高效hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白的表達(dá)及其穿膜功能的研究

王曉勛杞少華李瑞明2梁清樂(lè)

?

高效hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白的表達(dá)及其穿膜功能的研究

王曉勛1杞少華1李瑞明2梁清樂(lè)1

［摘要］目的探討hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白的表達(dá)及其穿膜功能。方法首先，人工設(shè)計(jì)合成蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域序列（protein transduction domain，PTD），以人胚肝組織的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得人銅鋅超氧化物歧化酶全長(zhǎng)cDNA序列。其次，將此序列及人工合成PTD序列定向插入pET16b載體；測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建成功的重組載體導(dǎo)入E. coli BL21菌株，異丙基?β?d?硫代半乳糖苷（isopropyl?β?d ?thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化，洗脫液經(jīng)SDS?PAGE檢測(cè)。最后，將純化產(chǎn)物與食管癌細(xì)胞（EC9706）共孵育，用激光共聚焦和流式細(xì)胞儀的方法檢測(cè)蛋白穿膜能力及活性。結(jié)果測(cè)序結(jié)果與人銅鋅超氧化物歧化酶全長(zhǎng)cDNA序列相符；SDS?PAGE結(jié)果出現(xiàn)18.6 kd和20 kd的目的條帶；激光共聚焦和流式細(xì)胞儀的方法顯示蛋白可穿膜且保持活性。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了PET16b/hCu，Zn ?SOD?PTD原核表達(dá)質(zhì)粒，可在大腸桿菌中穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白，融合蛋白具有穿膜且保持活性。

［關(guān)鍵詞］蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域；人銅鋅超氧化物歧化酶；生物膜；原核表達(dá)載體；內(nèi)化作用

作者單位：1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗(yàn)部，湖北十堰442000
2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究所，湖北十堰442000

人銅鋅超氧化物歧化酶（human Cu/Zn?super?oxide dismutase，hCu，Zn?SOD）是人體內(nèi)清除超氧陰離子自由基的專一高效的酶類，能保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧應(yīng)激反應(yīng)的損傷，具有抗衰老、抗輻射、抗癌和抗炎作用。但是人銅鋅超氧化物歧化酶屬于大分子蛋白，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜和皮膚上沒(méi)有專一受體［1］，所以外源性的人銅鋅超氧化物歧化酶難以進(jìn)入細(xì)胞和組織內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用，限制了其在疾病預(yù)防、治療或美容等多領(lǐng)域的應(yīng)用。

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為外源性人銅鋅超氧化物歧化酶的臨床應(yīng)用開拓了廣泛的前景。此現(xiàn)象最初在對(duì)人類免疫缺陷型病毒的HIV?1反式激活蛋白研究中發(fā)現(xiàn)。1988，Green等［2-3］首次報(bào)道了HIV?1的反式激活蛋白TAT具有內(nèi)化功能。從HIV?1病毒體內(nèi)分離的TAT調(diào)控基因編碼32個(gè)～57個(gè)氨基酸的中心區(qū)域和堿性氨基酸富集區(qū)可以有效地穿越細(xì)胞膜。隨后發(fā)現(xiàn)，TAT蛋白真正具有轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的是其序列中的47～57這11個(gè)氨基酸殘基，稱之為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（protein transduction do?min，PTD）［4］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域不僅存在于HIV?1反式激活蛋白中，如單純皰疹病毒和果蠅VP22轉(zhuǎn)錄因子的同源框轉(zhuǎn)錄蛋白觸足的研究中也發(fā)現(xiàn)有富含精氨酸殘基PTD序列［5］。近年來(lái)隨著生物信息技術(shù)和PTD跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究的發(fā)展，許多國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)人工設(shè)計(jì)比天然PTD具有更高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)活性肽進(jìn)行了探索。由國(guó)外科學(xué)家設(shè)計(jì)的9個(gè)精氨酸或9個(gè)賴氨酸殘基構(gòu)成的基序，顯示出了比TAT更強(qiáng)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)活性［6］；研究人員通過(guò)優(yōu)化空間結(jié)構(gòu)和表面的電子分布也設(shè)計(jì)出了多種具有更強(qiáng)跨膜活性的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域［7］。隨著對(duì)PTD分子作用機(jī)制深入，人們利用此項(xiàng)技術(shù)合成更多具有穿膜活性的融合蛋白分子來(lái)解決大分子蛋白不能跨越生物膜來(lái)發(fā)揮其生物活性這一難題［5，7-10］。本文依據(jù)上述文獻(xiàn)中的原理、參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)出高效蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域用于本實(shí)驗(yàn)。

本研究旨在構(gòu)建具有高效轉(zhuǎn)導(dǎo)域的PET16b/ hCu，Zn?SOD?PTD原核表達(dá)載體，在大腸桿菌表達(dá)、制備和純化蛋白hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白，并檢測(cè)目的蛋白穿透哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力，為外源性的人銅鋅超氧化物歧化酶的臨床應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞和動(dòng)物

PGEM?T載體購(gòu)自美國(guó)Promaga公司；pET?16b、E. coli BL21（DE3）購(gòu)于德國(guó)Novagen公司；食管癌細(xì)胞株（EC9706）、JM109菌株皆由太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所保存。

1.1.2主要試劑

Trazol試劑購(gòu)自美國(guó)Gibicol公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自芬蘭Finnzymes公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)New England公司；T4連接酶、高保真Taq酶、普通Taq酶購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司；質(zhì)粒提取試劑盒與膠回收純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promaga公司；熒光探針2′，7′?二氯熒光黃雙乙酸鹽（2′，7′?di?chlorofluorescin diacetate，DCFH?DA）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；異丙基?β?d?硫代半乳糖苷（isopropyl?β?d?thiogalactoside，IPTG）購(gòu)自荷蘭Duchefa公司；兔抗組氨酸抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；層析柱購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；其余試劑均進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.1.3 PCR引物

從GenBank中查取序列號(hào)為X02317［1］的人銅鋅SOD全長(zhǎng)編碼序列（coding sequence，CDS）設(shè)計(jì)擴(kuò)增人銅鋅SOD全長(zhǎng)CDS引物，引物1：5′?CCGCTC GAGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG?3′（含XhoI酶切位點(diǎn)），引物2：5′?CGGGATCCTATTATTGGG CGATCCCAATTAC?3′（含BamHI酶切位點(diǎn)）；PTD的寡核苷酸序列為：5′?TATGACCTATGCGCGT GCGGCAGCGCGTCAGGCTCGTGCCC?3′，5′?TC GAGGGGCACGAGCCTGACGCGCTGCCGCACG CGCATAGGTCA?3′（含Ndel、XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)）。以上序列均委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1PTD序列的設(shè)計(jì)

根據(jù)PTD多肽跨膜結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，并參考文獻(xiàn)［7-9］，利用軟件設(shè)計(jì)具有高效跨膜活性的蛋白結(jié)構(gòu)域：YARAAARQARAL，并設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并寡核苷酸序列：5′?TATGACCTATGCGCGTGCGGCAGCGC GTCAGGCTCGTGCCC?3′，5′?TCGAGGGGCAC GAGCCTGACGCGCTGCCGCACGCGCATAGGT CA?3′。

1.2.2人銅鋅SOD全長(zhǎng)cDNA序列的獲得及鑒定

提取人胚胎肝臟組織的總RNA，以其為模板用于人銅鋅SOD全長(zhǎng)CDS的逆向轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，將獲得的人銅鋅SOD全長(zhǎng)CDS片段，加腺嘌呤（A）處理純化后插PGEM?T載體，以獲得PGEM?hCu/ Zn?SOD克隆載體。

1.2.3 PET/hCu，Zn?SOD原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶XhoI、BamHI雙酶切上面獲得的pGEM?hCu/Zn?SOD載體，獲得兩端帶有粘性末端的雙鏈全長(zhǎng)hCu/Zn?SOD CDS片段，同時(shí)用同樣的酶對(duì)pET?16b空載體進(jìn)行雙酶切。膠回收兩端帶有粘性末端的線性載體及hCu/Zn?SOD全長(zhǎng)CDS片段，將hCu/Zn?SOD CDS片段定向插入經(jīng)酶切回收的大片段PET?16b空載體，以獲得PET/ hCu，Zn?SOD原核表達(dá)載體。

1.2.4 PET/hCu，Zn?SOD?PTD原核表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)上述獲得的PET/hCu，Zn?SOD原核表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶Ndel、XhoI進(jìn)行特異性酶切，膠回收獲得膠回收兩端帶有粘性末端的線性載體。對(duì)根據(jù)PTD設(shè)計(jì)的2條簡(jiǎn)并寡核苷酸序列進(jìn)行高特異性性退火雜交，選擇逐漸降溫的實(shí)驗(yàn)方法獲得人工合成的兩端帶有Ndel、XhoI限制性內(nèi)切酶粘性末端的小片段簡(jiǎn)并雙鏈DNA序列，插入PET?16b上述線性載體，以獲得PET/hCu，Zn?SOD?PTD原核表達(dá)載體。用T7引物對(duì)載體克域測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GENEBANK X02317 CDS進(jìn)行比對(duì)，鑒定插入片段與上敘片段的一致性。

1.2.5目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

PET?hCu，Zn?SOD原核表達(dá)載體與PET?PTD?hCu，Zn?SOD原核表達(dá)載體分別導(dǎo)入感受態(tài)E.coli BL21（DE3）中，挑選陽(yáng)性克隆至50 mL含氨芐青霉素（100 mg/L）的Luria?Bertani培養(yǎng)液中（LB培養(yǎng)基），于37℃擴(kuò)增培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入0.1 mol/L IPTG至終濃度1 mmol/L，置25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜。然后收集菌體，超聲裂菌，獲得上清。把上清緩慢通過(guò)Ni2+親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，分別得到His?Tag?hCu，Zn?SOD和His?Tag?hCu，Zn?SOD?PTD 2種融合蛋白，純化蛋白經(jīng)SDS?PAGE鑒定。蛋白定量后，儲(chǔ)存于70℃冰箱內(nèi)。

1.2.6 hCu，Zn?SOD?PTD蛋白穿透細(xì)胞膜能力實(shí)驗(yàn)

EC9706細(xì)胞用含10 %小牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI 1640培養(yǎng)液（添加鏈霉素和青霉素的終濃度均為1 000 U/mL）于5% CO2、37℃培養(yǎng)。細(xì)胞接種于6孔板中，在含10% FBS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，再在6孔中分別加入2 mmol/L 的hCu，Zn?SOD 20 μL，2 mmol/L的hCu，Zn?SOD?PTD 5 μL、10 μL、15 μL、20 μL及不含血清的1640培養(yǎng)基20 μL，37℃放置15 min后，每孔各加入熒光探針DCFH?DA作用5 min，然后用PBS洗滌3次，立即置于熒光相差顯微鏡觀察結(jié)果，或胰酶消化后懸浮于PBS中進(jìn)行流式細(xì)胞熒光檢測(cè)。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1重組PET/hCu，Zn?SOD?PTD原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

PET/hCu，Zn?SOD?PTD載體克隆區(qū)經(jīng)T7引物測(cè)序部分結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示插入片段與上述GENEBANK X02317 CDS片段一致、未發(fā)現(xiàn)變異。重組原核表達(dá)載體的鑒定中，hCu，Zn?SOD?PTD質(zhì)粒經(jīng)NdeI/BamH雙酶切后電泳圖見圖2。

2.2表達(dá)后細(xì)菌的蛋白提取物和融合蛋白純化后的SDS?Page分析

PET/hCu，Zn?SOD?PTD和PET/hCu，Zn?SOD重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）后，在IPTG誘導(dǎo)下產(chǎn)生目的融合蛋白，目的蛋白再經(jīng)鎳柱純化。以融合蛋白純化后產(chǎn)物進(jìn)行SDS?PAGE分析，結(jié)果顯示分別在18.6 kd和20 kd出現(xiàn)目標(biāo)表達(dá)條帶，與hCu，Zn?SOD?PTD和hCu，Zn?SOD融合蛋白的分子量相符，結(jié)果見圖3。SDS?PAGE的結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的原核表達(dá)載體在大腸桿菌中能夠穩(wěn)定而高效地分別表達(dá)hCu，Zn?SOD和hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白（圖4）。

2.3hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白作用于人食管癌細(xì)胞EC9706

將hCu，Zn?SOD?PTD、hCu，Zn?SOD與食管癌細(xì)胞共孵育15 min后，再加入熒光探針DCFH?DA，用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的DCF的熒光。由圖5至圖8可見，與空白對(duì)照組相比，hCu，Zn?SOD組的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化（P 0.05），而hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白組的熒光強(qiáng)度明顯減弱，組間P〈0.05，hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白不同濃度組間比較P〈0.05，不同濃度hCu，Zn?SOD?PTD組間熒光值均數(shù)隨濃度的增加而減少。有明顯的濃度依賴性，間接提示hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白可穿透細(xì)胞膜且保持生物學(xué)活性。

3　討論

人銅鋅超氧化物歧化酶是細(xì)胞內(nèi)一種重要的防御氧化應(yīng)激的蛋白酶，它不但在家族性肌萎縮性側(cè)索硬化癥、帕金森病、登革熱、癌癥、白內(nèi)障和多種神經(jīng)紊亂綜合征中具有重要的生理學(xué)意義和治療潛力，而且在食品和化妝品業(yè)中也具有廣闊的前景［10］。但是外源性的人銅鋅超氧化物歧化酶難以被人體吸收，使之在應(yīng)用方面收到了很大限制。本實(shí)驗(yàn)中采用了一種新的方法來(lái)解決這一問(wèn)題，即在人銅鋅超氧化物歧化酶的多肽鏈前添加一段具有跨膜轉(zhuǎn)送功能的短肽——PTD。

研究表明，PTD含豐富的堿性和疏水氨基酸的序列，其跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)的能力的大小與堿性氨基酸的序列和疏水氨基酸比例及其排列的空間構(gòu)像和多肽表面正電子的分布有關(guān)［11-13］。因此在TAT?PTD的基礎(chǔ)上，通過(guò)改變堿性氨基酸的分布與序列，就可以使得融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著提高。利用這些攜帶有PTD和效應(yīng)蛋白表達(dá)融合蛋白解決了大分子蛋白無(wú)法穿透細(xì)胞膜而發(fā)揮正常的生物活性這一難題，這一技術(shù)已經(jīng)是用于多種蛋白的跨膜實(shí)驗(yàn)中［4-9］。現(xiàn)代蛋白結(jié)構(gòu)分析軟件為模擬、篩選蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域序列提供了便捷的工具。如Ho等［12］就應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，通過(guò)改變結(jié)構(gòu)域中疏水氨基酸和堿性氨基酸的種類和分布、優(yōu)化表面電子分布，人工設(shè)計(jì)出比TAT?PTD具有更高效率的穿膜活性的PTD分子。在該研究中，利用軟件設(shè)計(jì)新的PTD序列，由11個(gè)氨基酸組成，序列為YARAAARQAR（Q）A，根據(jù)軟件計(jì)算，此序列的穿膜效率是天然TAT?PTD的33倍［12］。

本研究利用基因工程的方法得到了hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白。首先構(gòu)建PET16b/hCu，Zn?SOD和PET16b/hCu，Zn?SOD?PTD 2種重組原核表達(dá)載體。在人工設(shè)計(jì)合成的PTD序列的末端加上Ndel酶切位點(diǎn)的序列，與此同時(shí)通過(guò)雙酶切反應(yīng)在人銅鋅超氧化物歧化酶全長(zhǎng)cDNA序列的末端也得到一個(gè)Ndel酶切位點(diǎn)的序列，兩者通過(guò)連接酶連接，就得到hCu，Zn?SOD?PTD的全長(zhǎng)cD?NA序列。由于選用了PET16b作為原核表達(dá)載體，使表達(dá)的2種蛋白的N段含有連續(xù)的10個(gè)his標(biāo)簽融合序列，就可方便快捷利用Ni2+柱層析進(jìn)行純化。純化后洗脫液的SDS?PAGE結(jié)果表明，2種載體可以高效穩(wěn)定表達(dá)2種蛋白。

熒光探針DCFH?DA是進(jìn)行活性氧檢測(cè)的有效方法。DCFH?DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，且被細(xì)胞內(nèi)的活性氧氧化為有熒光的2′，7′?二氯熒光黃（dichlorofluorescin，DCF）。檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

本實(shí)驗(yàn)為檢測(cè)目的融合蛋白透過(guò)細(xì)胞膜的能力，將hCu，Zn?SOD?PTD、hCu，Zn?SOD與食管癌細(xì)胞共孵育15 min，用DCF法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越弱，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)SOD的活性越強(qiáng)。熒光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)hCu，Zn?SOD蛋白處理的細(xì)胞內(nèi)熒光值無(wú)明顯變化P〉0.05，而hCu，Zn?SOD?PTD蛋白處理組的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯減弱組間P〉0.05。與對(duì)照組hCu，Zn?SOD熒光值比較P〉0.01。這就間接提示hCu，Zn?SOD?PTD蛋白能有效快捷地穿過(guò)EC9706細(xì)胞膜清除氧自由基保持生物學(xué)活性，在特定濃度范圍內(nèi)，融合蛋白濃度與細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度成反比。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)并添加在目的蛋白前的PTD序列不僅可幫助蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，而且不影響目的蛋白發(fā)揮生物學(xué)活性。而hCu，Zn?SOD蛋白處理組由于細(xì)胞表面缺乏SOD特異性受體，外源性SOD無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其熒光強(qiáng)度值與空白對(duì)照沒(méi)有明顯的變化。此外，用不同濃度的hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白處理細(xì)胞相同時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度均值隨著濃度的增加而減少，顯示hCu，Zn?SOD?PTD融合蛋白透過(guò)細(xì)胞膜及清除氧自由基的作用具有濃度依賴性。

本研究依賴于生物信息學(xué)蛋白結(jié)構(gòu)和跨膜蛋白結(jié)構(gòu)的原理設(shè)計(jì)合成理論上具有高效穿膜活性的PTD結(jié)構(gòu)和hCu，Zn?SOD?PTD融合表達(dá)，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)顯示良好的穿膜能力，進(jìn)一步提高了PTD分子的內(nèi)化作用。為建立一種高效的PTD分子打下了良好的基礎(chǔ)，建立了一種成本低、且能穩(wěn)定表達(dá)的原核表達(dá)載體。由于PTD分子的高效穿膜活性使得細(xì)胞表面沒(méi)有受體的hCu，Zn?SOD?PTD能更有效率的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其應(yīng)有的生物學(xué)活性，也預(yù)示可以通過(guò)優(yōu)化PTD結(jié)構(gòu)把缺少穿越細(xì)胞膜的蛋白高效率的穿越細(xì)胞生物膜來(lái)發(fā)揮其生物活性。

參考文獻(xiàn)

［1］Hallewell RA，Masiarz FR，Najarian RC. Human Cu/ Zn superoxide dismutase cDNA：isolation of clones synthesising high levels of active or inactive enzyme from an expression library［J］. Nucleic Acids Res，1985，13（6）：2017-2034.

［2］Green M，Loewenstein PM. Autonomous functional do?mains of chemically synthesized human immunodefi?ciency virus tat trans?activator protein［J］. Cell，1988，55（6）：1179-1188.

［3］van den Berg A，Dowdy SF. Protein transduction do?main delivery of therapeutic macromolecules［J］. Curr Opin Biotechnol，2011，12（6）：888-893.

［4］Gu Q，F(xiàn)eng T，Cao H，et al. HIV?TAT mediated pro?tein transduction of Cu/Zn?superoxide dismutase?1 （SOD1）protects skin cells from ionizing radiation［J］. Radiat Oncol，2013，8：253.

［5］Liu J，Hou J，Xia ZY，et al. Recombinant PTD?Cu/Zn SOD attenuates hypoxia?reoxygenation injury in cardio?myocytes［J］. Free Radic Res，2013，47（5）：386-393.

［6］Park J，Ryu J，Jin LH. 9?Polylysine Protein Transduc?tion Domain：Enhanced Penetration Efficiency of Super?oxide Dismutase into Mammalian Cells and Skin［J］. Mol Cells，2002，13（2）：202-208.

［7］Ni Y，Yu J，Xu JP，et al. Enhanced delivery of human growth hormone across cell membrane by Tat?PTD［J］. Endocrine，2014，46（1）：138-147.

［8］Wadia J，Eguchi A，Dowdy SF，et al. DNA delivery in?to mammalian cells using bacteriophage displaying the TAT transduction domain［J］. Cold Spring Harb Pro?toc，2013，7：283-287.

［9］Presente A，Dowdy SF. PTD/CPP peptide?mediated de?livery of siRNAs［J］. Curr Pharm Des，2013，19（16）：2943-2947.

［10］方允中，李文杰.自由基與酶（2版）［M］.北京：科學(xué)出版社，1996：125.

［11］Zhang S，Cao Y，Xie L，et al. Effect of superoxide dis?mutaseentrapped liposomes and protein transduction do?mainsuperoxide dismutase on human umbilical vein en?dothelial cells［J］. Mol Med Rep，2014，9（4）：1427-1433 .

［12］Ho A，Schwarze SR，Mermelstein SJ，et al. Synthetic protein transduction domains：enhanced transduction po?tential in vitro and in vivo［J］. Cancer Research，2001，61（2）：474-477.

［13］Leifert JA，Lindsay WJ.“Translocatory protein”and “protein transduction domain”：a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms ［J］. Mol Therapy，2003，8（1）：13-20.

論著

Study on expression and trans?membrane activity of human Cu，Zn?SOD?PTD

WANG Xiaoxun1，QI Shaohua1，LI Ruiming2，LIANG Qingle1
（1. Inspection Department of Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，442000；
2. Biomedical Institute of Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，442000）

[ABSTRACT]Objective To study the expression and trans?membrane activity of human Cu, Zn?SOD?PTD. Methods First, protein transduction domain (PTD) sequence was designed and synthesized. Human Cu, Zn?SOD was amplified by reverse transcription PCR using the complete RNA of human embryonic liver as a template. Second, hCu, Zn?SOD gene and PTD sequence were inserted into pET16b plasmid. Then the recombinant plasmids were transformed into E. coli BL21 after sequencing identification. After being induced by isopropyl?β?d?thiogalactoside(IPTG), the fusion proteins were purified by nitrilotriacetic acid sepharose and the results were determined by SDS?PAGE. Third, the fusion proteins were co?cultured with the EC9706 cells and the trans?membrane activity was tested by laser scanning confocal microscopy and flow cytometer. Results The sequencing results were consistent with the full length cDNA sequence of hCu, Zn?SOD, and the results of SDS?PAGE showed 18.6 kd and 20 kd bands. The results oflaser scanning confocal microscopy and flow cytometer showed that the fusion proteins could be transduced into EC9706 cells and were enzymatically active. Conclusion Recombinant PET16b plasmids containing hCu, Zn?SOD?PTD gene were constructed successfully and fusion hCu, Zn?SOD?PTD proteins could be transduced into the cell membrane efficiently without the loss of enzymatic activity.

［KEY WORDS］Protein transduction domain（PTD）；Human Cu，Zn?SOD；Biomembrane；Prokaryotic expression vector；Internalization

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81171783）

通訊作者：王曉勛，E?mail：524910@qq.com