TWS119通過抑制STAT3磷酸化促進γδT細胞CCR5的表達①

徐　晶　孫蕾清　陳永強　鄭　璐　呂小婷　陳復興　劉軍權　周忠海

(解放軍第97醫院中心實驗室，徐州221004)

·生物治療·

TWS119通過抑制STAT3磷酸化促進γδT細胞CCR5的表達①

徐晶孫蕾清陳永強鄭璐呂小婷陳復興劉軍權周忠海

(解放軍第97醫院中心實驗室，徐州221004)

[摘要]目的：研究糖原合酶激酶-3β抑制劑4,6-二取代吡咯并嘧啶(TWS119)促進γδT細胞趨化因子受體CCR5表達的分子機制。方法：用TWS119誘導從健康人外周血中分離培養獲得γδT細胞48 h后，用流式細胞儀檢測γδT細胞CCR5的表達；Western blot檢測GAPDH和p-STAT3的表達。結果：培養10 d后的γδT細胞純度達到85.79%±5.01%。TWS119濃度在0～8.0 μmol/L范圍內能顯著促進趨化因子受體CCR5的表達，且劑量依賴性抑制STAT3的磷酸化。同時，用STAT3磷酸化抑制劑Stattic (0.5 μmol/L)預處理γδT細胞也可以促進CCR5的表達，并能協同增強TWS119促進趨化因子受體CCR5的表達。結論：TWS119通過抑制STAT3磷酸化促進γδT細胞CCR5的表達。

[關鍵詞]TWS119；CCR5；γδT細胞；STAT3

4,6-二取代吡咯并嘧啶(TWS119)是糖原合酶激酶-3β (Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)抑制劑，具有調節細胞增殖、分化和凋亡等生物學效應[1,2]。近年來研究發現TWS119體外可以誘導培養獲得記憶性干細胞樣T細胞(Memory stem cell-like T cell,TSCM)和早期分化細胞，這群細胞體內具有較強抗腫瘤活性，跟其在體內具有較強的增殖、分化能力及歸巢黏附分子與趨化因子受體的表達有關[3,4]。我們研究發現TWS119體外可促進NK細胞和γδT細胞與歸巢相關分子CD62L的表達[5,6]。CCR5 為趨化因子CC受體家族成員，對單核/巨噬細胞、T淋巴細胞和NK細胞等均有較強的趨化、募集和免疫過程[7,8]。因此，本研究想探討TWS119能否促進γδT細胞趨化因子受體CCR5的表達及其分子機制，旨在為臨床治療獲得向腫瘤組織高趨向性的γδT細胞。

1材料與方法

1.1材料TWS119購自Sigma公司；STAT3抑制劑Stattic購自Selleck Chemicals[實驗時用二甲亞砜(DMSO)溶解，實驗組DMSO終體積分數≤0.1%，對照組中加入相同濃度的DMSO]；RPMI1640和小牛血清購自Gibco 公司；Western及IP細胞裂解液試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、Western及IP細胞裂解液、PVDF膜和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；兔抗人p-STAT3、GAPDH一抗和堿性磷酸酶標記抗兔二抗購自Bioworld 公司；人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；重組人白細胞介素-2(rhIL-2)和唑來磷酸購自諾華制藥公司；熒光抗體FITC-γδTCR和PE-CCR5購自eBioscience；人AB型血漿購自徐州市中心血站。

1.2方法

1.2.1γδT細胞的培養與鑒定從健康人抽取外周血15 ml，用淋巴細胞分離液分離人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)。用生理鹽水洗滌后，將PBMCs加入γδT細胞培養基(含10%小牛血清、5% AB血清、5 μmol/L唑來磷酸和300 U/ml rhIL- 2)中，于37℃、5%CO2培養箱中培養并定期補加培養基。將培養10 d的γδT細胞用倒置顯微鏡觀察形態，用FITC-γδTCR 抗體標記γδT細胞后，流式細胞儀鑒定γδT細胞純度。

1.2.2流式細胞儀檢測TWS119對γδT細胞CCR5表達的影響將γδT細胞懸液，接種于6孔培養板，3.0×105/3 ml/孔，然后加入TWS119(終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L)或Stattic (0.5 μmol/L)。置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h后，收集細胞并用PBS洗滌1次，分別向每管細胞中加入10 μl的anti-γδTCR-FITC和anti-CCR5-PE，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后，重懸于0.5 ml的PBS溶液中，用流式細胞儀檢測γδT細胞表面CCR5的表達，試驗重復3次。

1.2.3Western blot分析蛋白的表達將經不同濃度TWS119或Stattic (0.5 μmol/L)處理48 h的γδT細胞，收集后用Western及IP細胞裂解液50 μl充分裂解提取蛋白，BCA法測樣品蛋白濃度后用8% SDS-PAGE分離，然后將蛋白轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶500)4℃封閉過夜，二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。然后用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，按照操作手冊進行顯色。結果用數碼相機進行拍照記錄，試驗重復3次。

2結果

2.1γδT細胞鑒定將分離獲得人外周血單個核細胞，用γδT細胞完全培養基于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，2 d后γδT細胞開始增殖，到第10天后出現許多大小不同的細胞集落，細胞成梭形(圖1A、B)。用流式細胞儀鑒定結果：γδT細胞比率為(85.79±5.01)% 如圖1C。以上結果提示γδT 細胞培養成功，可用于后續實驗。

2.2TWS119促進γδT細胞趨化因子受體CCR5的表達CCR5是表達于γδT淋巴細胞表面的主要趨化因子受體蛋白之一，介導 CCR5+γδT細胞的趨化、募集和免疫過程。本實驗研究結果如圖2顯示，TWS119作用γδT細胞48 h后，能顯著促進γδT細胞表面CCR5受體的表達，且具有劑量依賴性(P<0.05,P<0.01)。

2.3TWS119對γδT細胞中p-STAT3蛋白表達的影響將不同濃度TWS119培養的γδT細胞經Western blot 檢測結果顯示，隨著 TWS119 濃度增加，γδT細胞內p-STAT3表達量逐漸減少，即TWS119能抑制STAT3磷酸化，且具有一定的劑量依賴性(圖3)。

圖1　γδT細胞鑒定Fig.1　Identification of γδT cells

圖2　TWS119對γδT細胞CCR5表達的影響Fig.2　Effect of TWS119 on expression of CCR5 in γδT cellsNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

圖3　TWS119對γδT細胞中p-STAT3蛋白表達的影響Fig.3　Western blot analysis of p-STAT3 expression in γδT cells

圖4　STAT3抑制劑Stattic對γδT細胞CCR5表達的影響Fig.4　Effect of Stattic on expression of CCR5 in γδT cells

2.4STAT3抑制劑Stattic對γδT細胞CCR5表達的影響為了驗證TWS119通過抑制STAT3磷酸化來促進γδT細胞CCR5的表達，我們用TWS119和STAT3特異性抑制劑Stattic分別和聯合作用γδT細胞48 h后，蛋白水平檢測結果顯示， 2.0 μmol/L的TWS119和0.5 μmol/L的Stattic能明顯抑制p-STAT3的表達，而且兩者聯合作用時具有一定的疊加或協同抑制作用(圖4A)。流式細胞儀檢測γδT細胞CCR5表達結果顯示，STAT3特異性抑制劑Stattic能顯著提高γδT細胞CCR5表達，對照組CCR5陽性表達率為(35.89±2.52)%，TWS119(2.0 μmol/L) 組為(61.14±2.98)%， Stattic(0.5 μmol/L) 組為(47.27±1.84)%；Stattic與TWS119聯合組CCR5陽性表達率為(75.31±3.08)%，提示TWS119通過抑制STAT3磷酸化來促進γδT細胞CCR5表達，可能其他信號通路也有一定的參與(圖4B)。

3討論

趨化因子屬于細胞因子超家族的一類小分子物質，主要由白細胞分泌，通過與靶細胞膜上相應的受體結合而發揮生物學作用。CCR5 為趨化因子 CC 受體家族成員，屬于G蛋白偶聯受體，CCR5 可以在多種細胞上表達，如NK 細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞和T淋巴細胞等，與其配體 CCL3 ( MIP-1α) 、CCL4 ( MIP-1β) 和CCL5( RANTES)結合后，可激活膜內G 蛋白，并引起胞內Ca2+濃度上升及蛋白激酶C的活化，從而表現出白細胞的趨化性及炎癥反應等各種生理功能[7,8]。γδT細胞是T淋巴細胞中表達γδTCR的一個亞群，研究人員發現體外擴增的 γδT 細胞表面趨化因子受體 CCR5表達顯著高于αβT 細胞，這可能與其在機體內抗感染、抗腫瘤和免疫監視等方面起重要作用有關[9,10]。本研究中發現TWS119能顯著促進γδT細胞趨化因子受體CCR5的表達，且具有劑量依賴性，提示用TWS119誘導培養的γδT細胞回輸到體內后可能具有更好的腫瘤組織趨向性。另外，γδT細胞還具有抗原提呈功能，荷載腫瘤抗原的γδT細胞高表達CCR5可能會增強其誘發機體適應性抗腫瘤免疫能力，為γδT細胞腫瘤疫苗的臨床應用提供支持[11]。

STAT3是信號轉導與轉錄活化因子(Signal transducers and activators of transcription，STAT)家族的重要成員，存在于細胞漿與酪氨酸磷酸化信號通道偶聯的雙功能蛋白，在胞外信號的刺激下可激活STAT3即STAT3磷酸化，之后發生二聚化進入胞核，識別并結合于特定的DNA啟動子序列，激活靶基因的轉錄，從而調控細胞的增殖、分化和凋亡等過程[12,13]。我們實驗中發現TWS119能抑制γδT細胞中STAT3蛋白的磷酸化。為了研究STAT3信號通路與CCR5表達之間的關系。我們分別用2.0 μmol/L 的TWS119和0.5 μmol/L的 STAT3抑制劑Stattic單獨和聯合處理γδT細胞48h后結果發現，它們均能抑制STAT3蛋白的磷酸化的同時并能促進CCR5表達，兩者聯合時結果具有一定的疊加或協同作用，提示STAT3信號通路參與γδT細胞CCR5的表達。

本研究結論是用TWS119體外培養γδT細胞時通過抑制STAT3的磷酸化信號通路來促進趨化因

子受體CCR5的表達。為體外擴增在體內具有腫瘤組織趨向性的CCR5+γδT細胞提供準確的作用靶點和一定的實驗依據。

參考文獻：

[1]Ding S,Wu TY,Brinker A,etal.Synthetic small molecules that control stem cell fate[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(13):7632-7637.

[2]Gattinoni L,Ji Y,Restifo NP.Wnt/beta-catenin signaling in T-cell immunity and cancer immunotherapy[J].Clin Cancer Res,2010,16(19):4695-4701.

[3]Gattinoni L,Lugli E,Ji Y,etal.A human memory T cell subset with stem cell-like properties[J].Nat Med,2011,17(10):1290-1297.

[4]Forget MA,Huon Y,Reuben A,etal.Stimulation of Wnt/β-catenin pathway in human CD8+T lymphocytes from blood and lung tumors leads to a shared young/memory phenotype[J].PLoS One,2012,7(7):e41074.

[5]陳永強,鄭璐,劉軍權,等.糖原合酶激酶3β抑制劑TWS119對γδT細胞增殖及表型的影響[J].中國免疫學雜志,2015,31(6):748-752.

[6]陳永強,鄭璐,劉軍權,等.糖原合酶激酶3β抑制劑TWS119激活NK細胞Wnt /β-catenin信號通路促進CD62L表達[J].細胞與分子免疫學雜志,2015,35(1):44-48.

[7]Griffith JW,Sokol CL,Luster AD.Chemokines and chemokine receptors:positioning cells for host defense and immunity[J].Annu Rev Immunol,2014,32:659-702.

[8]González-Martín A,Gómez L,Lustgarten J,etal.Maximal T cell-mediated antitumor responses rely upon CCR5 expression in both CD4(+) and CD8(+) T cells[J].Cancer Res,2011,71(16):5455-5466.

[9]康寧,殷珊珊,湯龍,等.體外擴增γδ T 細胞的腫瘤組織趨向性[J].基礎醫學與臨床,2011,31(11):1210-1216.

[10]Vantourout P,Hayday A.Six-of-the-best:unique contributions of γδ T cells to immunology[J].Nat Rev Immunol,2013,13(2):88-100.

[11]Khan MW,Eberl M,Moser B.Potential use of γδ T cell-based vaccines in cancer immunotherapy[J].Front Immunol,2014,5:512.

[12]Kane A,Deenick EK,Ma CS,etal.STAT3 is a central regulator of lymphocyte differentiation and function[J].Curr Opin Immunol,2014,28:49-57.

[13]Herrmann A,Kortylewski M,Kujawski M,etal.Targeting Stat3 in the myeloid compartment drastically improves the in vivo antitumor functions of adoptively transferred T cells[J].Cancer Res,2010,70:7455-7464.

[收稿2016-01-13修回2016-03-23]

(編輯張曉舟)

TWS119 upregulates CCR5 expression of γδT cells by inhibiting STAT3 phosphorylation

XU Jing,SUN Lei-Qing,CHEN Yong-Qiang,ZHENG Lu,LV Xiao-Ting,CHEN Fu-Xing,LIU Jun-Quan,ZHOU Zhong-Hai.

Department of Central Laboratory,97th Hospital of PLA,Xuzhou 221004,China

[Abstract]Objective:To investigate the mechanisms of TWS119 induced CCR5 expression in hunman γδT cells.Methods: After treatment with various concentrations of TWS119 for 48h,the expression of CCR5 in γδT cells were detected by flow cytometry.The p-STAT3 and GAPDH expression were examined by Western blot analysis.Results: TWS119 could upregulate the expression of CCR5 in dose dependent manner.Western blot analysis revealed that TWS119 inhibit phosphorylation of STAT3,but had no significant impact on GAPDH.In addition,pretreatment of γδT cells with 0.5 μmol/L STAT3 specific phosphorylation inhibitor Stattic could upregulate the expression of CCR5 and enhance the TWS119 induced CCR5 expression.Conclusion: TWS119 could upregulate CCR5 expression of γδT cells by inhibiting STAT3 phosphorylation in vitro.

[Key words]TWS119;CCR5;γδT cells;STAT3

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.012

作者簡介：徐晶(1990年-)，女，技師，主要從事分子免疫學方面的研究，E-mail:920213370@qq.com。 通訊作者及指導教師：鄭璐(1985年-)，女，主管技師，主要從事分子免疫學方面研究，E-mail:xsdzhenglu@163.com。 周忠海(1973年-)，男，副主任醫師，主要從事腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail:zhouzhonghai298@aliyun.com。

中圖分類號R392.12Q253

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0825-04

①本文受南京軍區醫學科技創新研究基金(14MS032) 資助。