?inducible coiled?coil 1, RB1CC1）基因。RB1CC1基因作用在細胞周期進程，和TSC1?TSC2形成腫瘤抑制復合體。RB1CC1可能是RB1表達的上游調節器，在乳腺癌中是一個抑癌基因，它的純合失活可能參與乳腺癌腫瘤發生［13］。Chano等［13］研究發現，20%的原發性乳腺癌中檢測到RB1CC1基因存在突變。在有RB1CC1突變的癌癥患者中，野生型RB1CC1和RB1缺失或少于正常，在沒有發生該類突變的癌癥患者中卻比較富余［13］。因此我們推測實驗樣本中RB1CC1基因未發生突變，野生型RB1CC1比正常多。所以片段8q11.22q11.23的擴增與乳腺癌發生發展也許有一定關系，具體關系的闡明有待進一步研究。

實驗得到的20q13.2q13.31片段中包含18個基因，其中包含了鋅指蛋白217（zinc finger protein 217，ZNF217）基因。ZNF217編碼選擇性剪接Kruppel樣DNA轉錄因子、DNA結合域組成成分和脯氨酸轉錄激活結構域，被普遍認為是參與乳腺癌腫瘤發生的癌基因。鋅指蛋白是一類具有手指狀結構域的轉錄因子，由于其自身的結構特點，可以選擇性的結合特異的靶結構，使鋅指蛋白在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達，在細胞分化、胚胎發育等生命過程中發揮重要作用。當ZNF217過表達時能使人乳腺表皮細胞無限增殖。

20q13.2區域的擴增是乳腺癌的一個早期事件，與侵略性的腫瘤行為、永生化和基因組不穩定性有關［14］。用CGH的方法檢測到的20號染色體長臂的擴增，共有出現在浸潤性導管癌（invasive ductal carcinoma，IDC）和淋巴結轉移中［15］。Wer?ner等［14］人的研究首次描述了一個擴增的染色體區域20q13，這個片段里包含公認的致癌基因出現在管內增生（intraduct hyperplasia，IH）的進程中。在同樣本中非典型導管增生（atypical duct hyper?plasia，ADH）、原位管癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）和浸潤性導管癌（invasive ductal carcinoma，IDC）中也出現20q13擴增，暗示IH和IDC的相關聯系［14］。20q13.2區域的擴增可能會刺激正常上皮以加速細胞增殖和導管增生，加上基因變化，包括20 q13.2從低擴增向高擴增的轉換，從而促進腫瘤形成，即20q13擴增促進從腫瘤初期（IH）到后階段（DCIS，IDC）的致癌作用［14］。本實驗的樣本全取自左側乳腺浸潤性導管癌患者的癌組織，掃描后所得結果顯示20q13擴增出現頻率為100%。

通過芯片掃描結果、數據庫查詢和相關文獻檢索，1q21.1q42.2、8q21.12q23.3、20q13.2q13.31這3個片段的擴增以及8p12p11.23的缺失與乳腺癌的發生和發展可能有一定聯系，8q11.22q11.23的擴增與乳腺癌發生發展的關系尚有待一進步驗證。由于本研究樣品較少，后續需要加大樣本量對結果進行驗證。

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論著

Preliminary study of common copy number variations of breast cancer patients detected by array?based comparative genomic hybridization technology

ZHOU Hui1，HE Dan2，YANG Xuexi1，LI Fenxia2
（1. School of Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515；
2. Guangzhou Darui Biotechnology Co. LTD，Guangzhou，Guangdong，China，510665）

［ABSTRACT］Objective To explore associations between the common copy number variations (CNVs) in breast cancer patients and the occurrence and development of breast cancer, which may provide the foundation to study the prevention, treatment and prognosis of breast cancer. Methods CNVs of genomic DNA were obtained by array?based comparative genomic hybridization techniques. Then the CNVs were analyzed in terms of the Database of Genomic Variants and Online Mendelian Inheritance in Man, revealing a relationship between common CNVs and breast cancer. Results In 4 breast cancer samples, 9 common copy number variations 1q21, 8p11, 8p12, 8q11, 14q32, 14q32.33(including 2 CNVs), 20q13 and 22q11 were selected out. And 4 of them were confirmed as normal polymorphism copy number variations. While the remaining 5 CNVs were, including 4 amplification and 1 loss, could not be identified through the Database of Genomic Variants and Online Mendelian Inheritance in Man. Conclusion Amplified 1q21.1q42.2, 8q21.12q23.3, 20q13.2q13.31 and loss of 8p12p11.23 may be associated with the occurrence and development of breast cancer. The connections between amplifications of 8q11.22 q11.23 and breast cancerstill needs furtherverification.

［KEY WORDS］Breast cancer；Copy numbervariation；Array?based comparative genomichybridization

基金項目：國家自然科學基金（81302327）；廣州市科技計劃攻關項目（2060404）

通訊作者：李粉霞，E?mail：lifenxia123@gmail.com