乳腺癌異常表達B7-H4對T細胞分泌細胞因子和凋亡的影響①

沈依帆　黃文煉　徐　曼　蘇新良　王　欣　汪　濤

(重慶醫科大學基礎醫學院病理教研室，分子醫學與腫瘤研究中心，重慶400016)

乳腺癌異常表達B7-H4對T細胞分泌細胞因子和凋亡的影響①

沈依帆黃文煉徐曼蘇新良②王欣汪濤

(重慶醫科大學基礎醫學院病理教研室，分子醫學與腫瘤研究中心，重慶400016)

[摘要]目的：探討B7-H4在乳腺癌中的表達及其對外周血T細胞分泌細胞因子及增殖、凋亡的影響。方法：應用S-P免疫組化法檢測B7-H4在乳腺浸潤性癌、癌旁組織和纖維腺瘤的表達。流式細胞術分析B7-H4對乳腺癌患者外周血活化T細胞增殖和凋亡的作用。ELISA芯片檢測T細胞培養上清液細胞因子的含量。結果：B7-H4在乳腺浸潤性癌的陽性表達率為84.62%(44/52)，顯著高于癌旁組織和纖維腺瘤組織(P<0.01，P<0.01 )。體外淋巴細胞混合培養結果顯示， 與空白組比較，B7-H4對乳腺癌患者外周血活化T細胞的增殖指數Ki67無明顯影響；但B7-H4誘導CD8+T細胞凋亡的作用強于CD4+T 細胞。B7-H4組FOXP3+T/CD4+T也高于空白組(P<0.05 )。B7-H4組較空白組細胞培養上清液中TGF-β1、IL-17含量均顯著增高 (P<0.05，P<0.05)。結論：乳腺浸潤性癌異常表達B7-H4。B7-H4在體外能促進CD8+T細胞凋亡、促進T細胞分泌TGF-β1 和IL-17。B7-H4在削弱乳腺癌微環境的抗腫瘤細胞免疫中發揮一定作用。

[關鍵詞]B7-H4；乳腺癌；CD8+T細胞；細胞凋亡；TGF-β1；IL-17

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其在我國的發病率和死亡率呈逐年上升趨勢[1]。近年的研究表明，腫瘤微環境的抗腫瘤免疫抑制與負性共刺激分子B7家族成員表達上調，調節性T細胞(Tregs)的募集以及 轉化生長因子-β(TGF-β )表達上調等因素有關[2]。負性共刺激分子B7家族成員包括B7-H1、B7-DC、B7-H4，它們能抑制T細胞活化、增殖從而負向調節T細胞免疫應答[3-5]。B7-H4在體內有兩種存在形式，一種為細胞膜蛋白，另一種為血清中的可溶性蛋白。B7-H4蛋白僅低水平表達于幾種正常組織，但在多種惡性腫瘤如肺癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和腎細胞癌中異常表達[6，7]。研究表明B7-H4過度表達與腫瘤微環境的免疫抑制及患者預后差有關[7-9]。血清的可溶性B7-H4水平與腫瘤分級、患者預后差以及腫瘤病理類型相關[10]。腫瘤微環境中抑制性細胞因子水平增高也是導致腫瘤免疫逃逸的原因之一[11，12]。腫瘤局部高水平的TGF-β可抑制或改變天然和獲得性免疫細胞(包括NK細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、CD4+T和CD8+T細胞)的活化、成熟及分化[13，14]，從而有助于腫瘤細胞逃避患者體內的免疫監視[15]。白介素能促進腫瘤生長與轉移，以IL-17最為典型，它可通過招募髓源性抑制細胞(MDSCs)到腫瘤局部抑制抗腫瘤免疫 從而促進腫瘤的生長[16]。為了探討B7-H4在浸潤性乳腺癌的表達及其對乳癌患者外周血T淋巴細胞的作用，本實驗采用免疫組化法觀察了B7-H4在乳腺癌組織中的表達，流式細胞術和ELISA芯片檢測了B7-H4對乳腺癌患者外周血T淋巴細胞的增殖、凋亡及細胞因子分泌情況的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料來源52例乳腺浸潤性癌患者及10例乳腺纖維腺瘤的手術切除標本，均取自2012年～2014年重慶醫科大學附屬第一醫院病理科，術前未行放療或化療。患者年齡30～76歲，平均(50.1±11.6歲)。10例乳腺癌患者外周血10～15 ml，由重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科收治的患者知情捐贈。

1.1.2實驗試劑兔抗人B7-H4購自北京博奧森生物公司；重組人B7-H4蛋白購自美國R&D公司；人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；尼龍毛購自德國KISKER公司；Annexin V-PE/7-ADD細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；ELISA定量抗體芯片購自廣州RayBiotech公司；鼠抗人Ki67-PE、抗人CD4-FITC、抗人CD8-FITC、抗人CD3-PE、抗人CD8-PE、抗人CD25-TRITC、抗人FOXP3-PE均購自美國eBioscience 公司。

1.2實驗方法

1.2.1S-P免疫組化染色及結果判斷石蠟切片常規脫蠟水化，檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)微波抗原修復，內源性過氧化物酶阻斷10 min，經10%正常山羊血清封閉30 min后，加B7-H4(1∶100)4℃孵育過夜，37℃復溫30 min后加二抗孵育30 min，鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶孵育30 min，DAB顯色、蘇木素復染后樹膠封片。以PBS代替一抗為陰性對照。結果判斷：B7-H4在胞膜、胞漿染色。細胞染色比例：無陽性細胞為0 分，陽性細胞數<10%為1 分，11%～50%為2 分，51%～75%為3 分，>75%為4 分；細胞染色強度：無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。兩項得分相乘結果>3 分為陽性表達病例，≤3 分為陰性表達病例。

1.2.2分離外周血T細胞與重組B7-H4蛋白共培養將乳癌患者的新鮮抗凝外周血用人淋巴細胞分離液梯度離心后獲得單個核細胞,再經尼龍毛柱分離T細胞，將T細胞加入RPMI1640 (含10% 小牛血清)和PHA (5～10 μg/ml )于37℃、5% CO2孵箱內培養48 h后，流式細胞術檢測T細胞增殖、凋亡和FOXP3+T/CD4+T細胞。

1.2.2.1 FCM檢測T細胞增殖指數分別收集B7-H4組和空白對照組外周血活化T細胞，將抗CD4-FITC或抗CD8-FITC與抗Ki67-PE室溫孵育15 min后，檢測CD4+T或 CD8+T細胞Ki67陽性率。

1.2.2.2FCM檢測T細胞凋亡B7-H4組和空白對照組T細胞， 避光滴加Annexin V-PE/7-AAD及抗人CD4-FITC和(或)抗人CD8-PE(FITC)、抗人CD3-PE抗體孵育20 min 后，PBS 緩沖液洗2次，5 min/次，流式細胞儀檢測。

1.2.2.3FCM檢測CD25+FOXP3+T/CD4+T細胞B7-H4組和空白對照T細胞， 避光滴加抗人CD25-TRITC、抗人FOXP3-PE、抗人CD4-FITC抗體孵育20 min后，PBS緩沖液洗3次后，流式細胞儀檢測CD4+T細胞和CD4+CD25+FOXP3+T細胞比例。

1.2.2.4ELISA芯片檢測細胞因子含量收集上述各組細胞培養48 h后的上清液,按說明書將每張芯片內加入200 μl T細胞培養上清液，室溫搖床孵育2 h； 加入洗液200 μl洗液Ⅰ搖床震蕩清洗3次，每次5 min;再用200 μl洗液Ⅱ 搖床震蕩清洗2次，每次5 min；棄去洗液后加入生物素標記的細胞因子抗體室溫搖床孵育2 h,如前清洗后與檢測液C和D的混合液500 μl室溫震蕩2 min后放入蛋白芯片檢測儀進行分析。

2結果

2.1B7-H4在乳腺浸潤性癌、癌旁組織和纖維腺瘤的表達乳腺纖維腺瘤、乳腺癌旁組織中，B7-H4在腺泡細胞的頂部和末梢導管上皮呈陰性或弱陽性表達，陽性率分別為20% (2/10) 和30%(3/10) 。在乳腺浸潤性癌癌細胞胞漿和胞膜的陽性表達率為84.62%(44/52)，顯著高于癌旁組織和纖維腺瘤組織(P<0.01，P<0.01 )；而乳腺纖維腺瘤和癌旁組織的表達無明顯差異(P>0.05 )(表1，圖1)。

2.2重組B7-H4對乳腺癌患者外周血T細胞增殖的影響重組B7-H4與乳腺癌患者外周血活化T淋巴細胞混合培養48 h后，流式細胞術檢測結果顯示乳腺癌患者B7-H4組CD4+T和CD8+T細胞的Ki67指數分別為(16.08±3.24%)和(9.81±1.58%) ，而空白對照組為(15.04±2.32%)和(11.24±2.72%)，兩組間無明顯差別(P>0.05，P>0.05) (圖2)。

表1B7-H4在乳腺浸潤性癌、癌旁組織和纖維腺瘤的表達

Tab.1B7-H4 expression in breast carcinomas, peri-carcinoma tissues and fibroadenomas

GroupsnB7-H4expression-+(%)χ2PBreastcarcinomas52844(84.62%)15.0701)0.0001)Pericarcinomatissues1073(30.00%)10.8252)0.0012)Fibroadenomas1082(20.00%)0.0003)1.0003)

Note：1)breast carcinomas and fibroadenomas; 2)breast carcinomas and peri-carcinoma tissues;3)peri-carcinoma tissues and fibroadenomas.

圖1　B7-H4在乳腺浸潤性癌、癌旁組織和纖維腺瘤的表達Fig.1　B7-H4 expression in breast carcinomas,pericarci-noma tissues and fibroadenomasNote: A.Positive B7-H4 expression in breast carcinoma(IHC,×400);B.Weak B7-H4 expression in epithelium of peri-carcinoma tissue(IHC,×400);C.Negative B7-H4 expression in fibroadenoma(IHC,×100 ).

圖2　混合培養T淋巴細胞的Ki67指數Fig.2　Ki67 positive rates of co-cultured T cells

2.3重組B7-H4對乳腺癌患者外周血T細胞凋亡的影響重組B7-H4與乳腺癌患者外周血活化T淋巴細胞混合培養48 h后，總T細胞凋亡率較空白組增高，分別是(17.6± 3.39)%和(14.8± 3.98)%。進一步分析發現B7-H4組和空白組CD8+T細胞凋亡率分別為(21.3±2.24)%和(10.2±1.36)%，兩組間差異顯著(P<0.05)，而B7-H4組CD4+T細胞的凋亡率較空白組低，凋亡率分別為(10.3±2.45)%和(13.1±2.37)%，但兩組間無統計學差異(P>0.05) (圖3)。

2.4重組B7-H4對乳癌患者FOXP3+T細胞的影響重組B7-H4與乳腺腺癌患者外周血T淋巴細胞混合培養48 h后，CD25+FOXP3+T細胞在CD4+T細胞中所占的比例明顯高于空白對照組，分別為(52.07±5.48)%和(4.12±1.25)%(P<0.05) (圖4)。

2.5重組B7-H4對T細胞分泌細胞因子的影響重組B7-H4與乳腺癌患者外周血活化T細胞混合培養48 h后，定量ELISA芯片檢測到培養上清液中GM-CSF、IL-1β 、IL-6、IL-17F和IL-23的含量與空白對照組無明顯差異；但B7-H4組和空白組TGF-β1的含量分別為1 194.17±165.21和588.57±146.20；IL-17的含量分別為1 122.40± 221.79及555.17± 108.42。B7-H4組TGF-β1 和IL-17均顯著高于空白組(P<0.05，P<0.05)(圖5)。

圖3　乳腺癌患者外周血T淋巴細胞凋亡Fig.3　Apoptosis of peripheral blood T lymphocytes for breast cancer patient

圖4　B7-H4混合培養T細胞中的CD25+FOXP3+T細胞Fig.4　CD25+FOXP3+T cells in co-cultured T cells with B7-H4

圖5　T淋巴細胞培養上清液TGF-β1和IL-17含量Fig.5　Concentration of TGF-β1 and IL-17 in supernatant of cultured T lymphocytes

3討論

本實驗觀察到B7-H4在84.62% 的乳腺浸潤性癌細胞異常高表達，在癌旁組織及乳腺纖維腺瘤中無表達或微弱表達。因腫瘤細胞的跨膜B7-H4蛋白不穩定且可被誘導生成，文獻也報道腫瘤患者血清中可溶性B7-H4蛋白的水平與預后差有關[10]，因而我們將重組人B7-H4蛋白與乳腺浸潤性癌患者外周血經PHA活化的T淋巴細胞混合培養，流式細胞術觀察到B7-H4組和空白對照組CD4+T、CD8+T細胞Ki67指數無明顯差別，提示B7-H4抑制T 細胞增殖的影響作用不明顯。Kristensen等[17]在對正常小鼠腸系膜淋巴結T細胞的研究也發現B7-H4對T細胞增殖無抑制作用；然而Wang等人發現B7-H4蛋白能抑制鼠CD4+T和CD8+T細胞的增殖，通過干擾ERK、P38、JNK蛋白激酶的活性以及T細胞的AKT通路[18]，我們考慮出現上述差異性結果可能與B7-H4蛋白和T細胞的種系來源不同有關。在分析CD8+T和CD4+T細胞亞群的凋亡率時，我們發現B7-H4對乳腺癌患者CD8+T細胞有明顯的促凋亡作用，但對CD4+T 細胞作用較小。CD4+T和CD8+T細胞是T細胞的兩個重要亞群，CD8+T細胞作為抗腫瘤效應細胞，其數量和功能決定著宿主腫瘤局部的抗腫瘤免疫水平。本研究結果證實B7-H4促進CD8+T細胞凋亡，從而削弱了CD8+T細胞在腫瘤微環境的抗腫瘤作用。

FOXP3+Tregs 是重要的負性免疫調節細胞，通過與細胞直接接觸或分泌TGF-β1及IL-10等抑制性細胞因子而抑制免疫細胞功能[19]，是影響乳腺癌患者預后的獨立因子[20]。本實驗采用流式細胞術分析了B7-H4對乳腺癌患者外周血FOXP3+T/CD4+T 的影響，結果顯示B7-H4組FOXP3+T/CD4+T 顯著高于空白組，結合前期發現B7-H4組CD4+T細胞的Ki67指數略高于空白對照組，但凋亡率反而較空白對照組低，我們推測B7-H4可能直接或間接刺激Treg細胞增殖或抑制其凋亡，從而導致乳腺癌患者體內的CD4+CD25+Treg細胞增多。Kristensen等也發現B7-H4融合蛋白可增加小鼠體內Tregs的功能活性[17]。

因T細胞分泌的細胞因子可反映其免疫活性，我們用定量ELISA芯片檢測與B7-H4共培養的乳腺浸潤癌患者外周血T細胞上清液的細胞因子含量，發現B7-H4組T細胞分泌TGF-β1和IL-17的量明顯高于空白對照組。雖然TGF-β1和IL-17在腫瘤發生發展過程發揮的作用尚有爭議，但眾多研究結果支持兩者是免疫抑制細胞因子。TGF-β1不僅在誘導Tregs細胞分化過程中起重要作用[21]，還通過減少腫瘤微環境CD8+T、CD4+T和DCs浸潤數量、促進血管生成來抑制免疫應答，最終促進腫瘤進展[2]。IL-17 可以上調單核細胞表面的共抑制分子B7-H1 從而抑制抗腫瘤細胞毒T細胞應答[21]，也可通過招募髓源性抑制細胞到腫瘤局部發揮免疫抑制作用，從而間接促進腫瘤生長[16]。

總之，我們的研究結果表明B7-H4在乳腺浸潤性癌中異常高表達，并可促進CD8+T細胞凋亡，誘導T細胞分泌免疫抑制細胞因子TGF-β1和IL-17。B7-H4在抑制乳腺癌微環境的抗腫瘤免疫應答中發揮重要作用，有可能成為新的抗腫瘤治療靶點。

參考文獻：

[1]鄭瑩,吳春曉,張敏璐.乳腺癌在中國的流行狀況和疾病特征[J].中國癌癥雜志,2013,23(8):561-569.

[2]Du C,Wang YZ.The immunoregulatory mechanisms of carcinoma for its survival and development[J].J Exp Clin Cancer Res,2011,30:1-12.

[3]Lu B,Chen L,Liu L,etal.T-cell-mediated tumor immune surveillance and expression of B7 co-inhibitory molecules in cancers of the upper gastrointestinal tract[J].Immunol Res,2011,50(2-3):269-275.

[4]Kryczek I,Wei S,Zhu G,etal.Relationship between B7-H4,regulatory T cells,and patient outcome in human ovarian carcinoma[J].Cancer Res,2007,67(18):8900-8905.

[5]Miyatake T,Tringler B,Liu W,etal.B7-H4(DD-O1l0) is overexpressed in high risk uterine endometrioid adenocarcinomas and inversely correlated with tumor T-cell infiltration[J].Gynecol Oncol,2007,106(1):119-127.

[6]Salceda S,Tang T,Kmet M,etal.The immunomodulatory protein B7-H4 is overexpressed in breast and ovarian cancers and promotes epithelial cell transformation[J].Exp Cell Res,2005,306(1):128-141.

[7]Arigami T,Uenosono Y,Ishigami S,etal.Clinical significance of the B7-H4 coregulatory molecule as a novel prognostic marker in gastric cancer[J].World J Surg,2011,35(9):2051-2057.

[8]Chen LJ,Sun J,Wu HY,etal.B7-H4 expression associates with cancer progression and predicts patient′s survival in human esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer Immunol Immunother,2011,60(7):1047-1055.

[9]Liu W,Shibata K,Koya Y,etal.B7-H4 overexpression correlates with a poor prognosis for cervical cancer patients[J].Mol Clin Oncol,2014,2(2):219-225.

[10]He C,Qiao H,Jiang H,etal.The inhibitory role of b7-h4 in antitumor immunity:association with cancer progression and survival[J].Clin Dev Immunol,2011,2011:1-8.

[11]Manjili MH,Egilmez N,Knutson KL,etal.Tumor escape and progression under immune pressure[J].Clin Dev Immunol,2012,2012:1-2.

[12]Hchst B,Diehl L.Antigen shedding into the circulation contributes to tumor immune escape[J].Oncoimmunology,2012,1(9):1620-1622.

[13]Li MO,Flavell RA.TGF-beta,T-cell tolerance and immunotherapy of autoimmune diseases and cancer[J].Expert Rev Clin Immunol,2006,2(2):257-265.

[14]Wrzesinski SH,Wan YY,Flavell RA.Transforming growth factor-beta and the immune response:implications for anticancer therapy[J].Clin Cancer Res,2007,13(18 Pt 1):5262-5270.

[15]Wojtowicz-Praga S.Reversal of tumor-induced immunosuppression by TGF-beta inhibitors[J].Invest New Drugs,2003,21(1):21-32.

[16]He D,Li H,Yusuf N,etal.IL-17 promotes tumor development through the induction of tumor promoting microenvironments at tumor sites and myeloid-derived suppressor cells[J].J Immunol,2010,184(5):2281-2288.

[17]Kristensen NN,Schmidt EG,Rasmussen S,etal.B7-H4-Ig treatment of normal mice changes lymphocyte homeostasis and increases the potential of regulatory T cells[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2013,35(4):505-513.

[18]Wang X,Hao J,Metzger DL,etal.B7-H4 treatment of T cells inhibits ERK,JNK,p38,and AKT activation[J].PLoS One,2012,7(1):e28232.

[19]Strauss L,Bergmann C,Szczepanski M,etal.A unique subset of CD4+CD25highFoxp3+T cells secreting interleukin-10 and transforming growth factor-beta1 mediates suppression in the tumor microenvironment[J].Clin Cancer Res,2007,13(15 Pt 1):4345-4354.

[20]Andrea Merlo,Patrizia Casalini,Maria Luisa Carcangiu,etal.FOXP3 expression and overall survival in breast cancer[J].J Clin Oncol,2009,27(11):1746-1752.

[21]Li YQ,Liu FF,Zhang XM,etal.Tumor secretion of CCL22 activates intratumoral Treg infiltration and is independent prognostic predictor of breast cancer[J].PLoS One,2013,8(10):e76379.

[21]Zhao Q,Xiao X,Wu Y,etal.Interleukin-17-educated monocytes suppress cytotoxic T-cell function through B7-H1 in hepatocellular carcinoma patients[J].Eur J Immunol,2011,41(8):2314-2322.

[收稿2015-09-22]

(編輯張曉舟)

B7-H4 expression in human breast carcinoma and its role on cytokine secretion and apoptosis of peripheral blood T cells

SHEN Yi-Fan,HUANG Wen-Lian,XU Man,SU Xin-Liang,WANG Tao.

Department of Pathology,Molecular Medicine and Tumor Research Center of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

[Abstract]Objective:To explore B7-H4 expression in human invasive breast carcinomas and study the effect of recombinant human B7-H4 protein on the active peripheral blood T lymphocytes of the patients in vitro.Methods: B7-H4 expression was detected in 52 cases of breast cancer with immunohistochemistry staining.After the activated peripheral blood T lymphocytes of breast cancer patients were co-cultured with B7-H4,the proliferation,apoptosis and cell subtypes were tested by FCM,and the concentration of cytokines in the supernatant were detected by ELISA microarray.Results: B7-H4 was expressed in 84.62% (44/52) of invasive breast cancers,with the positive rates significantly higher than that of fibroadenomas and the adjacent tissues of breast cancers(P<0.01，P<0.01).There were no significant differences of Ki67 positive rates of T cells between B7-H4 groups and blank groups;however,B7-H4 played stronger role in promoting apoptosis of CD8+T cells than that of CD4+T cells.The rate of FOXP3+T/CD4+T cells in B7-H4 groups were higher than that of blank groups(P<0.05).The concentration of TGF-β1 and IL-17 in the supernatant of B7-H4 co-cultured T cells were significantly higher than that of blank groups(P<0.05，P<0.05) .Conclusion: B7-H4 overexpresses in invasive breast carcinomas.In vitro，B7-H4 promotes apoptosis of CD8+T cells,and the secretion of IL-17 and TGF-β1 by T cells .B7-H4 plays a role in weakening anti-tumor T cell immune response of the breast cancer microenviroment.

[Key words]B7-H4；Breast carcinoma；CD8+T;Apoptosis；TGF-β1；IL-17

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.021

作者簡介：沈依帆(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤病理與腫瘤免疫學研究，E-mail：shenyifan1990@126.com。 通訊作者及指導教師：徐曼(1964年-)，女，教授，碩士生導師，主要從事腫瘤病理與腫瘤免疫學研究，E-mail：2402316007@qq.com。

中圖分類號R737.9

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0867-05

①本文為重慶市自然科學基金(CSTC2009BB5268)項目。

②重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科，重慶400016。