凡納濱對蝦新過敏原烯醇化酶的鑒定

談思怡　黃建芳　孫一帆　郭成斌　向軍儉

(暨南大學抗體工程研究中心 暨南大學廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室,廣州市疾病與食品安全免疫學快速檢測重點實驗室,廣州510632)

凡納濱對蝦新過敏原烯醇化酶的鑒定

談思怡黃建芳孫一帆郭成斌向軍儉

(暨南大學抗體工程研究中心 暨南大學廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室,廣州市疾病與食品安全免疫學快速檢測重點實驗室,廣州510632)

[摘要]目的：鑒定凡納濱對蝦分子量為47 kD過敏原的性質。方法：采用丙酮沉淀法提取凡納濱對蝦總蛋白，通過SDS-PAGE、11例蝦過敏患者血清IgE的Western blot 分析凡納濱對蝦中過敏原組份，運用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜儀(Matrix-Assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS)鑒定凡納濱對蝦47 kD未知過敏原組分。結果：通過 SDS-PAGE電泳證明所提取的凡納濱對蝦總蛋白組分完全。Western blot 結果顯示，凡納濱對蝦至少有14種與陽性血清反應的組分，其中，55%的蝦過敏患者IgE與分子量為47 kD的蛋白分子發生特異性反應，質譜分析結果顯示47 kD蛋白為烯醇化酶。結論：烯醇化酶是凡納濱對蝦的一種新的過敏原。

[關鍵詞]凡納濱對蝦；過敏原；烯醇化酶；質譜；Western blot

食物過敏現象已經成為一個常見的公共衛生問題，據統計在發達國家食物過敏影響了大約2%成年人和8%兒童的日常生活甚至生命安全[1]。甲殼類食物作為糧食農業組織(Food and Agriculture Organization，FAO)/世界衛生組織(World Health Organization，WHO)認定的八大過敏食物之一[2]。在一些沿海國家例如中國、日本，因食用甲殼類食物而導致食物過敏的患者逐年增多[3]。

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是當今世界養殖產量最高的三大蝦類之一，是我國南方地區的主要養殖蝦種。由于其卡路里含量低，營養價值高而深受人們的喜愛[4]。因此，由其引起的食物過敏在我國也較為常見。1981年在蝦中確定了第一個過敏原，38～41 kD的原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)，是蝦中最主要的過敏原；其他已被證實的重要過敏原還包括40 kD的精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)、20 kD的肌球蛋白輕鏈(Myosin light chain,MLC)、20～22 kD的肌質鈣結合蛋白(Sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)及75 kD的血藍蛋白(Hemocyanin，Hc)；除此之外，一些次要過敏原如：21 kD的鈣肌蛋白C(Troponin C,Tn C)、28 kD的磷酸丙糖異構酶(Triose Phosphate isomerase,TIM)、225 kD的肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain，MHC)等也相繼被鑒定[5-7]。

在前期研究工作中，通過對蝦過敏患者血清樣本分析，我們發現除了已明確的幾個過敏原外，凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)中的47 kD蛋白組分也具有較高的血清IgE反應率，且顏色較深[8]。繼而，本研究旨在探討凡納濱對蝦中是否存在新的過敏原，為進一步豐富蝦過敏原組分的認識提供研究基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料新鮮凡納濱對蝦購自廣州黃沙水產市場；蛋白 Mr marker購自Thermo公司；PVDF膜購自Millipore公司；HRP 標記羊抗人IgE 二抗購自Bethly公司；化學發光底物試劑盒購自弗德生物；胰酶購自美國Promega 公司；垂直板型電泳儀、膜轉移系統、凝膠成像系統均購自Bio-Rad公司；低溫高速冷凍離心機購自Eppdof公司；4800 PLUS MALDI-TOF/TOF 質譜儀購自美國ABI公司。

1.2實驗方法

1.2.1凡納濱對蝦總蛋白的提取取新鮮的活蝦去頭去殼后取肌肉組織，用組織搗碎機搗碎。參照《變態反應學實驗技術》[9]中的方法，將搗碎的組織用50%預冷丙酮浸泡，4℃攪拌4 h，8 500 r/min離心15 min，收集沉淀。重復脫脂一次。沉淀物置于通風櫥室溫徹底風干后，浸入0.1 mol/L PBS(pH7.4)中，4℃攪拌1 h，靜置過夜，12 000 r/min 4℃離心20 min取上清；用BCA試劑盒測蛋白濃度，分裝后于-20℃儲存。

1.2.2血清來源蝦過敏患者血清5份來自暨南大學在校師生過敏患者， 6份來自廣東省婦幼保健醫院的蝦過敏患者，共11份。患者年齡1～40歲，其中男性6例，女性5例，陽性血清納入標準為患者有典型的食物過敏史，臨床確診為蝦過敏患者。陰性對照血清2份，男女志愿者等比例，年齡分別為26歲、22歲，納入標準為無家族過敏史，無食物過敏史。將采集的血液37℃靜置30 min后4℃靜置過夜，2 000 r/min 離心10 min，分裝后于-20℃儲存。

1.2.3SDS-PAGE電泳分析配置12%的分離膠，5%的濃縮膠；蝦蛋白樣品與上樣緩沖液1∶5混合，煮沸5～10 min變性，取適量樣品上樣。80 V，30 min恒壓使樣品在濃縮膠中壓縮成一條線，120 V恒壓電泳分離，以溴酚藍為指示，當其跑至終點后停止電泳。用考馬斯亮藍R-250染液染色2～4 h后，脫色液脫色至出現清晰的蛋白條帶。

1.2.4Western blot分析蝦蛋白粗提液經SDS-PAGE分離后，100 V恒壓，60 min 用Bio-Rad電轉移系統將凝膠中用的蛋白轉移至 PVDF 膜上，5%脫脂奶粉 37℃封閉2 h，PBST 洗滌三次，每次10 min。人血清用PBS-T 稀釋10倍，37℃ 孵育2 h，PBST洗滌三次，每次10 min。HRP標記羊抗人IgE 二抗(1∶1 000)37℃ 孵育1 h，PBST 洗滌三次，每次10 min。加入Ecl化學發光試劑，凝膠成像系統曝光后掃描保存結果。

1.2.5質譜鑒定與分析凡納濱蝦蛋白粗提液進行SDS-PAGE分離后考馬斯亮藍G-250染色、脫色，將目的蛋白條帶切成膠粒進行膠內蛋白質酶解，提取肽段用ABI4800 MALDI-TOF/TOF-MS串聯飛行時間質譜儀進行指紋圖譜(PMF)檢測，質譜操作采用正離子反射模式,質譜分析使用標準肽混合物作為外標校正，從一級質譜中選擇信噪比大于50的得分最高的前體離子做MS/MS分析，然后進行IPI數據庫搜索，搜索的參數設置如下：種類為蝦，切割酶 Trypsin， 允許最大漏切位點數(Missed cleavage)為 1，可變修飾為cysteine carboamido methylated和methionine oxidized，無固定修飾。MS 的誤差 100 ppm，MS/MS 的誤差為0.6 Da。得分超過53被認為超過閾值(P≤0.05)，為可信的鑒定結果。

2結果

2.1凡納濱對蝦總蛋白組分分析蝦蛋白粗提液按16 μg上樣的SDS-PAGE，結果如圖1所示，至少有14條明顯的蛋白條帶。其中分子量為20、38、40、75 kD分別為已知的過敏原肌質鈣結合蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶及血藍蛋白。

2.2Western blot鑒定過敏原組分過敏患者血清IgE與凡納濱對蝦蛋白粗提液進行Western blot，2 例無過敏史的健康人血清做陰性對照。結果顯示，除分子量為38 kD的原肌球蛋白、40 kD的精氨酸激酶及75 kD的血藍蛋白外，在11例過敏患者中，有6例患者血清IgE能與分子量為47 kD的蛋白分子發生特異性反應，反應率為 55%,且反應條帶明顯。說明分子量為47 kD蛋白是凡納濱對蝦的過敏原之一(圖2)。

圖1　凡納濱對蝦總蛋白SDS-PAGEFig.1　SDS-PAGE of proteins from Litopenaeus vannameiNote: M.Protein marker ；1.Litopenaeus vannamei.

表1匹配片段質譜分析結果

Tab.1MALDI-TOF/TOF results of matched peptides

ObservedMr(expt)Mr(calc)DeltaStartEndMissIonsPeptide2331.13452330.12722330.11080.01641210133-.LAMQEFMILPTGASSFTEAMR.M2331.13452330.12722330.11080.01641210--.LAMQEFMILPTGASSFTEAMR.M1769.02261768.01531767.87600.139422361-R.LVVCACYRLSVSDAR.N1782.90391781.89661781.78330.113337501-R.NCCIKFGSCCHLVK.-1230.71131229.70401229.69790.006126361-K.QTGLEQSVKIK.K2283.15012282.14282282.07360.06921461641-R.LSNEKAYQEINDTQEMIEK.I1895.03451894.02721893.88120.14611341491-R.SMLDEERMDALESQLK.E2331.13452330.12722330.21910.09192232431-K.IVLMHDIYATSADAAEEIIKK.L1895.03451894.02721893.90430.12302692850-R.ACYAVSVAVQNYHGIDK.D

圖2　凡納濱對蝦蛋白粗提液與患者血清 IgE的Western blot鑒定Fig.2　Identification of allergens in crude extracts by Western blotNote: M.Protein marker;1-2.Negative controls;3-8.Allergic patients′ serum.

2.3質譜鑒定分析結果凡納濱對蝦47kD過敏原經胰蛋白酶酶切后的肽段混合物進行MALDI-TOF/TOF-MS質譜分析，結果見圖3、表1。圖3A為該蛋白的一級質譜，從一級質譜圖中選擇強度較高的肽段進行串聯質譜分析，得到的MS/MS 圖譜經檢索，最終給出了Mowse分值(圖3B)。凡納濱對蝦47 kD過敏原與巖蝦屬的烯醇化酶高分值匹配。普庫索取號為gi:344049993，Mascot得分為142，覆蓋率達15%，等電點4.42。結果表明凡納濱對蝦47 kD過敏原為烯醇化酶。

3討論

烯醇化酶是催化2-磷酸-甘油酸失水而生成磷酸烯醇丙酮酸反應的酶，屬于糖酵解體系，在細胞能量代謝過程中起重要的作用。Nahm等人發現α-烯醇化酶作為體內自身抗原可以引起嚴重哮喘[10]。Nittner等人通過皮膚點刺實驗證明啤酒酵母中的主要過敏原為烯醇化酶，可誘發呼吸道過敏反應[11]；烯醇化酶被認為是一類高度保守的真菌過敏原[12,13]。Liu采用雙向結合質譜分析手段從武昌魚中鑒定出兩種新的過敏原即烯醇化酶和肌酸激酶[14]。近期德國學者也從鱈魚、鮭魚和金槍魚中確認魚烯醇化酶和醛縮酶是新的重要的魚過敏原。在魚類過敏診斷中IgE與烯醇化酶和醛縮酶特異結合，尤其是在小清蛋白缺乏時[15]。此外，烯醇化酶作為過敏原在德國小蠊中也被發現[16]。

圖3　凡納濱對蝦 47 kD過敏原蛋白的肽指紋圖譜Fig.3　Identification of shrimp allergen at 47 kD by mass spectrometrNote: A.Peptide mass finger print of suspected protein;B.Probability based mowse score.

在甲殼類過敏原研究中，有文章發現一蛋白點與磷酸丙酮酸水合酶和烯醇化酶兩種蛋白相匹配，兩種蛋白的相似度可達 99%，其中肽段198Gly-Lys221與40多個物種的烯醇化酶相匹配，可作為烯醇化酶的通用特征肽和磷酸丙酮酸水合酶的特征肽[17]，暗示烯醇化酶可能為一種過敏原。2014年泰國學者也通過質譜分析技術在墨吉明對蝦肌肉組織中發現了47 kD的烯醇化酶可能是一種未見報道的蝦過敏原[18]。

本研究從凡納濱對蝦中分離出能與蝦過敏患者血清反應的47 kD蛋白組分，通過蛋白組學質譜鑒定方法，證明凡納濱對蝦47 kD蛋白組分為烯醇化酶，這也肯定了國外學者的相關報道[18]。作為一種新的蝦過敏原，根據本實驗分析鑒定結果，約55% 蝦過敏患者IgE與烯醇化酶過敏原發生特異性反應，初步可以證明烯醇化酶是凡納濱對蝦過敏原之一。但受到樣本數量的限制，烯醇化酶是否為凡納濱對蝦的主要過敏原還有待進一步的驗證。本研究進一步豐富了對凡納濱對蝦過敏原組分的認識，為探尋新的蝦過敏原檢測試劑、及脫敏疫苗的研發提供重要實驗依據。

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[收稿2016-03-02修回2016-03-29]

(編輯許四平)

Identification of a new shrimp allergen enolase from Litopenaeus vannamei

TAN Si-Yi，HUANG Jian-Fang ，SUN Yi-Fan，GUO Cheng-Bin，XIANG Jun-Jian.

Antibody Engineering Research Center of Ji′nan University,Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering，Guangzhou Key Laboratory of Disease and Food Safety Rapid Test，Guangzhou 510632，China

[Abstract]Objective:To identify enolase,47 kD allergen,from Litopenaeus vannamei by Mass spectrometry.Methods: The proteins were extracted from Litopenaeus vannamei tissue with acetone precipitation method.The protein components were analyzed by SDS-PAGE and Western blot.By using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF-MS),the 47 kD allergen from Litopenaeus vannamei was identified as enolase.Results: By SDS-PAGE,we proved that the native protein components from Litopenaeus vannamei were completely.According to the Western blot result more than 14 components could react with the positive serum.MALDI-TOF/TOF analysis results showed that the suspected proteins were enolase.A sensitization frequency was 55%.Conclusion: Enolase was identified as a new allergen of Litopenaeus vannamei.

[Key words]Litopenaeus vannamei;Allergen;Enolase;Mass spectrometry;Western blot

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.008

作者簡介：談思怡(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤免疫及食物過敏原方面研究。 通訊作者及指導教師：向軍儉(1952年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事工程抗體及其應用和過敏原研究，E-mail:txjj@jnu.edu.cn。

中圖分類號R392.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0808-04