小鼠ANA-1巨噬細胞不同極化狀態下補體組分mRNA動態分析①

袁夢嬌　商正玲　馬亞萍　吳家紅

(貴州醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，貴陽550025)

小鼠ANA-1巨噬細胞不同極化狀態下補體組分mRNA動態分析①

袁夢嬌商正玲馬亞萍吳家紅②

(貴州醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，貴陽550025)

[摘要]目的：觀察小鼠ANA-1巨噬細胞不同極化狀態下補體相關組分的mRNA動態變化。方法：分別以LPS(1 μg/ml)、IL-4(20 ng/ml)體外刺激小鼠ANA-1細胞，于刺激后3、8、12及24 h時間點收獲細胞，Trizol法提取細胞總RNA，采用實時熒光定量PCR法檢測IL-1β、CCL2、Arg-1的表達，判斷細胞極化情況，檢測胞內C3、CfB、CRIg、C1q補體分子mRNA的動態表達。結果：細胞極化情況：刺激3 h后LPS組IL-1β、CCL2 的mRNA表達上調，12 h達高峰(2-△△Ct分別為297.0±31.0和19.9±3.3)；在IL-4組中以Arg-1mRNA表達上調顯著，于24 h達高峰(2-△△Ct：27.3±9.1)，提示LPS組細胞向M1方向極化，IL-4組向M2方向極化。細胞內補體mRNA的動態：兩極化組的相應補體組分均表現為不同程度的上調，其中：C1q、C3在M2極化組刺激8 h后顯著上調，刺激12 h時達高峰(2-△△Ct分別為94.9±12.9和11.3±2.4)；CfB因子在M1極化組中顯著上調，以刺激12 h表達上調達高峰(2-△△Ct為61.4±6.2)；CRIg在兩組中均在24 h時表達上調且具有顯著性差異(P<0.05)。結論：LPS/IL-4刺激3 h后，ANA-1細胞分別向M1、M2方向極化；不同補體組分mRNA的表達在兩組中均上調但表達譜不同，其中C1q、C3和CRIg在M2極化組中上調更為顯著，而CfB因子在M1極化組中顯著上調；除CRIg外，C1q、C3及CfB因子均在刺激12 h時上調達高峰，上述結果提示補體組分的變化可能與極化的巨噬細胞功能有關。

[關鍵詞]ANA-1；巨噬細胞極化；補體組分mRNA

在脊椎動物體內補體系統由30多種蛋白組成，通常以無活性的形式廣泛存在于血液、組織液和細胞膜表面，是機體固有免疫的重要組成成分[1]。除血液中的補體成分主要由肝細胞合成分泌外，機體局部組織中的肝外補體主要來自活化的巨噬細胞。近年來，不同微環境造成巨噬細胞的極化而導致不同的免疫結局成為研究的熱點問題。Th1型細胞因子(如IFN-γ)、TLR配體(如LPS)和一些危險信號可刺激巨噬細胞向M1方向極化，導致IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL2、活性氮和氧中間體的分泌釋放增多，MHCⅠ和MHCⅡ的表達增高，細胞具有較強的促炎作用、抗原提呈能力和殺微生物的特點。而IL-4、IL-13等Th2型細胞因子，可刺激巨噬細胞向M2方向極化，細胞以IL-10、Arg-1高表達和IL-12低表達為特征，參與抗寄生蟲免疫、局部組織修復，炎癥抑制等作用[2]。

巨噬細胞和補體系統同屬機體固有免疫的重要代表，然而人們對不同極化狀態下的巨噬細胞表達補體的差異及規律認識不足[3]，故本研究以LPS和IL-4分別刺激小鼠巨噬細胞ANA-1建立細胞極化模型后，檢測細胞內不同補體成分mRNA的變化，為探究不同極化狀態的巨噬細胞表達補體組分的差異和規律提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑RPMI1640培養基、100 U/ml青-鏈霉素、胰蛋白酶(HyClone公司)；Trizol Reagent(Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒、SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa Biotechnology公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；IL-4(eBioscience 公司)；LPS(Sigma公司)。

1.1.2細胞ANA-1細胞系來源于C57BL/6小鼠的骨髓單核巨噬細胞[4]，為四川大學鮑郎教授惠贈。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養小鼠巨噬細胞ANA-1用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養基，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗；

1.2.2LPS/IL-4刺激ANA-1細胞ANA-1細胞以106個/孔接種于6孔培養板內，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養24 h 后，將LPS(1 μg/ml)、IL-4(20 ng/ml)分別添加到ANA-1細胞培養基中。以添加等量PBS的細胞組作為空白對照。于刺激3、8、12、24 h后，PBS洗2次，收集細胞。

1.2.3Trizol法提取細胞總RNA并逆轉錄收集細胞后用Trizol法提取總RNA：加入Trizol裂解液1 ml裂解細胞15 min后，加入氯仿200 μl，劇烈震蕩15 s，離心12 000 r/min，4℃，15 min。吸取上層水相，轉入新的1.5 ml Ep管，加入等體積異丙醇，混勻，-20℃靜置1 h后離心12 000 r/min，4℃，10 min。棄上清，加入75%乙醇(以DEPC水配制)1 ml洗滌，7 500 r/min，5 min，4℃離心，棄上清，室溫干燥后溶于20 μl DEPC水中并定量。根據逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，-20℃保存。之后用實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)法檢測相關基因的表達。

1.2.4Real-Time PCR法檢測相關基因mRNA的表達采用SYBR-Green染料法檢測LPS/IL-4刺激細胞后各基因的表達水平。引物在上海捷瑞有限公司合成。反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，退火31 s，40個循環。以GAPDH為內參基因。目的基因mRNA表達水平采用2-△△Ct公式計算。判斷依據：2-△△Ct>2認為基因表達增高，2-△△Ct<0.5認為基因表達下調。引物序列見表1。

表1Real-Time PCR引物序列

Tab.1Sequence of Real-Time PCR primers

Forwardsequence(5'-3')Reversesequence(5'-3')ProductsizeIL-1βTGTGAAATGCCACCTTTTGATGTCCTCATCCTGGAAGGTC240CCL2TTAAGGCATCACAGTCCGAGTGAATGTGAAGTTGACCCGT129Arg-1CAGAAGAATGGAAGAGTCAGCAGATATGCAGGGAGTCACC249C3GCAGGTCATCAAGTCGGCTTAGCTGGTGTTGGGCTTTTC162CRIgGGACGAAGAGACCTGTTGTAGATGAGTGTTCGGACGC278CfBCTCGAACCTGCAGATCCACTCAAAGTCCTGCGGTCGT112C1qTAGAAGCATCACAGAACATAGAAGCAGCAGTAACAG108

2結果

2.1LPS/IL-4刺激后 ANA-1細胞的極化結果顯示：各檢測時間點PBS對照組胞內IL-1β、CCL2、Arg-1 mRNA的表達穩定(圖1)。而LPS刺激組3 h后IL-1β mRNA表達明顯增高，12 h達高峰(2-△△Ct值達297.0±31.0)，24 h仍可維持較高水平(2-△△Ct值達64.0±13.1)；CCL2 mRNA也表現為相似的動態，于12 h達高峰(2-△△Ct值達19.9±3.3)。但Arg-1 mRNA的表達以IL-4組顯著增加，于24 h達高峰(2-△△Ct值達27.3±9.1)，而在LPS組中表達不明顯。上述結果表明LPS刺激組ANA-1細胞向M1方向極化，而IL-4刺激組細胞向M2方向極化(圖2)。

2.2不同時間點PBS組胞內各補體成分mRNA的動態結果顯示：各檢測時間點內PBS對照組細胞內補體C1q、C3、CfB、CRIg mRNA動態均無顯著性差異(圖3)。

2.3不同極化狀態下胞內補體C1q mRNA的動態結果顯示： M2組(IL-4刺激組)C1q mRNA水平在8 h后顯著高于LPS組， 12 h時達高峰(2-△△Ct值為94.9±12.9)，24 h時下降(2-△△Ct值為4.1±4.0)。而在M1組(LPS刺激組)中C1q mRNA波動不明顯，僅在12 h瞬時上調(2-△△Ct值為5.3±0.7)(圖4A)。

2.4不同極化狀態下胞內補體CfB mRNA的動態結果顯示： M2組3 h CfB表達開始上調，以8 h上調達高峰(2-△△Ct值為4.75±1.43)。M1組在刺激8 h時表達上調(2-△△Ct值可達14.4±1.4)，以12 h達高峰(2-△△Ct值可達61.4±6.2)，24 h后表達減弱(2-△△Ct值達8.6±2.3)。CfB基因表達以M1組上調差異顯著(圖4B)。

圖1　PBS作用ANA-1細胞后胞內IL-1β、CCL2、Arg-1 mRNA的表達Fig.1　Expression of IL-1β,CCL2，Arginase-1 mRNA in ANA-1 cells treated with PBS

圖2　LPS/IL-4刺激ANA-1細胞后胞內IL-1β、CCL2、Arg-1 mRNA相對表達量(2-△△Ct)Fig.2　Relative expression of IL-1β,CCL2，Arge-1 mRNA in ANA-1 cells treated with LPS and IL-4，respectively(2-△△Ct)Note: The 2-△△Ct of LPS groups compared with IL-4 groups，**.P<0.01；***.P<0.001.

圖3　PBS作用ANA-1細胞后胞內C1q、CfB、CRIg、C3 mRNA的表達Fig.3　Expression of C1q，CfB，CRIg，C3 mRNA in ANA-1 cells treated with PBS

圖4　LPS/IL-4刺激ANA-1細胞后胞內C1q、CfB、CRIg、C3相對表達量(2-△△Ct)Fig.4　Relative expression of C1q，CfB，CRIg，C3 mRNA in ANA-1 cells treated with LPS and IL-4，respectively(2-△△Ct)Note: The 2-△△Ct of LPS groups compared with IL-4 groups，*.P<0.05；***.P<0.001.

2.5不同極化狀態下胞內補體CRIg mRNA的動態結果顯示：刺激24 h時兩組中該基因表達均上調，其中M1組2-△△Ct值達6.5±1.8，M2組為10.8±3.2，兩組間具有顯著性差異(P<0.05)，見圖4C。

2.6不同極化狀態下胞內補體C3 mRNA的動態結果顯示：不同檢測時間點M2組均較M1組表達明顯增高，8 h時2-△△Ct值達8.0±1.2，12 h時達高峰(11.3±2.4)，24 h后下降(7.9±1.3)。M1組中該基因波動不明顯，僅在8～12 h間輕微上調,見圖4D。

3討論

補體是生物體早期進化的免疫成分之一，在海膽、文昌魚、七鰓鰻和盲鰻等無脊椎動物體內均有發現[5]。在補體系統中C1q是參與補體經典激活途徑的第一個成員，MBL是補體MBL途徑的成員代表，CfB因子是補體旁路途徑活化的首要成分之一，而C3是補體系統激活的樞紐成分。補體被激活后參與炎癥、組織器官發育、腫瘤等許多病理生理過程[6]。

巨噬細胞具有極大的可塑性，M1極化的細胞具有較強的抗原提呈和殺微生物的特點及促炎作用，但過度M1極化會導致炎癥失控，造成組織損傷。而M2極化的細胞能促組織修復，抑制炎癥，維持局域組織穩態，成為持續性感染的原因之一[7]。組織中定居的巨噬細胞合成分泌補體，是局域免疫的重要成分。本實驗用LPS(1 μg/ml)、IL-4(20 ng/ml)分別刺激小鼠ANA-1巨噬細胞建立極化模型，探討不同極化的巨噬細胞胞內補體組分mRNA的動態變化。結果顯示：刺激3 h后LPS組IL-1β、CCL2的表達較IL-4組有明顯增加，說明巨噬細胞向M1方向極化。而受IL-4刺激后細胞Arg-1基因高表達，提示其向M2方向極化。

在此極化模型基礎上，我們首先檢測PBS對照組中胞內補體組分mRNA的動態，發現不同時間點補體表達變化不明顯(圖3)。通過對不同極化巨噬細胞的C1q、CfB、C3及CRIg mRNA的2-△△Ct值分析發現，胞內補體成分在兩組中均有不同程度的上調：CfB在M1組中顯著上調，而C3、C1q及CRIg在M2組中顯著上調；此外，除CRIg外，各組C1q、CfB及C3的表達均表現相似的時間動態，在12 h出現高峰表達，24 h表達逐漸降低。

C1q是最早被發現的補體成分，巨噬細胞是其產生的主要來源[8]。近年來C1q作為一種模式識別受體(PRR)越來越受到關注，與C-反應蛋白、低密度脂蛋白、PTX3以及多種PAMP/DAMP配體結合后參與補體激活、凋亡細胞清除等過程。研究顯示，C1q與受體(如C1qR、清道夫受體、甘露糖受體等)結合后，能增強巨噬細胞的吞噬功能，導致IL-10、IL-27上調，抑制IL-1β的表達，參與局域組織修復及穩態的功能[9]。C1q可抑制攝取oxLDL的Raw264.7巨噬細胞中NF-κB通路，使IL-1β、IL-6表達下降，而IL-10增加[10]。本研究數據提示IL-4刺激后向M2極化的小鼠ANA-1巨噬細胞株也出現C1q mRNA的顯著上調，提示該補體組分參與M2型巨噬細胞的生物學效應。

CfB是啟動補體旁路途徑活化的關鍵過程[11]。本研究結果顯示M1巨噬細胞在刺激12 h后B因子的mRNA水平達高峰(2-△△Ct：61.4±6.2)，而在M2組中變化不明顯，提示CfB因子與M1型巨噬細胞功能有關聯。臨床資料顯示膿毒血癥患者體內CfB的表達明顯增加，腹水和血清中Ba和C3片段顯著增加。在小鼠的敗血癥模型中發現敲除TLR4(LPS的受體)后CfB表達降低，表明CfB是LPS-TRL4信號通路的下游靶基因[12，13]。

CRIg是僅表達于組織中巨噬細胞的一類補體受體。與配體結合后，可增強巨噬細胞對病原體的識別和吞噬能力，參與病原體和凋亡細胞的清除[14]。本實驗結果顯示：在刺激24 h后兩組細胞內CRIg mRNA才顯著上調，滯后于其他補體成分，若需觀察該成分的動態還需延長檢測時間。

C3是補體活化的樞紐成分，C3a與C3aR結合后激活ERK1/2信號通路，促進胞內ATP的釋放，誘導NLRP3炎癥小體活化，IL-1β的成熟和釋放，參與清除循環免疫復合物、降低B細胞活化閾值、調理吞噬、調節Th細胞分化等多種效應[15-17]。已有研究證實M1極化時巨噬細胞中C3aR1的表達上調而在M2細胞中下調，均提示C3參與不同極化細胞的功能[17]。本實驗結果顯示：M2極化組C3 mRNA表達較M1組明顯，但相對其他補體組分而言，C3在胞內變化幅度較低，這可能與C3基因本身在細胞中表達的基值較高有關。

巨噬細胞向M1和M2極化不僅是一個動態可逆的過程[2]，研究顯示補體的不同成分對細胞的極化調控不同，如C1q、C3b有助于細胞向M2方向分化，而C3a、C5a及C5b-9驅動細胞向M1方向極化[9，18]。而本實驗探討在細胞極化后補體不同組分的mRNA動態，為說明補體與巨噬細胞功能變化的內在關聯提供了一定的實驗依據。

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[收稿2015-12-15修回2016-03-18]

(編輯倪鵬)

Dynamic characteristics of intracellular complement components mRNA in different mouse macrophage ANA-1 polarization

YUAN Meng-Jiao，SHANG Zheng-Ling，MA Ya-Ping，WU Jia-Hong.

The Department of Immunology,Basic Medical School,Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China

[Abstract]Objective:To reveal the dynamic characteristics of the intracellular complement mRNA from mouse macrophage ANA-1 treated with LPS or IL-4.Methods: The polarization models of macrophage ANA-1 were established by treating with LPS(1 μg/ml) and IL-4(20 ng/ml),respectively.After treating at 3,8,12 and 24 h,the total RNA were abstracted by Trizol lysis methods .The macrophage polarization were estimated by the expression of IL-1β,CCL2 and Arg-1 mRNA detected by Real-time fluorescent quantitative PCR.The intracellular complement C1q,C3,CfB and CRIg mRNA were quantitatively analyzed.Results: The mouse macrophage ANA-1 cells treated with LPS was polarized to M1 since the levels of IL-1β and CCL2 mRNA were up-regulated significantly,in which their 2-△△Ctvalue were up to 297.0±31.0 and 19.9±3.3 respectively at 12 h.On the other hand,the ANA-1 cells treated with IL-4 was polarized to M2 because the level of Arg-1 mRNA was obviously higher(the 2-△△Ctvalue of Arg-1 mRNA was up to 27.3±9.1 at 24 h)(P<0.05).The intracellular complement C1q,C3,CfB and CRIg mRNAs all were up-regulated in different polarized macrophages.The intracellular C1q and C3 mRNA in polarized M2 were significantly higher,in which the peak value of C1q and C3 were to 94.9±12.9 and 11.3±2.4 at 12 h，respectively(P<0.05).Reversely,the CfB mRNA in polarized M1 increased obviously,in which its 2-△△Ctwas to 61.4±6.2 at 12 h.In addition,the CRIg mRNA in both groups was only up-regulated at 24 h,in which the 2-△△Ctvalue was 6.5±1.8 in M1 and 10.8±3.2 in M2(P<0.05).Conclusion: The macrophage ANA-1 cell polarization models were successfully established by treated with LPS or IL-4.The intracellular complement C1q,C3 and CRIg mRNA in polarized M2 were transcripted more than in M1.But the intracellular CfB mRNA in polarized M1 was up-regulated significantly.These results suggested that the dynamic characteristic of complement components in different polarized macrophage would be correlated with its funtions.

[Key words]ANA-1;Macrophage polarization;Complement component mRNA

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.003

作者簡介：袁夢嬌(1989年- ),女,醫學碩士,主要從事抗感染免疫方面的研究,E-mail:myyuanmengjiao@163.com。 通訊作者及指導教師：商正玲(1974年-),女,醫學博士,副教授,碩士生導師,主要從事抗感染免疫方面的研究，E-mail:shangzhengling@126.com。

中圖分類號R392.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0782-05

①本文受貴州省社會發展合作專項資金項目(黔科合[2010]3155)和貴州省科學技術基金(黔科合J字[2008]2156號)資助。

②貴州醫科大學基礎醫學院病原生物學實驗室，貴陽550025。