廣西壯族兒童肥胖與黑素皮質素受體基因rs17782313位點多態性的關系

唐寧　陳藝丹　曾婷　覃正學　嚴提珍　羅世強　李伍高　李靜文　王秋華　李哲濤

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廣西壯族兒童肥胖與黑素皮質素受體基因rs17782313位點多態性的關系

唐寧1陳藝丹2曾婷3覃正學4嚴提珍1羅世強1李伍高1李靜文1王秋華1李哲濤1

［摘要］目的探討黑素皮質素基因MC4R單核苷酸多態性位點rs17782313與壯族兒童單純性肥胖的相關性。方法利用SNaPshot技術分析收集到的285兒童（151例廣西柳州壯族單純性肥胖兒童和134例健康對照兒童）MC4R基因rs17782313位點的基因型，記錄身高體重，并測定空腹血糖（serum fasting glucose，FBG）、膽固醇（cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high?density lipoprotei，HDL?C）及低密度脂蛋白（low?density lipoprotein，LDL?C）。結果正常對照組和肥胖組MC4R基因CC型、CT型及TT型基因型頻率分別為1.49%、26.11%、72.39%和3.31%、32.45%、64.24%，兩組最小等位基因（C等位基因）頻率分別為14.55%和19.54%，經Hardy?Weinberg遺傳平衡定律檢驗，其等位基因在病例組及對照組人群中的分布符合遺傳平衡，說明樣本具有群體代表性。兩組基因型與等位基因頻率差異均無統計學意義（P〉0.05）；rs17782313位點各基因型間代謝指標（FBG、TC、TG、HDL?C和LDL?C）無顯著差異。結論MC4R基因rs17782313位點多態性與廣西壯族兒童單純性肥胖無關。

［關鍵詞］黑素皮質素；基因多態性；單純性肥胖；壯族

作者單位：1.廣西柳州市婦幼保健院醫學遺傳科，廣西，柳州545001
2.柳州市紅十字會醫院檢驗科，廣西，柳州545001
3.廣西柳州市婦幼保健院兒保科，廣西，柳州545001
4.廣西科技大學第一附屬醫院體檢科，廣西，柳州545002

兒童肥胖現象愈發嚴重，已逐漸成為社會關注的健康問題。流行病學研究發現，我國兒童單純性肥胖率高達7.2%，接近歐美發達國家水平［1］。肥胖是由環境和遺傳因素共同作用而發生的，但目前越來越多的證據表明，遺傳因素在肥胖的發生發展中起著重要的作用［2］。肥胖發生的機制主要是由于體內能量失衡所導致的，MC4R基因編碼的蛋白在調節體內能量平衡上發揮著重要作用［3］，并且被認為與體重指數（body mass index，BMI）密切相關［4］，2008年全基因組關聯分析（ge?nome?wide association study，GWAS）發現MC4R基因多態性位點rs17782313與成人和兒童肥胖有明顯的關聯［2］。基于以上結論，本文以廣西壯族兒童為研究對象，探討黑素皮質素基因MC4R基因rs17782313位點多態性與廣西壯族兒童肥胖及其代謝指標的關系，旨在從分子生物學角度探討肥胖在廣西壯族人群中的遺傳機制。

1　資料與方法

1.1一般資料

2014年4月～2014年12月選取柳州市中小學壯族兒童285人，兒童單純性肥胖診斷標準：超過同身高同性別參照人群標準體質量的20%者定為單純性肥胖兒童［1］。肥胖組151例，其中男性111例，女性40例，平均年齡13.31±4.13歲；健康對照組134例，其中男性63例，女性71例，平均年齡13.20±2.57歲。兩組兒童均未服用激素與影響脂代謝的藥物。本研究經得研究對象父母同意，并獲得醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2方法

1.2.1BMI及代謝指標測定

兩組兒童于相同條件下按照標準方法測量身高和體重，根據公式BMI=W（kg）/H（m2）計算BMI，其中W代表體重，單位為kg，H代表身高，單位為m。抽取所有研究對象清晨空腹靜脈血，分離血清，測定空腹血糖（serum fasting glucose，FBG），膽固醇（cholesterol，TC），甘油三酯（triglyc?eride，TG），高密度脂蛋白（high?density lipoprotei，HDL?C）及低密度脂蛋白（low?density lipoprotein，LDL?C），以上測定都在全自動生化分析以上進行。全部測定由專人負責在固定的儀器上進行，并進行質控。同時抽取2 mL靜脈血予乙二胺四乙酸二鈉（EDTA?Na2）抗凝，酚氯仿法提取全基因組DNA，標本-80℃保存，用于基因分析。

1.2.2基因多態性檢測

使用SNaPshot技術，在ABI3730XL型DNA序列檢測儀（ABI，美國）平臺上，結合軟件GeneMap?per 4.0分析完成對MC4R基因rs17782313位點單核苷酸多態性的基因分型檢測。該位點PCR擴增正向引物為F：5′AGGCTCTGCTCTGTGTCTCTT 3′，反向引物為R：5′CTTCTGGAGGCAGGTTCT?GT3’。SNaPshot反應過程中延伸引物序列為：5′tttttttttttttttttttttttttttttttttTAAAGCAGGAGAGATTGT ATCC 3′，PCR反應體系為20 μ L，包括10×PCR緩沖液（Mg2+free，invitrogen，美國）2 μ L，dNTP混合物0.5 μ L（10 mmol/L，Takara，日本），0.8 μ L MgCl2（50 mmol/L，invitrogen，美國），Platinum Taq DNA聚合酶0.2 μ L（5U，invitrogen，美國），PCR正向和反向引物（10 pmol/L）各0.5 μ L和1 μ L DNA模板（20 mg/L）。PCR反應程序：95℃變性2 min；94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，33個循環；最后72℃延伸5 min，結束后4℃保存。PCR產物經過純化處理后，在ABI3730XL型DNA序列檢測儀上進行毛細管電泳，運行GeneMapper 4.0軟件分析實驗結果。

1.2.3統計學方法

2　結果

2.1一般情況

肥胖組151例，其中男性111例，女性40例，平均年齡13.31±4.13歲，平均BMI值27.48±4.03 kg/m2；正常組134例，其中男性63例，女性71例，平均年齡13.20±2.57歲，平均BMI值18.88±2.50 kg/m2。BMI值在組間的差異有統計學意義（t= 31.471，P〈0.05），以肥胖組的BMI為高。肥胖組與正常組間男女人數的構成比有統計學差異（P〈0.05），肥胖組中的男性明顯多于正常組，女性明顯少于正常組，在該年齡段人群中男性肥胖率為63.79%（111/174），女性為36.04%（40/111），結果見表1。

表1　研究對象的一般情況Table 1 The general condition of the research object

在代謝參數上，血糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白各指標在組間差異均有統計學意義（P〈0.05），結果見表2。

表2　肥胖組與對照組代謝指標的比較Table 2　 The metabolism indices between the obesity group and the control group

2.2MC4R基因rs17782313位點基因型及等位基因型頻率在肥胖組和正常對照組的比較

健康對照組和肥胖組MC4R基因rs1778231 3CC型、CT型及TT型基因型頻率分別為1.49%、26.11%、72.39%和3.31%、32.45%、64.24%，等位基因C、T頻率分別為14.55%、85.45%和19.54%、80.46%，經Hardy?Weinberg遺傳平衡定律檢驗，其等位基因在病例組及對照組中的分布符合遺傳平衡，說明樣本具有群體代表性。肥胖組的BMI顯著高于健康對照組，差異有統計學意義（P〈0.05），然而引起這一差異的原因與MC4R基因rs17782131位點多態性沒有關聯（P〉0.05）。具體結果見表3。

表3　肥胖組和對照組MC4R基因rs17782313位點基因型和等位基因頻率n（%）Table 3　 The frequencies of genotype and allele of MC4R gene rs17782313 in the obesity group and the control group［n（%）］

2.3MC4R基因rs17782313位點多態性與肥胖代謝指標間的相關性

MC4R基因rs17782313位點CC、CT、TT基因型與各代謝參數血糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白間的差異無統計學意義（表4）。

表4 　MC4R SNP rs17782313位點不同基因型肥胖相關代謝組分比較Table 4 Analysis genotype and metabolism indices at the SNP rs17782313 of gene MC4R

3　討論

MC4R基因是黑素皮質素受體家族成員之一，由下丘腦腹側核分泌，是一個調節能量平衡的重要信號分子，在控制飲食和機體質量穩態中起關鍵作用［5］。MC4R基因定位于人類基因組第18號染色體長臂（18q22），至全基因組關聯分析發現MC4R基因rs17782313多態性位點與肥胖密切相關以后，近年來國內外有很多關于該位點與肥胖關系的研究。Renstrom等［6］在對4 923例瑞典北部成年人的GWAS研究中再一次證明了rs17782313位點與肥胖相關聯。然而在隨后的研究中卻出現了不一致的結論。Ng等［7］科學家在對7 705個中國人12個易感基因的14個多態性位點發現MC4R基因的rs17782313位點與肥胖并無顯著相關性。而同一年Cheung等［8］科學家報告了該多態性位點與肥胖顯著相關。日本科學家Katsuura?Kamano等［9］在2 035例日本人隊列研究中也證明了MC4R基因的rs17782313位點與肥胖無顯性關系。本研究在利用SNaPshot技術分析的基礎上，分別分析了廣西壯族兒童肥胖組和對照組MC4R基因rs17782313位點基因型，結果發現MC4R基因rs17782313多態性位點基因型CC、CT、TT的構成比以及等位基因頻率在肥胖組和健康對照組中均無顯著差異（P〉0.05），結果與與日本科學家一致。在代謝指標的研究中，各基因型組的血糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白之間并沒有顯著差異（P〉0.05），說明MC4R基因rs17782313位點多態性與機體代謝無直接聯系。而這一結論也得到了Yilmaz等［10］科學家的證實，Ho?Urriola等［11］科學家也得出了相同的結論，MC4R基因rs17782313多態性位點在對于兒童肥胖的貢獻上主要是通過影響情緒，食欲以及進食缺少饑餓感等行為上去影響肥胖的發生。本次研究發現肥胖組中男女比例與對照組中男女比例存在著很大的差異（P〈0.05），肥胖組中男性兒童青少年明顯高于正常組，而女性少于正常組。肥胖在男性中的比率明顯高于女性，呈現出男高女低的特點，這一特點與國內研究一致［12］，但其產生的原因尚不完全清楚。MC4R基因rs17782313位點多態性在肥胖組與正常組中差異無統計學意義，考慮為青少年兒童正處于身體發育階段，隨著年齡的增長差異會越發顯著，此外環境的因素也可能掩蓋或減弱基因的作用。不同地域，不同人群，不同飲食習慣上都存在著差異也影響著研究結果。

綜上所述，本研究中顯示MC4R基因rs17782313位點多態性位點與廣西壯族兒童肥胖及各代謝指標無顯著聯系。分析可能原因主要是基因多態性位點存在著種族和地域的差異，肥胖的發生發展是眾多易感基因及環境因素相互作用的結果。基因的多態性與肥胖的關系還參雜著環境因素和生活行為等因素的交互作用，某個位點變異的效應可能被其他基因或環境效應所修飾，這些都需要通過擴大樣本規模提高檢驗效能才能得出的更有意義的結論。

參考文獻

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Relationship between SNP rs17782313 variation in MC4R gene and obesity in zhuang nationality children

TANG Ning1，CHEN Yidan2，ZENG Ting3，QIN Zhengxue4，YAN Tizhen1，LUO Shiqiang1，LI Wugao1，LI Jingwen1，WANG Qiuhua1，LI Zhetao1
（1. Department of Medical Genetics，Liuzhou Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001；2. Clinical Laboratory，Liuzhou Red Cross hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001；3. Department of Child Health，Liuzhou Municipal Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou，Guangxi，China，545001；4.Department Of Medical Examination，The First Affiliated Hosipital of Guangxi Medical University，Liuzhou，Guangxi，China，545002）

［ABSTRACT］Objective To explore the relationship between the single nucleotide polymorphisms (SNP) rs17782313of the M4CR gene and simple obesity in children of the Zhuang nationality. Methods 285 children (151 cases of simple obese children and 134 healthy control children) in Liuzhou were enrolled. Height and bodyweight were measured. Serum fasting glucose (FBG), cholesterol (TC), triglyceride (TG), high?density lipoprotein (HDL?C) and low?density lipoprotein (LDL?C) were measured, and SNP rs17782313 singlebook=2,ebook=29nucleotide polymorphisms of MC4R gene were detected by SNaPshot assay. Results The CC, CT and TT genotype frequencies of rs17782313 polymorphism in normal control group and simple obesity group were 1.49% , 26.11% , 72.39% and 3.31% , 32.45% , 64.24% , respectively. Minor allele frequencies (C allelic frequency) in the simple obesity group and the normal control group were 14.55%, and 19.54%, respectively. SNP rs17782313 of the MC4R gene were found in Hardy?Weinberg equilibrium. The genotype and allelic frequencies of rs17782313 and metabolic parameters (FBG, TC, TG, HDL?C and VDL?C) in simple obese children were not significantly different from those in controls (P〉0.05). Conclusions rs17782313 polymorphisms of MC4R gene are not associated with simple obesity in Chinese Zhuang preschool children in Liuzhou of Guangxi province.

［KEY WORDS］MC4R；Genetic polymorphism；Simple obesity；Zhuang nationality

基金項目：中國疾病預防控制中心婦幼保健中心合生元母嬰營養與健康研究項目（2012FY009）；廣西壯族自治區衛生廳自籌課題（Z2013602）

通訊作者：李哲濤，E?mail：48217306@qq.com